Pankreasvävnad-härledda extracellulära matrix Bioink för utskrift 3D cell-lastat Pankreasvävnad konstruktioner
Summary
Decellularized extracellulära matrix (dECM) kan ge lämpliga mikromiljö signaler att recapitulate de inneboende funktionerna i målvävnaderna i en konstruerad konstruktion. Denna artikel belyser protokollen för decellularization av pankreasvävnad, utvärdering av pankreasvävnad-härledda dECM bioink, och generering av 3D pankreasvävnad konstruktioner med hjälp av en bioprinering teknik.
Abstract
Transplantation av pankreasöar är en lovande behandling för patienter som lider av typ 1-diabetes åtföljd av hypoglykemi och sekundära komplikationer. Men ö-transplantation har fortfarande flera begränsningar såsom den låga lönsamheten för transplanterade öar på grund av dålig ö-inympningar och fientliga miljöer. Dessutom har de insulinproducerande cellerna som skiljer sig från humana pluripotenta stamceller begränsad förmåga att utsöndra tillräckligt med hormoner som kan reglera blodsockernivån. Därför är det starkt nödvändigt att förbättra mogningen genom odling av celler med rätt mikromiljösignaler. I denna artikel, vi belysa protokoll för att förbereda en pankreasvävnad härledda decellularized extracellulära matrix (pdECM) bioink att ge en gynnsam mikromiljö som kan öka glukos känsligheten i bukspottskörteln öar, följt av beskriver processerna för att generera 3D-pankreasvävnad konstruktioner med hjälp av en microextrudering-baserade bioprinting teknik.
Introduction
Nyligen, bukspottskörteln ö-transplantation har ansetts vara en lovande behandling för patienter med typ 1-diabetes. Den relativa säkerheten och minimal invasivitet av förfarandet är stora fördelar med denna behandling1. Emellertid, det har flera begränsningar såsom den låga andelen framgångsrika isolerande öar och biverkningar av immunsuppressiva läkemedel. Dessutom minskar antalet inympade öar stadigt efter transplantation på grund av den fientliga miljön2. Olika biokompatibla material såsom alginat, kollagen, poly (mjölk-Co-glykolsyra) (PLGA) eller polyetylenglykol (PEG) har tillämpats på bukspottskörteln ö transplantation för att övervinna dessa svårigheter.
3D-cell tryckteknik växer fram i vävnadsteknik på grund av dess stora potential och hög prestanda. Självfallet är bioinks kända som viktiga komponenter för att tillhandahålla en lämplig mikromiljö och möjliggöra en förbättring av cellulära processer i tryckt vävnad konstruktioner. Ett stort antal skjuvningsförtunnande hydrogeler såsom fibrin, alginat och kollagen används ofta som bioinks. Emellertid, dessa material visar en brist på strukturell, kemisk, biologisk, och mekanisk komplexitet jämfört med den extracellulära matrisen (ECM) i infödda vävnad3. Mikromiljö ledtrådar som samspelet mellan kobbar och ECM är viktiga signaler för att förbättra funktionen av öar. Decellularized ECM (dECM) kan återskapa vävnads-specifika sammansättningen av olika ECM komponenter inklusive kollagen, glykosaminoglykaner (GAGs), och glykoproteiner. Till exempel, primära öar som behåller sina perifera ECMs (t. ex. typ I, III, IV, V, och VI kollagen, laminin, och fibronectin) uppvisar låg apoptos och bättre insulinkänslighet, vilket indikerar att vävnads-specifika cell-matris interaktioner är viktiga för att förbättra deras förmåga att fungera på samma sätt som original vävnad4.
I detta dokument, vi belysa protokoll för beredning av pankreasvävnad härledda decellularized extracellulära matrix (pdECM) bioink att ge nyttiga mikromiljö signaler för att öka aktiviteten och funktioner i bukspottskörteln öar, följt av processerna för att generera 3D-pankreasvävnad konstruktioner med hjälp av en microextrudering-baserade bioprinting teknik (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskrev utvecklingen av pdECM bioinks och tillverkning av 3D pankreasvävnad konstruktioner med hjälp av 3D-cell trycktekniker. Att recapitulate mikromiljön av målvävnaden i 3D-Engineered vävnad konstruera, valet av bioink är kritisk. I en tidigare studie, vi validerade att vävnads-specifika dECM bioinks är fördelaktigt att främja stamcells differentiering och proliferation10. Jämfört med syntetiska polymerer, dECM kan fungera som en cell-gynnsam miljö på grund av vä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av bio & medicinsk teknik utvecklingsprogram för National Research Foundation (NRF) som finansieras av den koreanska regeringen (MSIT) (2017M3A9C6032067) och “IKT Consilience Creative program” (IITP-2019-2011-1-00783) övervakas av IITP (Institute for information & planering av kommunikationsteknik & utvärdering).
Materials
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing?. Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
