Summary
Denna metod beskriver användningen av R26R-Confetti (Confetti) musmodell för att studera mineraliserade vävnader, som täcker alla steg från avel strategi till bilden acquirements. Inkluderat är ett allmänt protokoll som kan appliceras på alla mjuka vävnader och ett modifierat protokoll som kan appliceras på mineraliserade vävnader.
Abstract
Märkning en enskild cell i kroppen för att övervaka vilka celltyper det kan ge upphov till och spåra dess migration genom organismen eller bestämma dess livslängd kan vara ett kraftfullt sätt att avslöja mekanismer för vävnad utveckling och underhåll. En av de viktigaste verktyg som för närvarande finns för att övervaka celler in vivo är Confetti musmodell. Konfetti-modellen kan användas för att genetiskt märka enskilda celler i levande möss med olika fluorescerande proteiner i ett cell typspecifikt sätt och övervaka deras öde, liksom ödet för deras avkomma över tiden, i en process som kallas klonsk genetisk spårning eller klonala linjen spårning. Denna modell har genererats för nästan ett decennium sedan och har bidragit till en förbättrad förståelse för många biologiska processer, särskilt relaterade till stamcellsbiologi, utveckling och förnyelse av vuxna vävnader. Men att bevara den fluorescerande signalen tills Bildinsamling och samtidig upptagning av olika fluorescerande signaler är tekniskt utmanande, särskilt för mineraliserad vävnad. Denna publikation beskriver ett steg-för-steg-protokoll för att använda Confetti-modellen för att analysera brosk av odlings plåt som kan appliceras på alla mineraliserade eller nonmineraliserade vävnader.
Introduction
Förbättrade metoder för att övervaka cellens beteende är önskvärt att öka experimentell effektivitet när man använder djurmodeller. En av de mest informativa metoder för att övervaka cellens beteende i vivo är klonala linjen spårning med Multicolor reporter mus stammar1, inklusive den utbredda R26R-konfetti (konfetti) mus2. Genom att genetiskt märka enskilda celler med fluorescerande proteiner och följa dessa celler över tid har forskare inom många områden använt konfetti-musen för att avslöja insikter i en mängd olika biologiska system.
Den Confetti Mouse är en loxP-baserade reporter system där CRE beroende DNA rekombination orsakar det permanenta uttrycket av en av flera möjliga fluorescerande proteiner i en stokastisk sätt2. Den R26R-Confetti allel innehåller ubiquitously uttryckt cagg promotor, som ligger omedelbart uppströms en loxP-flankerad NeoR-kassett2, vars polyadenylation sekvens avslutar transkription3, följt av Brainbow 2,1 konstruera4. Därav, CRE-medierad rekombination samtidigt exciserar NeoR-kassett och leder till produktion av vissa fluorescerande proteiner beroende på vilka delar av brainbow 2,1 konstruera är excised. Den här funktionen gör Confetti Mouse extremt anpassningsbar eftersom den kan användas för att rikta någon cellulär population i en mus för vilken en specifik CRE-stam finns tillgänglig. Passage av en vävnad-specifika CRE stam med R26R-konfetti stammen ger specificiteten av märkning. Emellertid, den CRE stammen bör också vara inducerbara (t. ex., CreERT eller CreERT2, som kräver tamoxifen bindning så att de kan komma in i kärnan och inducera DNA rekombination5) så att märkning kan uppnås vid angivna tidpunkter. Således kan en cellulär population märkas genom att injicera den resulterande CreERT-positiva/konfetti-positiva avkomma med tamoxifen vid önskad tidpunkt och spåras till en viss ålder, när vävnaderna av intresse kan samlas in för analys. Efter vävnads bearbetningen kan de fluorescerande cellerna direkt visualiseras genom konfokalmikroskopi så att avkomman från varje initialt märkt cell kan separeras från avkomman som genereras av någon annan märkt cell baserat på deras specifika fluorescerande på så sätt att klonaliteten kan bedömas (dvs. klon genetisk spårning).
På grund av konfettimodellens flexibilitet har det tillämpats för att studera utveckling och underhåll av många olika vävnader i hälsa och sjukdom2,6,7,8,9, 10,11. Ett vanligt sätt att använda modellen är att märka en viss population av celler och bestämma vilka vävnader de (och/eller deras avkomma) har bidragit till. En sådan slutsats att använda denna metod var att den vuxna tanden består av celler med en gliaceller ursprung6. En annan tillämpning av modellen är att studera stamcells homeostas. Konfetti-modellen avslöjade till exempel att stamcells nischer i tarm krypterna gradvis blir monoklonala eftersom vissa stamceller kloner dominerar underKonkurrensen mellan stamceller2. Modellen kan också användas för att bedöma cellproliferation, vilket är särskilt användbart för att studera långsamt skiljande celler. Till exempel, klon bildning i ledbrosk12 bedömdes, och de kortsiktiga effekterna av en igelkott antagonist på tillväxtplattan kondrocyter i fem veckor gamla möss studerades13.
Trots den relativa enkelheten i konfetti-modellen, kan den fluorescerande signalen vara tekniskt utmanande att bevara tills bild insamlingen, särskilt när man analyserar mineraliserade vävnader. Här beskriver protokollet en optimerad modell för att använda konfetti-musen med postnatal ben (upp till 6 månaders ålder), vilket gör det möjligt för fluorescerande proteiner att direkt visualiseras av konfokalmikroskopi utan behov av immunodetection. Detta förenklade protokoll kan appliceras på nonmineraliserade vävnader. Dessutom ingår en beskrivning av hur proverna ska förvaras för att bevara den fluorescerande signalen under en längre tid av minst 3 år. En översikt över protokollet presenteras i figur 1.
Protocol
Alla mus arbeten godkändes av etikkommittén för djurförsök (Stockholm North Committee/norra djurförsöksetiska Nämd) och genomfördes i enlighet med Djurläkemedels verkets bestämmelser och riktlinjer för djurförsök.
1. mus uppfödning
- För att generera stammen, korsa R26R-Confetti mus med CRE raden av intresse. Avväll pups vid 21 dagars ålder.
Obs: möss kan användas för avel från cirka 8 veckors ålder, eller enligt de lokala riktlinjerna. Genotypning (beskrivs inte här) kan utföras från biopsier som samlats vid avvänjning. Ålder vid avvänjning kan justeras enligt lokala riktlinjer.
2. konfetti märkning
Obs: denna märkning strategi är lämplig för tamoxifen inducerbara CRE stammar.
- Bered en lösning på upp till 2,5 mg/mL tamoxifen i majsolja i en glas flaska. Lös genom upphettning till 37 ° c i en ugn i upp till 60 min, omrörning var 5 min med en virvel tills pulvret har lösts upp.
Anmärkning: för ökade doser av tamoxifen, lösningar upp till 20 mg/mL kan förberedas med denna metod. - Förvaras vid 4 ° c i upp till 3 månader, skyddat från ljus.
- Inducera rekombination genom att administrera 50 μL av 2,5 mg/mL tamoxifen upplöst i majsolja intraperitonealt på den första postnatala dagen (P1).
Anmärkning: i princip kan tamoxifen administreras i alla åldrar, så tidigt som F1-generationen. Dosen av tamoxifen bör varieras baserat på CRE uttryck, mus ålder, och experimentell tillämpning. Mer information finns i diskussionsavsnittet. CRE negativa möss behandlas på samma sätt kan användas som en negativ kontroll för konfetti fluorescerande signaler.
FÖRSIKTIGHET: se till att djurhanterare varnas för tamoxifen användning och se till att bur material kasseras enligt lokala miljö-och säkerhetsriktlinjer.
3. vävnads insamling
- Euthanize möss på postnatal dag 27 (M27) genom att gradvis fylla utrymmet som innehåller möss med koldioxid upp till minst 80 volymprocent och bibehålla denna koncentration under 3 min. utför cervikal dislokation. Håll möss på is under dissektion av de andra djuren.
- Dissekera den vävnad av intresse. Nedan är ett protokoll för att samla in den proximala Tibia och distala femorala tillväxtplattor och ledbrosk i knäet, lämplig för postnatal möss upp till 6 månaders ålder.
- Ta bort huden runt bakbenen så långt som till fots, med hjälp av vassa saxar och tandade pincett.
- Grovt trimma muskler och fettvävnad från benen med vassa saxar.
Obs: Rengör inte benen perfekt, eftersom omgivande vävnader ger vissa strukturella stöd när snittning, men se till att all hud avlägsnas. - Med hjälp av en skalpell, skär genom den mjuka vävnaden där toppen av benet möter kroppen tills lårbenshuvudet är synlig, sedan klippa ligament i höftleden för att ta bort benet.
Obs: Alternativt, om det inte är möjligt att hitta lårbenshuvudet, skär genom lårbenet nära höften med stark sax. - Dissekera foten från resten av benet med hjälp av en skalpell eller vassa saxar.
4. vävnads fixering och-bearbetning
Obs: baserat på vävnaden av intresse, Följ en av de två protokoll som beskrivs nedan (4,1 för mjuk vävnad eller 4,2 för mineraliserad mus vävnader över en ålder av cirka 45 dagar, som beskrivs nedan). För båda metoderna, förvara dissekerade prover i 3,7% formaldehyd/fosfat buffrad saltlösning (PBS) på isen medan dissekera de återstående djuren.
- För mjuk vävnad och mineraliserad tibiaena och lårben upp till en ålder av cirka P45, fixera vävnaden i förtryckta 3,7% formaldehyd/PBS för 6 h, rullande försiktigt på en rotator vid 4 ° c. Använd en volym som är minst 10X större än vävnaden. Fortsätt direkt till steg 4,3.
- För mineraliserade vävnader, inklusive tibiaena och lårben över en ålder av cirka P45, krävs ett avalsningstesteg.
- Bered 1 L 10% EDTA/dH2O-lösning med pH-värdet justerat till 8,05 med natriumhydroxid. Späd sedan formaldehyden till 3,7% med denna lösning. EDTAS arbets koncentration kommer att vara 9%.
- Fixera vävnaden genom att placera i förhandskylda 3,7% formaldehyd/PBS över natten, försiktigt rullande på en rotator vid 4 ° c.
- Placera vävnaden i förhandskylda 3,7% formaldehyd/9% EDTA/DH2O lösning (pH 8,05) och rotera försiktigt vid 4 ° c i en volym som är minst 10X större än vävnaden. Upprepa detta steg genom att placera benen i färskt, förhandskylda 3,7% formaldehyd/9% EDTA/DH2O för 3x under nästa 48 h.
Anmärkning: denna korta urkalkning är tillräckligt för att möjliggöra snittning av lårbenet och Tibia ben av upp till 6 månader gamla möss. För mer tätt mineraliserade vävnader ytterligare dealcification kan krävas för att förbättra histologi.
- Överför vävnaden till förhandskylda 30% sackaros/DH2O. se till att fylla behållaren till brädden och rotera försiktigt över natten vid 4 ° c. Använd en volym som är minst 10X större än vävnaden. Vävnaden kommer ofta flyta när först placeras i denna lösning och sjunka till botten av flaskan på morgonen.
- För att ta bort kvarvarande sackaroslösning, tvätta snabbt vävnaden genom att ta bort den från sackaroslösning med pinpett och helt täcka provet med ca 5 ml optimal skärtemperatur förening (ULT) i flera sekunder.
- Fyll en förmärkt cryomold med OCT och placera vävnaden längst ner. Arbeta snabbt för att undvika att proverna sitter i rumstemperatur under alltför lång tid.
Observera: det är viktigt att placera provet i en praktisk orientering för snittnings steget. För att öka chanserna att snittning genom hela tillväxtplattan kolumner efter spårning med Col2CreERT: konfetti, placera den mediala sidan vänd nedåt med hjälp av lårbenshuvudet som en guide, och placera provet som platt till botten av mögel som möjligt. - Bädda in provet genom att placera formen på torris och väntar på ULT att helt stelna. Placera kryomåringar så platt som möjligt för att undvika förflyttning/glidande av vävnaden i mögel. När du är klar, förvara proverna vid-20 ° c, om de inte används omedelbart.
Obs: Använd inom 12 veckor, eftersom med åldern blocken blir svårare att avsnitt.
5. snittning
Obs: utför kryosektionering med en kryostat med engångsblad som lämpar sig för hård vävnad. Standard kryostat är lämplig.
- Ta bort blocket från mögel och säkra den till chucken genom att tillämpa OCT mellan toppen av blocket och chucken och kyla i kryostaten vid-20 ° c i minst 5 min, så att ULT har helt stelnat.
- Precool både provhållaren och bladhållaren till-20 ° c och placera sedan provet/chucken i chuckhållaren och bladet i bladhållaren för att jämvikt i flera minuter.
Obs: de specificerade temperaturerna kan varieras med flera grader beroende på kryostaten och vävnaden av intresse. - Använd kryostaten att trimma blocket och skära vävnad delar av en lämplig tjocklek för att möjliggöra visualisering av klonerna i vävnaden av intresse.
- För analys av postnatal tillväxt plåt, Förbered delar av 30 − 160 μm och samla dem på diabilder. Vissa kryostatmodeller får endast tillåta insamling av tjocka sektioner med trim-inställningen.
- Lufttorka vattenrutschkanorna i rumstemperatur tills de är helt torra.
Obs: varaktigheten av detta steg kan variera beroende på vävnads egenskaper och snittjocklek. Temperaturen i rummet är också sannolikt att påverka hastigheten på detta steg. - Förvara bilderna vid-20 ° c i upp till 36 månader, eller om bearbetningen ska ske omedelbart, gå vidare till steg 6,2.
6. Skjut preparering och montering
- Ta bort bilden från frysen och ta upp till rumstemperatur horisontellt i en bildhållare. Låt kondens avdunta.
- Ta bort ULT genom att använda en Pastavpipett för att försiktigt applicera PBS i rumstemperatur på bilden. Ju tjockare sektion, desto längre tid krävs. För 160 μm tjocka sektioner, utför två sköljmedel: Inkubera en gång i 15 min och ta bort vätskan, och sedan tillämpa färsk PBS i 5 min och ta bort vätskan.
Anmärkning: detta steg är att ta bort ULT och kan varieras baserat på vävnads egenskaper och snittjocklek, beroende på omständigheterna. Temperaturen i rummet kommer sannolikt att påverka hastigheten på detta steg. - Montera glidbanorna i en lösning på 75% 2, 2-tiodiethanol/dH2O vid rumstemperatur med 60 mm långa täcksteg.
Obs: diabilder kan förberedas omedelbart före bildtagning, men den fluorescerande signalen är stabil i 1 − 2 veckor om den hålls ut ur ljuset i en fuktad kammare vid 4 ° c.
7. avbildning av konfokalmikroskopi
- Ställ in mikroskopet.
- Slå på mikroskopet och öppna programvaran. Klicka på knappen Starta system .
- Välj kanalerna genom att först klicka på Smart setup under fliken förvärv och sedan välja de tre kanalerna som motsvarar rött fluorescerande protein (RFP), gult fluorescerande protein (yfp) och cyan fluorescerande protein (CFP) under Färgämnes rubrik. Klicka på bästa signalen sedan ansöka om att välja lasrar.
Obs: innehållet på fliken förvärv visas i tilläggsfil 1a. Om de nödvändiga kanalerna inte finns, Lägg till dem med hjälp av "+"-knappen under färg rubriken. Den information som behövs om laser, excitation våglängder, och utbudet av inspelade emissions våglängder visas för de tre konfetti fluorescerande proteiner i kompletterande fil 1b-D. - Välj mål objektivet 20x under rubriken mål på fliken anskaffnings läge .
- Lokalisera tillväxtplattan eller annan vävnad av intresse.
- För att ge en distinkt vy, Välj först RFP-kanalen genom att klicka på dess namn på fliken kanaler . Detta medför att information om RFP-kanalen visas på fliken ljus Sök väg . Klicka på kryssrutan bredvid T-PMT.
Obs: T-PMT kanal visar nonreflekterade laserljus, som används för att visualisera de icke-fluorescerande delar av vävnaden. - Placera bilden i bildhållaren och placera tillväxtplattan eller annan vävnad av intresse direkt mellan ljusbanan och objektivlinsen.
- För att förenkla lokalisering av vävnaden avmarkerar du kanalerna YFP och CFP med hjälp av kryssrutorna under rubriken spår på fliken kanaler .
- Välj T-PMT-kanalen genom att klicka på dess namn i spår rubriken. Klicka på Live på fliken förvärv och öka förstärkningen (Master) för T-PMT-kanalen för att visualisera vävnads sektionen på skärmen, som visas i gråskala.
- Flytta bildens position med hjälp av joysticken för att lokalisera området av intresse, sedan fokusera med hjälp av lämplig Mikroskop ratten.
- Klicka på stopp på fliken förvärv för att stänga av laser exponeringen.
- För att ge en distinkt vy, Välj först RFP-kanalen genom att klicka på dess namn på fliken kanaler . Detta medför att information om RFP-kanalen visas på fliken ljus Sök väg . Klicka på kryssrutan bredvid T-PMT.
- Definiera avbildnings parametrarna.
- Använd kryssrutorna på fliken kanaler för att välja en av kanalerna och klicka på Live på fliken förvärv för att visa bilden av kanalen på skärmen. Sedan, med hjälp av vänsterklick-knappen på musen, justera Skjut-staplar för att ställa in intervallet av utsläppt fluorescerande signal som samlas in, lasereffekt (skjutbar under lasrar rubrik), Gain (Master) och digital offset i Fliken kanaler för att visualisera konfetti-märkta celler på skärmen. Riktlinjevärden för alla dessa parametrar finns i tilläggsfilen 1b-D för RFP, yfp och CFP. Slutför det här steget för varje kanal, en efter en.
Obs: för att säkerställa att visualiserad signal inte är autofluorescence kan ett avsnitt från ett CRE-negativt djur användas som en negativ kontroll under detta steg. Eftersom T-PMT har kombinerats med RFP-lasern (steg 7.2.1) kommer en justering av lasereffekten för RFP att påverka T-PMT-signalen. - Justera hålstorleken för att vid behov öka fluorescensdetekteringen .
Obs: ju högre hålstorlek, desto mer fluorescerande signal detekteras i Z-riktningen. En riktlinje för detta är den resulterande luftiga enheten (AU), som automatiskt indikeras under Pinhole -indikatorn, där 1 au är optimalt för bildkvalitet. Öka AU för mycket kommer att försämra senare analys eftersom det blir svårare att urskilja enskilda celler i Z-riktning). - Kontrollera inställningarna för att säkerställa att de inspelade signalerna inte överlappar varandra.
- Klicka på kryssrutorna på fliken kanaler för att välja alla tre kanalerna och tryck på Snap -knappen på fliken förvärv .
- I den resulterande bilden bläddrar du mellan de kanaler som visas genom att klicka på de blå-markerade rutorna ovanför varje listad kanal på fliken dimensioner . Kontrollera manuellt om överlappningen mellan kanalerna på skärmen. Om signalerna överlappar (t. ex. om varje röd cell också är gul), gå tillbaka till början av steg 7,3 och upprepa, justera parametrarna för de överlappande kanalerna tills de kan särskiljas från varandra. Se till att minst en klon kan visualiseras för varje etikett (dvs RFP, YFP eller CFP) som bara innehåller en av etiketterna.
- Använd kryssrutorna på fliken kanaler för att välja en av kanalerna och klicka på Live på fliken förvärv för att visa bilden av kanalen på skärmen. Sedan, med hjälp av vänsterklick-knappen på musen, justera Skjut-staplar för att ställa in intervallet av utsläppt fluorescerande signal som samlas in, lasereffekt (skjutbar under lasrar rubrik), Gain (Master) och digital offset i Fliken kanaler för att visualisera konfetti-märkta celler på skärmen. Riktlinjevärden för alla dessa parametrar finns i tilläggsfilen 1b-D för RFP, yfp och CFP. Slutför det här steget för varje kanal, en efter en.
- Hämta bild.
- Välj den anskaffnings läge fliken för att ange bildkvalitet med hjälp av bildrutestorlek, hastighet, och medelvärdes tal värden.
Anmärkning: de typiska inställningarna för dessa experiment anges i kompletterande fil 1a. Om du minskar zoomningen under skanningsområdets rubrik på fliken förvärv kan du öka synfältet utan att ändra den tid som krävs för bild anskaffningen. - Klicka på kryssrutan Z-stack under rubriken Dimensions anskaffning på fliken förvärv . Öppna fliken z-stack för att ställa in intervallet mellan bilderna i z-riktningen till 2,5 μm.
- Om du vill ange rätt platser väljer du endast RFP/T-PMT på fliken kanaler och klickar på Live för att visualisera de röda klonerna med en synlig kontur av vävnaden. Ställ in det första och sista segmentet genom att klicka på Ange först och Ställ in sist på motsvarande segment, och justera fokus med hjälp av Mikroskop ratten.
- Klicka på fliken panel skanning på fliken förvärv och ange det totala antalet brickor i de vågräta och lodräta riktningarna i respektive ruta.
- För Bildinsamling, Välj alla önskade kanaler på fliken kanaler och klicka sedan på knappen Snap för att samla in en enda bild, eller Starta experiment knappen för att samla in en Z-stack/kakel skanning.
- Välj den anskaffnings läge fliken för att ange bildkvalitet med hjälp av bildrutestorlek, hastighet, och medelvärdes tal värden.
- När bilden har hämtats klickar du på Arkiv och spara sedan som och sparar bilden i en filtyp som bevarar så mycket information om mikroskopinställningarna som möjligt, för att senare kunna granska och återanvända.
- Utföra ytterligare analys med hjälp av bildanalysprogram.
Representative Results
För att märka chondrocyter i epiphyseal brosk och visualisera deras klon expansion med åldern med tamoxifen administration på P1, Col2CreERT: konfetti möss var märkta, och deras bakbenen samlades på M27. Den centrala delen bestämdes genom att visualisera korsbands (figur 2A) och kloner i den proximala Tibia tillväxtplattan visualiserades (figur 2b). Dessa data visar att enskilda celler som var Col2-positiva på P1 och blev märkta med konfetti fluorescerande proteiner när tamoxifen administrerades, genomgick klon expansion, och därefter förblev i tillväxtplattan tills M27. De initiala förändringarna i klon expansion från en liknande utvecklingstid punkt kan ses i figur 1 i en nyligen publikation13.
För att ge ett exempel på den fluorescerande signalen efter långtidslagring (steg 5,5) lagrades den insamlade sektionen omedelbart efter (se figur 2A, B) i mer än 3 år innan den bereddes och avbildades (figur 2C, video 1). .
För att påvisa några vanliga problem med protokollet visas ett avsnitt som bryts under kryosnittnings steget i figur 3a. Den region i sektionen (mellan tillväxtplattan och ledbrosk) expanderat i figur 3b visar att denna dos av tamoxifen leder till en så hög nivå av rekombination på detta område att det skulle utesluta klon analys.
Figur 1: experimentell översikt. Flödesschema som sammanfattar metodens nyckelstadier. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: konfetti bilder från en Col2CreERT: Confetti mus. Aprover på Col2CreERT: Konfettimöss bearbetades utan dealcifiering eller långtidslagring. Den centrala delen var placerad med hjälp av korsband som en markör. Denna bild visualiserades med hjälp av en bricka Skanna efter att upptäcka RFP med T-PMT (Scale bar = 300 μm). (B) klonala kolonner visas inom den proximala skenbenet av tillväxtplattan synlig i (a), efter 3D rekonstruktion. Cen intilliggande rutschkana till den som visasi a ochBsom förvaras i långtidsförvaring i mer än 3 år behandlades för avbildning och 3D-rekonstruktion. RFP, YFP och CFP visas i (B) och (C) (skalstreck = 50 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: utmaningar vid användning av metoden. (A) de vita streckade linjerna beskriver en uppdelning i sektionen genom tillväxtplattan på Col2CreERT: Konfettimöss (skalbar = 50 μm). Området i den vita rutan visas i (B) (skalstapel = 25 μm). RFP, YFP och CFP visas i båda panelerna, och den icke-reflekterade laserljus kanalen (T-PMT) visas också i (a) för att visualisera vävnaden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: tredimensionell rekonstruktion av en tillväxtplatta från Col2CreERT: Confetti Mouse. En bild som utarbetats från en Col2CreERT: Confetti mus hölls i långtidslagring efter snittning i mer än 3 år, och sedan bearbetas för avbildning. Tredimensionell rekonstruktion genomfördes automatiskt med bildanalysprogram och exporterades som en video. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Tilläggsfil 1: typisk uppsättning av konfokalmikroskopet. (A) de viktigaste kontrollerna som finns på fliken förvärv . (B−D) Laser parametrarna, magnetiseringen våglängd, och utbudet av inspelade utsläpps våglängder visas för tre konfetti fluorescerande proteiner. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Confetti-modellen användes flitigt för att studera mineraliserade broskvävnader12,13,14 och för att beskriva det optimerade protokollet. Konfetti möss2 med en kopia eller två kopior av R26R-Confetti allel kan användas för avel och experiment. Rekombination hos möss med en allel av Brainbow 2,1 konstruera kommer att ge fyra potentiella etiketter: rött fluorescerande protein (RFP, cytoplasmiska), gult fluorescerande protein (YFP, cytoplasmiska), cyan fluorescerande protein (CFP, membran-lokaliserad), och grön fluorescerande protein (GFP, Nucleus-lokaliserad), medan rekombination i homozygot konfetti möss (dvs, som innehåller två kopior av Brainbow 2,1 konstruera) kommer att ge 10 möjliga färg utgångar (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + CFP, RFP + GFP, YFP + YFP, YFP + CFP, YFP + GFP, CFP OCH CFP, GFP + GFP). Men eftersom DNA-excision och inversion händelser inträffar i en stokastisk sätt, rekombination för att producera GFP förekommer i endast en liten del av celler, som tidigare rapporterats2, och till synes skiljer sig från cell-typ eller CRE linje används2, 12,13. Därför, med tanke på den låga förekomsten av rekombination händelser som leder till GFP uttrycket, sex färg utgångar är de vanligaste i homozygot konfetti möss.
Ett viktigt övervägande när man planerar experiment med konfetti mus är att hitta en lämplig CRE stam. Först, eftersom Confetti allel har flera loxP platser, en rekombination händelse utesluter inte en andra4. Detta innebär att om en cell är märkt och delar för att producera en klon av en färg, en andra rekombination händelse i en av dess dotterceller skulle generera en annan färg, vilket döljer den sanna klon expansionen. Sålunda, noninducible CRE stammar, där enzymet är alltid aktiv om motsvarande Promotorn är aktiv, är inte tillrådligt. För det andra, i vissa stammar uttrycket av CRE driver ofta kommer på bekostnad av ett endogent protein, vilket skapar en fenotyp av sin egen (t. ex. för Prg4-GFPCreERT2 Knock-in mus stam där möss Harbor två CRE alleler15), så en enda kopia av CRE allel är önskvärt. I alla beskrivna experiment, en enda kopia av Col2CreERT16 bars av antingen hanen eller den kvinnliga föräldern att generera Col2CreERT: konfetti möss, som beskrivs13. Vidare är specificiteten hos CRE-linjen till celltypen av intresse en viktig faktor. Till exempel, Col2CreERT är Chondrocyte-specifika, men etiketter flera distinkta populationer av chondrocyter i tidigt postnatal brosk17. Slutligen kan aktiviteten hos olika CRE-stammar förändras avsevärt med djur åldern, eftersom Promotorns endogena aktivitet utnyttjas för förändringar i CRE-uttrycket, även i celler av samma typ (t. ex. Prg4-GFPCreERT2, som kan kräva en ökad antal tamoxifen doser för att märka ytliga zon celler som möss15år).
Antalet märkta celler kommer att återspeglas av mängden tamoxifen ges, så det är inte alltid önskvärt att ge den maximala dosen eftersom särskiljande kloner från varandra kan vara svårt. Eftersom CRE uttrycket kommer att variera under regleringen av olika initiativtagare samt med åldern, den tamoxifen doseringen måste justeras för att optimera märkning. Det är viktigt att notera att cellerna inte är omedelbart fluorescerande på utlösande rekombination eftersom tiden krävs för att rekombinationen ska inträffa och de resulterande fluorescerande proteiner att ackumuleras tillräckligt för avbildning. Ett brett spektrum av timmar (mellan 24 − 72 h) behövs, vilket verkar påverkas av CRE linje, cell-typ, och djur ålder. Eftersom tamoxifen kan vara biologiskt aktiv långt efter administrering18 det är alltid tillrådligt att grundligt kontrollera rekombination effektivitet i varje modell.
Under den konfokala mikroskopi steg, excitation av konfetti fluorescerande proteiner kräver penetration av vävnaden med laserljus. Eftersom olika vävnader har olika egenskaper, laserljus kan inte tränga 160 μm tjocka delar av alla vävnader. Sådana tjocka sektioner kan dock användas för brosk av odlings plåt, som används i figur 2, figur 3. Observera att varje Mikroskop är olika, och det är osannolikt att de beskrivna inställningarna (kompletterande fil 1) kommer att fungera perfekt utan smärre justeringar. En av de största utmaningarna är att särskilja de olika fluorescerande proteinerna för att säkerställa att det inte finns någon förorening från en kanal till en annan. Till exempel signalen i YFP-kanalen som orsakas av fluorescensen från GFP överlappar mellan YFP-och RFP-kanalerna. YFP-och CFP-kanalerna måste också kontrolleras noggrant. Detta kan göras på flera sätt. För det första kan utsläpps området för fluorescerande ljusvåglängder som registreras för varje fluorescerande protein begränsas. För det andra kan du optimera signalen genom att justera lasereffekten i kombination med den digitala förstärkningen. I denna studie var dessa steg tillräckliga, men de förlitar sig på en stark fluorescerande signal. Detta innebär att ineffektiv vävnads bearbetning i teorin kan minska aktiviteten hos fluorescerande proteiner, eller en svag laserljus källa kan försämra kanalseparation.
En av fördelarna med Confetti Mouse är att den kan kombineras med ett stort antal genetiskt muterade stammar som finns tillgängliga så att effekten av specifika gener på klonala dynamik kan studeras10,11,12 ,13,14,19,20, om än med vissa begränsningar. Till exempel kan rekombination av konfetti alleler och genen av intresse inte separeras när du använder CRE loxP-baserade mutanter kombinerat med klonala Lineage spårning. Icke desto mindre kan en sådan sammanblandning av återkombinationshändelser vara effektiv10,14,20. Till exempel, denna möjlighet användes för att utforska det ökade cellnumret i vilo zonen av möss efter postnatal Chondrocyte-specifik ablation av TSC1 i tillväxtplattan21 och avslöjade den klonala relationen mellan dessa celler över tid 13. Dessutom kan den vävnads-specifika klon analysen med konfetti-möss användas med icke-CRE loxP-baserade muterade möss11, och det är också möjligt att kombinera dessa metoder med farmakologiska8,9 ,13 och/eller kirurgiska modeller8 för att visualisera klonala svar på andra funktionella perturbations. Ytterligare möjligheter uppstår när man kombinerar konfetti märkta sektioner med immunodetection av endogena proteiner genom immunofluorescens. En sådan analys gör det möjligt att identifiera spårade celler och deras samlokalisering med en känd markör. Med den fixeringsmetod som beskrivs häri är det möjligt att genomföra immunofluorescens och ändå visualisera fluorescensen från konfetti fluorescerande proteiner12,13. I de nämnda tidningarna krävdes dock inte antigen hämtning. Stränga antigen hämtnings metoder, såsom kokning i citratbuffert, leder till en fullständig förlust av konfetti fluorescens. Även om konfetti fluorescerande proteiner kan sedan upptäckas med hjälp av antikroppar22, en förlust av klonala identitet kan inträffa.
Sammanfattnings, med hjälp av Confetti modellen till etikettceller in vivo är ett informativt verktyg för att analysera ödet för dessa celler över tiden. Den beskrivna metoden ger ett snabbt och effektivt sätt att direkt visualisera fluorescerande proteinuttryck i mineraliserade vävnader.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Evgeny Ivashkin för metodologisk rådgivning. Detta arbete stöddes ekonomiskt av Vetenskapsrådet (A. S. C), den ryska vetenskapliga stiftelsen (Grant #19-15-00241 till ASC), Karolinska Institutet (född), StratRegen KI och stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-årsfond (född), Stiftelsen Frimurare barnhuset och sallskapet Barnavard (P.T.N.), kinesiskt Stipendieråd (B.Z.). Det konfokala mikroskopet finansierades av Knut och Alice Wallenbergs stiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
References
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Proudfoot, N. J. Ending the message: poly(A) signals then and now. Genes & Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Füllgrabe, A., et al. Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis. Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).
- Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Yoo, Y. A., et al. The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer. Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).
- McConnell, A. M., et al. p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway. Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).
- Li, L., et al. Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice. Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).
- Newton, P. T., et al. A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate. Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, 25902 (2017).
- Kozhemyakina, E., et al. Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice. Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
- Reinert, R. B., et al. Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice. PloS One. 7 (3), 33529 (2012).
- Kim, I. S., et al. In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation. Development, Growth & Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).
- Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate. The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).
- Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., Sävendahl, L., Chagin, A. S. Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered. Bone Reports. 8, 64-71 (2018).
- Xie, M., et al. Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).
