Summary
La matrice extracellulaire décellularisée (DECM) peut fournir des indices microenvironnementaux appropriés pour récapituler les fonctions inhérentes des tissus cibles dans une construction machinée. Cet article élucide les protocoles pour la décellularisation du tissu pancréatique, l'évaluation du bioink dECM pancréatique de tissu-dérivé, et la génération des constructions pancréatiques 3D de tissu utilisant une technique de bioimpression.
Abstract
La transplantation d'îlots pancréatiques est un traitement prometteur pour les patients qui souffrent de diabète de type 1 accompagnés d'hypoglycémie et de complications secondaires. Cependant, la transplantation d'îlots a encore plusieurs limitations telles que la faible viabilité des îlots transplantés en raison de l'engraftment pauvre d'îlot et des environnements hostiles. En outre, les cellules productrices d'insuline différenciées des cellules souches pluripotentes humaines ont une capacité limitée de sécrétiser suffisamment d'hormones qui peuvent réguler le niveau de glucose sanguin; par conséquent, l'amélioration de la maturation en cculturant des cellules avec des indices microenvironnementaux appropriés est fortement nécessaire. Dans cet article, nous élucidons des protocoles pour préparer un bioink de matrice extracellulaire décellularized de tissu pancréatique (pdECM) pour fournir un microenvironnement salutaire qui peut augmenter la sensibilité de glucose des îlots pancréatiques, suivi en décrivant les processus pour produire le tissu pancréatique 3D construit utilisant une technique de bioimpression basée sur la microextrusion.
Introduction
Récemment, la transplantation pancréatique d'îlot a été considérée un traitement prometteur pour des patients présentant le diabète de type 1. La sécurité relative et l'invasivité minimale de la procédure sont de grands avantages de ce traitement1. Cependant, il a plusieurs limitations telles que le faible taux de réussite des îlots isolants et les effets secondaires des médicaments immunosuppresseurs. En outre, le nombre d'îlots greffés diminue régulièrement après la transplantation en raison de l'environnement hostile2. Divers matériaux biocompatibles tels que l'alginate, le collagène, le poly (acide co-glycolique lactique) (PLGA) ou le polyéthylène glycol (PEG) ont été appliqués à la transplantation pancréatique d'îlot pour surmonter ces difficultés.
La technologie d'impression de cellules 3D est en train d'émerger dans l'ingénierie tissulaire en raison de son grand potentiel et de ses performances élevées. Inutile de dire que les bioinks sont connus comme des composants importants pour fournir un microenvironnement approprié et permettre l'amélioration des processus cellulaires dans les constructions de tissus imprimés. Un nombre substantiel d'hydrogels de cisaillement tels que la fibrine, l'alginate, et le collagène sont employés couramment comme bioinks. Cependant, ces matériaux montrent un manque de complexité structurale, chimique, biologique et mécanique par rapport à la matrice extracellulaire (ECM) dans le tissu indigène3. Les indices microenvironnementaux tels que les interactions entre les îlots et l'ECM sont des signaux importants pour améliorer la fonction des îlots. L'ECM décellularisé (DECM) peut recréer la composition tissulaire spécifique de divers composants d'ECM comprenant le collagène, les glycosaminoglycans (GAGs), et les glycoprotéines. Par exemple, les îlots primaires qui conservent leurs ECM périphériques (p. ex., type I, III, collagène IV, V et VI, lamininin et fibronectin) présentent une faible apoptose et une meilleure sensibilité à l'insuline, ce qui indique que les interactions cellulaires-matricespécifiques spécifiques aux tissus sont importantes pour améliorer leur capacité à fonctionner de la même façon que le tissu original4.
Dans cet article, nous élucidons des protocoles pour la préparation du bioink de matrice extracellulaire décellularisé dérivé du tissu pancréatique (pdECM) pour fournir des indices microenvironnementaux bénéfiques pour stimuler l'activité et les fonctions des îlots pancréatiques, suivis par les processus pour générer des constructions de tissu pancréatique 3D utilisant une technique de bioimpression à base de microextrusion (Figure 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Des tissus pancréatiques porcins ont été recueillis dans un abattoir local. Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Centre médical Asan, Séoul, Corée.
1. Décellularisation des tissus
- Préparer les solutions pour la décellularisation.
REMARQUE : La saline 1x tamponnée de phosphate (PBS) utilisée dans toutes les préparations de solution est diluée en ajoutant de l'eau distillée à 10 x PBS.- Pour la solution 1% Triton-X 100, dissoudre 100 mL de solution 100% Triton-X 100 en 900 mL de 1x PBS à l'aide d'une barre magnétique avec l'agitation à 150 tr/min pour 6 h. Faire 400 mL de 1% Triton-X 100 solution avec 40 mL de 10% Triton-X 100 solution et 360 mL de 1x 1x PBS préparé juste avant l'utilisation.
REMARQUE : La solution Triton-X 100 à 10 % peut être conservée à température ambiante jusqu'à ce que nécessaire. - Pour la solution d'acide peracétique de 0,1 %, diluer 8,5 ml d'acide peracétique de 4,7 % en 22,8 ml d'éthanol à 70 % avec 368,7 ml d'eau distillée juste avant utilisation.
- Pour la solution 1% Triton-X 100, dissoudre 100 mL de solution 100% Triton-X 100 en 900 mL de 1x PBS à l'aide d'une barre magnétique avec l'agitation à 150 tr/min pour 6 h. Faire 400 mL de 1% Triton-X 100 solution avec 40 mL de 10% Triton-X 100 solution et 360 mL de 1x 1x PBS préparé juste avant l'utilisation.
- Enlever les tissus périphériques du pancréas et trancher le tissu avant la décellularisation.
- Laver le pancréas porcin réséqué avec de l'eau courante du robinet et enlever les tissus périphériques à l'aide de ciseaux stérilisés.
- Transférer le pancréas dans un sac en plastique avec des forceps et congeler à -80 oC pendant 1 h pour aider à couper le pancréas efficacement pour l'étape suivante.
- Trancher le pancréas congelé en morceaux de 1 mm d'épaisseur à l'aide d'une râpe.
- Transférer 50 g de tissu tranché dans un contenant en plastique de 500 ml.
REMARQUE : Un récipient en plastique avec un couvercle est recommandé ici pour protéger des tissus de la contamination et empêcher l'évaporation de solution.
- Traitement avec réactifs.
REMARQUE : L'ensemble du processus de décellularisation doit être effectué à 4 oC sur un shaker orbital numérique à 150 tr/min. Dans toutes les étapes de décellularisation, le détachement physique utilisant des forceps est nécessaire pour empêcher les tranches du pancréas de coller ensemble. Le lavage du récipient avec de l'eau distillée est nécessaire pour enlever complètement les réactifs résiduels dans le récipient.- Avant tout traitement de réactif, laver 50 g de pancréas tranché avec 300 ml d'eau distillée à l'aide d'un shaker.
- Remuer le tissu en continu à 150 tr/min jusqu'à ce que l'eau trouble disparaisse (après environ 12 h). Remplacer l'eau distillée toutes les 2 h.
REMARQUE : Il est recommandé de changer l'eau distillée toutes les heures pour qu'il soit efficace d'éliminer l'eau trouble plus rapidement. - Jeter l'eau et traiter les 50 g de tissus avec 400 ml de 1% Triton-X 100 en 1x PBS solution pour 84 h. Rafraîchir la solution tous les 12 h.
REMARQUE : À ce stade, la quantité de tissu diminuera parce que les composants cellulaires commencent à être enlevés. - Traiter avec 400 ml d'isopropanol (IPA) pendant 2 h pour enlever le reste de la graisse du pancréas.
REMARQUE: Il est normal que le tissu devienne difficile en raison de l'élimination de la graisse dans ce processus. - Après 2 h, retirer l'IPA et laver le tissu avec 400 ml de 1x PBS pendant 24 h. Rafraîchir le 1x PBS tous les 12 h.
- Pour stériliser le tissu décellularisé, jetez la solution précédente et traitez avec 400 ml d'acide peracétique de 0,1 % dans 4 % d'éthanol pendant 2 h.
- Pour enlever le détergent résiduel, laver le tissu avec 400 ml de 1x PBS pendant 6 h. Rafraîchir la solution tous les 2 h.
- Recueillir les tissus décellularisés dans un tube conique de 50 ml avec des forceps.
- Congeler l'échantillon à -80 oC pendant 1 h. Couvrir le tube conique d'une lingette sans peluches au lieu du couvercle et fixer avec un élastique pour une lyophilisation efficace.
- Lyophiliser le tissu décellularisé à -50 oC pour 4 d.
REMARQUE : Pour l'étape 1,3, 1 g de tissu non décellularisé doit également être lyophilisé dans les mêmes conditions.
2. Évaluation des tissus décellulaires
REMARQUE : Pour évaluer la quantité résiduelle de dsDNA, de glycosaminoglycane (GAGs), et de collagène dans le tissu décellularisé comparé au tissu indigène, au moins 1 g de chacun de chacun du tissu non-décellularisé (tissu indigène) et du tissu décellularisé sont exigés pour un série d'évaluations. La quantité de dsDNA, de GAGs, et de collagène peut être calculée basée sur le poids sec du tissu.
- Préparer des solutions pour les essais biochimiques.
- Préparer la solution de papain pour la digestion d'échantillon.
REMARQUE : La quantité de mémoire tampon à faire peut être ajustée en fonction du nombre d'échantillons.- Dissoudre 119 mg de 0,1 M de phosphate de sodium (monobasic), 18,6 mg de 0,5 mM Na2-EDTA, et 8,8 mg de cystéine-HCl de 5 mM dans 10 ml d'eau autoclaved.
- Ajuster le pH de la solution à 6,5 en ajoutant 10 M NaOH solution.
- Ajouter 125 'L de 10 mg/mL de solution de stock de papain à la solution ci-dessus et le vortex, permettant à chaque élément de se mélanger uniformément.
- Préparer des solutions pour l'état d'œil bleu diméthylène (DMMB).
- Pour faire le colorant DMMB, dissoudre 8 mg de 1,9-diméthyl-méthylène bleu chlorure de zinc double sel, 1,52 g de glycine, et 1,185 g de NaCl dans 500 ml d'eau autoclaved. Ajustez le pH à 3 en ajoutant une solution HCl de 0,5 M tout en mesurant le changement de pH à l'aide d'un pH mètre de banc. Ensuite, filtrez-le à l'eau à l'eau à l'eau de 500 ml.
- Faire 15 'L de 10 mg/mL de sulfate de chondroïtine Une solution pour la norme.
- Préparer des solutions pour l'hydroxyproline.
- Pour la solution de travail de chloramine, dissoudre 2,4 g d'acétate de sodium, 1 g d'acide citrique et 0,68 g d'hydroxyde de sodium dans 24 ml d'eau distillée et ajouter 240 l d'acide acétique glaciaire, 10 l de toluène et 6 ml d'IPA.
REMARQUE : Dissoudre toutes les poudres en solution à l'aide d'un mélangeur à vortex. La solution de travail à la chloramine peut être stockée à 4 oC pendant une période pouvant aller jusqu'à trois mois. - Pour la solution de chloramine T, dissoudre 0,35 g de chloramine T dans 20 ml de chloramine solution de travail et ajouter 2,5 mL d'IPA. Vortex pour mélanger tous les composants.
REMARQUE : Préparer immédiatement avant l'utilisation. - Pour la solution P-DAB, mettre 3,75 g de P-DAB dans 6,5 ml d'acide perchlorique et 15 ml d'IPA; enveloppez-le dans du papier d'aluminium.
REMARQUE : Préparer immédiatement avant l'utilisation.
- Pour la solution de travail de chloramine, dissoudre 2,4 g d'acétate de sodium, 1 g d'acide citrique et 0,68 g d'hydroxyde de sodium dans 24 ml d'eau distillée et ajouter 240 l d'acide acétique glaciaire, 10 l de toluène et 6 ml d'IPA.
- Préparer la solution de papain pour la digestion d'échantillon.
- Ajouter 1 mL de solution de papaïne à 10 mg de tissu lyophilisé dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml et vortex le tube pour mieux digérer l'échantillon.
- Placer le tube microcentrifuge de 1,5 ml dans un support en caoutchouc et digérer les échantillons dans un bécher de 500 ml qui contient 300 ml d'eau à 60 oC pendant 16 h.
- Centrifugeuse à 9 500 x g pendant 20 min, collecte zetle le supernatant et transférez-le dans un nouveau tube.
- Quantifier l'ADN résiduel et les protéines majeures dans le tissu décellularisé.
- Chargez 1 l d'échantillon digéré dans le spectromètre et mesurez la quantité de dsDNA selon les instructions du fabricant.
REMARQUE : L'expérimentateur doit attacher ses cheveux en arrière et porter un masque pour éviter de contaminer l'échantillon.
- Chargez 1 l d'échantillon digéré dans le spectromètre et mesurez la quantité de dsDNA selon les instructions du fabricant.
- Effectuez un analyse DMMB pour quantifier la quantité de GAGs qui reste dans le tissu décellularisé.
- Mélanger 1 l de sulfate de chondroïtine Une solution et 499 oL de 1x PBS pour établir des normes. Diluer le sulfate de chondroïtine Une solution avec de l'eau distillée à des concentrations de 0, 4, 8, 12, 16 et 20 g/mL.
- Chargez les tripliques de 50 oL de chaque concentration des échantillons standard et digérés dans une plaque de 96 puits.
- Ajouter 200 l de colorant DMMB à chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal.
- Immédiatement lire l'absorption à 525 nm sur un lecteur de microplaque.
- Effectuez un étopto -sàxyproline pour quantifier la quantité de collagène.
- Pour effectuer un étosay hydroxyproline, incubez 250 l d'échantillon digéré avec des volumes égaux de HCl à 120 oC pendant 16 h.
- Sécher les résidus à température ambiante pendant 3 h pour refroidir les échantillons, puis les dissoudre à nouveau dans 1 ml de 1 x PBS.
- Centrifugeuse à 2 400 x g pendant 10 min à 4 oC.
- Préparer une solution hydroxyproline de 100 g/mL en standard.
- Solution hydroxyproline diluée avec de l'eau distillée à une concentration de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 g/mL pour une solution standard.
- Chargez les tripliques de 50 l d'échantillons et la solution standard dans une assiette de 96 puits.
- Ajouter 50 l de chloramine T, puis couver pendant 20 min à température ambiante.
- Ajouter 50 oL de solution p-DAB et incuber pendant 30 min à 60 oC.
REMARQUE: Aliquot dans une pièce sombre. Après l'ajout, envelopper la plaque de papier d'aluminium. - Incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Après refroidissement, mesurer l'absorption à 540 nm sur un lecteur de microplaques.
3. Préparation Bioink
REMARQUE : la poudre de pdECM peut être stockée de façon stable à -80 oC pendant au moins un an. Avant l'ajustement du pH, la solution pdECM digérée peut être stockée à -20 oC pendant un mois. Avant d'utiliser, décongeler l'échantillon de la solution pdECM congelée à 4 oC pendant la nuit. La solution pdECM ajustée en pH peut être stockée à 4 oC pendant une semaine. La solution pdECM digérée peut être stockée à 4 oC pendant au moins quelques jours, mais ne doit pas dépasser 1 semaine.
- Digler le pdECM lyophilisé avec de la pepsine.
- Pour une digestion efficace du bioink, pulvériser le pdECM lyophilisé avec de l'azote liquide à l'aide d'un mortier et d'un pilon.
- Recueillir 200 mg de la poudre de pdECM dans le tube conique de 50 ml et ajouter 20 mg de pepsine et 8,4 ml de l'acide acétique de 0,5 M (la concentration finale est de 2 w/v%).
- Placer la barre magnétique dans le tube conique de 50 ml et remuer à 300 tr/min pendant 96 h.
- Ajuster le pH de la solution pdECM digérée.
REMARQUE : Afin d'éviter la gélation avant l'ajustement du pH, ce processus doit être effectué sur la glace.- Filtrer les particules non digérées dans la solution pdECM à l'aide d'une passoire à cellules de 40 m à l'aide d'une pipette de déplacement positive sur la glace pour obtenir la digestion optimale des pièces.
- Ajouter 1 ml du 10x PBS et le vortex avant d'utiliser NaOH.
- Ajuster le pH à 7 avec 10 M NaOH vérifier le pH avec des bandes d'indicateur de pH.
REMARQUE : Vortex chaque fois que NaOH est ajouté de sorte que le bioink soit complètement mélangé avec les autres réactifs.
4. Analyse rhéologique
- Configuration expérimentale
- Préparer le 1,5 % (w/v) de bioink pdECM pour évaluer les propriétés rhéologiques.
- Établir une géométrie de plaque de cône de 20 mm (diamètre de cône de 20 mm avec un angle de 2 degrés) en mode de rhéomètre contrôlé par la vitesse.
- Créez des séquences expérimentales dans le logiciel installé (TRIOS) pour mesurer la viscosité, la généticique de la gélation et le modulus dynamique du bioink pdECM.
- Viscosité : Placez le bioink pdECM sur l'assiette. Mesurer la viscosité complexe (Pa-s) du bioink pdECM sous un taux de cisaillement croissant de 1 à 1 000 s-1 à une température constante de 15 oC.
- Généticisation de gel : Placer le bioink pdECM sur l'assiette. Calculez le modulus complexe (G) en mesurant le modulus de stockage et de perte du bioink pdECM à 4-37 oC avec un taux d'augmentation incrémentielle de 5 oC/min (mode de balayage temporel).
- Modulus dynamique : Placer le bioink pdECM sur la plaque à 37 oC pendant 60 min avant la mesure. Mesurer le modulus de stockage dépendant de la fréquence (G') et le modulus de perte (G'') du bioink pdECM dans la gamme de 0.1-100 rad/s à 2% de contrainte.
5. L'impression 3D de cellules du tissu pancréatique construit utilisant l'islet
- Préparation d'îlots isolés
- Isoler les îlots primaires d'un rat selon les protocoles décrits dans un travail précédent5.
- Pour séparer les débris et les cellules mortes de l'înt isolé, passez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 m. Les îlots d'un diamètre inférieur à 70 m sont considérés comme morts ou anormaux.
- Suspendre les îlots isolés dans le milieu RPMI-1640 et les placer sur le plat de pétri. Enlever les îlots de plus de 300 m de diamètre à l'aide d'une pipette à volume P200 sous le microscope (objectif 4x objectif) dans l'armoire de biosécurité.
- Encapsulation d'islet dans le bioink de pdECM
- Préparer pH ajusté pdECM bioink et islet isolé.
REMARQUE : Pour éviter la gélation avant l'ajustement du pH, ce processus doit être effectué sur la glace. - Mélanger délicatement le bioink pdECM et le support suspendu avec des îlots (ratio 3:1) à l'aide d'une pipette de déplacement positive jusqu'à consistance homogène.
REMARQUE : La concentration finale du bioink de pdECM est 1.5% et la densité de cellules dans le bioink de pdECM est 3.000 IEQ/mL.
- Préparer pH ajusté pdECM bioink et islet isolé.
- L'impression 3D de cellules des constructions pancréatiques de tissu
- Préparer une seringue stérilisée et une buse de 22 G.
REMARQUE : Cette jauge a été sélectionnée pour l'impression d'îlots d'un diamètre de 100 à 250 m. - Chargez le bioink pdECM chargé d'înet dans la seringue.
- Imprimez le bioink avec l'état d'impression optimisé (taux d'alimentation : 150 mm/min; pression pneumatique : 15 kPa) à 18 oC sous la forme d'un treillis.
- Pour croiser le bioink, placez la construction imprimée dans l'incubateur pendant 30 min.
- Immerger la construction imprimée dans le milieu de culture d'îtal qui est RPMI-1640 milieu complété avec 10% de sérum bovin foetal (FBS), 100 U/mL pénicilline et 100 U/mL streptomycine.
- Préparer une seringue stérilisée et une buse de 22 G.
6. Impression 3D de cellules de construction pancréatique avec la structure modelée
- Préparation de deux types de bioink
- Pour valider la polyvalence d'impression à l'aide de plusieurs bioinks, préparez deux ensembles de bioinks pdECM et les tacle zetent en ajoutant 0,4% trypan Blue et Rose Bengal solution dans chaque bioink pdECM à un rapport de 1:20, respectivement.
REMARQUE : Pour éviter la gélation avant l'ajustement du pH, ce processus doit être effectué sur la glace. - Mélanger délicatement le bioink pdECM et le support suspendu avec des îlots (ratio 3:1) à l'aide d'une pipette de déplacement positive jusqu'à consistance homogène.
REMARQUE : La concentration finale du bioink de pdECM est 1.5% et la densité de cellules dans le bioink de pdECM est 3.000 IEQ/mL.
- Pour valider la polyvalence d'impression à l'aide de plusieurs bioinks, préparez deux ensembles de bioinks pdECM et les tacle zetent en ajoutant 0,4% trypan Blue et Rose Bengal solution dans chaque bioink pdECM à un rapport de 1:20, respectivement.
- L'impression 3D de cellules des constructions de tissu pancréatique multimatériau-basées
- Préparer des seringues stérilisées et une buse de 25 G.
- Chargez chaque bioink (bleu et rouge) en deux seringues différentes, respectivement.
- Imprimez le bioink avec une condition d'impression optimisée (taux d'alimentation : 150 mm/min; pression pneumatique : 15 kPa) à 18 oC sous forme de treillis avec des lignes alternées de bleu et de rouge.
- Pour croiser le bioink, placez la construction imprimée dans l'incubateur pendant 30 min.
- Immerger la construction imprimée dans le milieu de culture d'îtal qui est RPMI-1640 moyen complété avec 10% de sérum bovin foetal (FBS), 100 U/mL pénicilline et 100 U/mL streptomycine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Décellularisation des tissus pancréatiques
Nous avons mis au point le processus de préparation du bioink pdECM afin de fournir des microenvironnements pancréatiques spécifiques aux tissus pour améliorer la fonctionnalité des îlots dans une construction de tissus bioimprimés en 3D (Figure 2A). Après le processus de décellularisation, 97,3 % de l'ADNc a été enlevé et les composants représentatifs de l'ECM tels que le collagène et les GAG sont demeurés à 1278,1 % et 96,9 % comparativement à ceux du tissu pancréatique indigène, respectivement (figure 2B).
Préparation Bioink
Pour appliquer le pdECM dans le processus d'impression, la poudre de pdECM a été solubilisée dans l'acide faible avec la pepsine et neutralisée utilisant la solution de 10 M NaOH. La solution pdECM digérée pourrait alors être diluée par le mélange avec un milieu de culture cellulaire ou 1x PBS. Dans cette étude, nous avons préparé le bioink de pdECM à une concentration finale de 1.5% pour davantage d'étude. Le bioink pdECM a maintenu une phase de solution lorsqu'il a été placé sous température ambiante et instantanément converti en une phase de gel après l'incubation à 37 oC pendant 30 min. Pour étudier l'effet du bioink pdECM sur les îlots, des îlots isolés ont été encapsulés dans les bioinks pdECM, alginate et collagène à une concentration de 1,5%. Le résultat de l'essai de sécrétion d'insuline glucose-stimulé a montré des îlots dans le bioink de pdECM ont représenté l'index le plus élevé (approximativement 3.174) parmi les groupes expérimentaux, indiquant la fonctionnalité plus élevée au-dessus des hydrogels largement appliqués pour l'encapsulation d'îlots5.
Analyse rhéologique
La viscosité est l'une des caractéristiques essentielles lors de l'examen d'un biomatériau imprimable. Nous avons mesuré la viscosité du bioink pdECM à une fréquence allant de 1 à 1000 Hz à 15 oC pour l'impression de divers bioinks dECM6,7,8. Le bioink pdECM a montré un comportement d'éclaircissage du cisaillement et la valeur était d'environ 10 Pa au taux de cisaillement de 1/s, ce qui indique que le bioink pdECM avait des caractéristiques rhéologiques appropriées pour l'extrusion par une buse (Figure 3A). La cinétique de gélation à une température allant de 4 à 37 oC a indiqué le comportement de gélification du bioink pdECM à des températures physiologiquement pertinentes. Le modulus complexe a commencé à augmenter lorsque la température a atteint 15 oC, et il a augmenté rapidement lorsque la température a été maintenue à 37 oC, ce qui indique la transition sol-gel du bioink pdECM (figure 3B). Les g et G dynamiques de bioink pdECM ont été étudiés à des températures physiologiquement pertinentes pour assurer sa stabilité après le processus d'impression, ce qui a entraîné un modulus stable dans l'état de balayage de fréquence (figure 3C).
Impression de cellules 3D
Des constructions de tissu pancréatique chargées de cellules 3D ont été fabriquées en utilisant un processus d'impression à base de microextrusion. Pour construire une construction contenant au moins 3 000 équivalents d'îlet (IEQ), qui correspond au volume tissulaire d'un îcre parfaitement sphérique d'un diamètre de 150 m9,nous avons conçu la construction avec une dimension de 10 mm x 10 mm x 3 mm(figure 4A). Les paramètres et conditions du processus d'impression des îlots pancréatiques ont été choisis pour encapsuler les îlots, qui sont de grands amas cellulaires de tailles allant de 100 à 250 m de diamètre(figure 4B). À l'aide d'un système d'impression multi-têtes, divers types de constructions 3D, comme la forme du treillis ayant d'autres lignes de bleu et de rouge, ont été fabriqués à l'aide du pdECM développé(figure 4C),indiquant la polyvalence du pdECM aux fins de la bioimpression 3D afin d'harmoniser deux ou plusieurs types de cellules vivantes dans un arrangement ressemblant à un tissu.
Figure 1 : Schématique du développement du tissu pancréatique décellularisé, évaluation du bioink de pdECM et fabrication des constructions pancréatiques de tissu 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images représentatives du processus de décellularisation et de la caractérisation biochimique du pdECM. (A) Aperçu de la décellularisation du tissu pancréatique porcin. (B) Résultats des essais biochimiques des tissus indigènes et du pdECM. Les barres d'erreur montrent l'écart standard. Copyright (2019) The Royal Society of Chemistry5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse rhéologique du bioink pdECM. (A) Viscosité des bioinks de pdECM et de collagène qui ont exhibé le comportement d'amincissement de cisaillement. (B) Génétics de génétication de pdECM et de bioinks de collagène pendant le changement de température. (C) Le modulus complexe de pdECM et de bioinks de collagène. Copyright (2019) de la Royal Society of Chemistry5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Impression de cellules 3D du bioink pdECM chargé de cellules pour les constructions de tissu pancréatique 3D. (A) Les dimensions du tissu pancréatique 3D se construit. (B) Pancréatique islet-chargé et (C) tissu pancréatique multimatériau-basé construit. Copyright (2019) de la Royal Society of Chemistry5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole a décrit le développement des bioinks de pdECM et la fabrication des constructions pancréatiques 3D de tissu en utilisant des techniques d'impression de cellules 3D. Pour récapituler le microenvironnement du tissu cible dans la construction de tissu machiné 3D, le choix du bioink est critique. Dans une étude précédente, nous avons validé que les bioinks dECM spécifiques aux tissus sont bénéfiques pour favoriser la différenciation et la prolifération des cellules souches10. Par rapport aux polymères synthétiques, dECM peut servir d'environnement favorable aux cellules en raison de la composition spécifique aux tissus et de l'architecture11. Par conséquent, le processus de décellularisation devrait être sérieusement considéré pour la rétention élevée des composants principaux dans le dECM.
La sélection de différents détergents pour la décellularisation du tissu pancréatique varie le constituant résiduel eCM12. Dans le processus de décellularisation, nous avons remarqué que l'utilisation de sulfate de dodécyl de sodium (SDS) peut affecter la perte des protéines ECM13. Ainsi, nous avons modifié notre protocole précédent en éliminant l'étape pour le traitement de la solution SDS, qui est un surfactant ionique utilisé dans de nombreux processus de nettoyage et de décellularisation présentant des caractéristiques relativement dures par rapport aux autres comme Trion-X 100, ou 3-[(3-cholamidopropyl) diméthyle-lammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS). Dans ce protocole, nous avons utilisé 1% Triton-X 100 solution pour 84 h au lieu de la solution SDS, qui a été en mesure d'enlever les composants cellulaires efficacement tout en préservant les GAG et les protéines collagènes. En outre, nous avons noté que l'élimination des lipides résiduels par le traitement par IPA est également un processus très crucial pour induire le crosslinking de bioink pdECM et il peut être compris dans le même contexte qu'un article précédemment publié4. Le traitement avec la solution peracétique d'acide a été également appliqué pour la stérilisation du tissu décellularisé. En outre, l'enlèvement des détergents et des produits chimiques restants dans le tissu décellularisé est une étape cruciale pour empêcher la réponse inflammatoire d'hôte. Cependant, nous n'avons pas discuté de cette question dans ce protocole. Les protocoles qui incluent un processus d'assainissement à la fin de la décellularisation amélioreront la biocompatibilité du matériel décellularisé. De plus, des normes pour les critères d'évaluation devraient être prises en considération pour s'assurer que les détergents et les produits chimiques sont complètement éliminés.
La digestion du bioink de pdECM avec la pepsine a été exécutée pour réaliser le mélange homogène de poudre de pdECM dans la solution acide par le clivage de la région de telopeptide dans la protéine collagène. Dans le processus d'ajustement du pH, il est essentiel de garder le bioink pdECM sur la glace pour la préservation de la gélation. Par la suite, nous pouvons produire des bioinks pdECM prégel physiquement croisés qui peuvent entrer dans un état de gel en couvant à 37 oC, ce qui est l'un des principaux avantages des bioinks à base de dECM. La sélection de la bonne concentration du bioink pdECM est également importante10. Un bioink idéal devrait protéger les cellules contre les dommages externes qui se produisent pendant le processus d'impression tels que la pression pneumatique et le changement de température. On sait que la force de cisaillement appliquée peut endommager les cellules et réduire la viabilité des cellules dans les constructions imprimées10. En outre, l'amélioration des concentrations de bioink pourrait induire la mort cellulaire5. En revanche, de faibles concentrations de bioink induit une faible viscosité, ce qui signifie une faible imprimabilité et une faible fidélité à la forme pendant l'impression. Il est nécessaire de vérifier la viscosité du bioink et d'optimiser sa concentration.
Actuellement, les chercheurs étudient activement le développement de divers types de bioinks dérivés de tissus pour l'impression de tissus 3Dconstruits 14,15,16. Les résultats de ces études indiquent que le bioink pourrait fournir des microenvironnements spécifiques aux tissus pour les cellules. Ces conditions uniques peuvent favoriser la différenciation ou la maturation des cellules souches et la prolifération des cellules. En outre, l'utilisation du système d'impression cellulaire 3D multi-têtes permet d'imprimer plusieurs types de bioinks avec une grande précision simultanément. En utilisant cette technique, une structure avec un motif spécifique peut être produite, montrant ainsi la polyvalence de conception. En outre, il est possible d'encapsuler différents types de cellules dans chaque bioink pour imiter l'arrangement cellulaire indigène17. Ces structures modelées peuvent être utilisées dans l'induction de la vascularisation ou de l'effet de co-culture en améliorant les interactions cellule-cellule, qui peuvent être des facteurs clés dans la survie à long terme des cellules spécifiques18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Cette recherche a été appuyée par le programme de développement des technologies bio et médicales de la National Research Foundation (NRF) financé par le gouvernement coréen (MSIT) (2017M3A9C6032067) et le « ICT Consilience Creative Program » (IITP-2019-2011-1-00783) supervisé par l'IITP (Institute for Information and Communications Technology Planning and Evaluation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
