Summary
세포외 세포외 매트릭스(dECM)는 엔지니어링된 구조에서 표적 조직의 고유 기능을 재량화하기 위한 적절한 미세 환경 단서를 제공할 수 있습니다. 이 기사는 췌장 조직의 탈세포화, 췌장 조직 유래 dECM 바이오 잉크의 평가 및 생체 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구성의 생성을위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
췌도의 이식은 저혈당증 및 이차 합병증을 동반한 타입-1 당뇨병 때문에 손해를 입는 환자를 위한 유망한 처리입니다. 그러나, 섬 이식은 여전히 가난한 섬 생착 및 적대적인 환경으로 인해 이식 된 작은 섬의 낮은 생존가능성과 같은 몇 가지 제한사항이 있습니다. 또한, 인간 만능 줄기세포로부터 분화된 인슐린 생성 세포는 혈당 수준을 조절할 수 있는 충분한 호르몬을 분비하는 능력이 제한되어 있다; 따라서 적절한 미세 환경 단서로 세포를 배양하여 성숙을 개선하는 것이 매우 필요합니다. 이 기사에서는 췌도의 포도당 민감도를 증가시킬 수있는 유익한 미세 환경을 제공하기 위해 췌장 조직 유래 탈세포화 세포 질매트릭스 (pdECM) bioink를 준비하기위한 프로토콜을 설명하고 설명합니다. 3D 췌장 조직 생성 과정은 마이크로 압출 기반의 바이오 프린팅 기술을 사용하여 구성됩니다.
Introduction
최근 췌도 이식은 제1형 당뇨병 환자에게 유망한 치료법으로 여겨지고 있다. 절차의 상대적 안전성과 최소 침습성은이 치료의 큰장점입니다 1. 그러나, 그것은 고립 된 섬과 면역 억제 약물의 부작용의 낮은 성공률과 같은 몇 가지 한계가 있다. 더욱이, 적대적인 환경으로 인해 이식 후 이식 후 이식된 작은 섬의 수는 꾸준히 감소한다2. 이러한 어려움을 극복하기 위해 알긴산, 콜라겐, 폴리(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 다양한 생체 적합성 물질이 췌도 이식에 적용되어 왔다.
3D 세포 프린팅 기술은 큰 잠재력과 높은 성능으로 인해 조직 공학에서 부상하고 있습니다. 말할 필요도 없이, bioinks는 인쇄된 조직 구조물에 있는 세포 프로세스의 개선을 가능하게 하는 적당한 미세 환경을 제공하고 가능하게 하기 위한 중요한 분대로 알려져 있습니다. 피브린, 알긴산 및 콜라겐과 같은 전단 숱이 많은 하이드로겔은 바이오잉크로 널리 사용됩니다. 그러나, 이들 물질은 네이티브 조직에서 세포외 매트릭스(ECM)에 비해 구조적, 화학적, 생물학적, 및 기계적 복잡성의 부족을 보여준다3. 섬과 ECM 사이의 상호 작용과 같은 미세 환경 큐는 섬의 기능을 향상시키기위한 중요한 신호입니다. 탈세포화된 ECM(dECM)은 콜라겐, 글리코사미노글리칸(GAGs) 및 당단백질을 포함한 다양한 ECM 성분의 조직 특이적 조성물을 재현할 수 있다. 예를 들어, 그들의 말초 적혈구(예를 들어, 타입 I, III, IV, V, 및 VI 콜라겐, 라미닌 및 섬유넥틴)를 유지하는 원발성 섬은 낮은 세포자멸 및 더 나은 인슐린 감수성을 나타내며, 따라서 조직 특이적 세포-매트릭스 상호작용이 원래 조직과 유사하게 기능하는 능력을 향상시키는 데 중요하다는 것을 나타낸다4.
이 논문에서, 우리는 췌장 췌도의 활동 과 기능을 증폭하기위한 유익한 미세 환경 단서를 제공하기 위해 췌장 조직 유래 탈세포 질성 세포 간 매트릭스 (pdECM) bioink를 준비하기위한 프로토콜을 해명하고, 마이크로 압출 기반의 생체 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구조를 생성하는 과정을 수행합니다(그림 1).
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Protocol
돼지 췌장 조직은 지역 도축장에서 수집되었다. 동물실험은 한국서울병원 동물보호위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 조직 탈세포화
- 탈세포화를 위한 솔루션을 준비합니다.
참고: 모든 용액 제제에 사용되는 1x 인산염 완충식염수(PBS)는 증류수를 10x PBS에 첨가하여 희석됩니다.- 1% Triton-X 100 용액의 경우, 100% 트리톤-X 100 용액의 100mL를 100% 트리톤-X 100 용액을 100% 트리톤-X 100 용액의 100mL을 100mL의 100mL용으로 용해하여 150rpm의 자석 교반 바를 사용하여 100mL의 100mL를 100% 트리톤-X 100 mL의 100mL 및 10% 트리톤-X 100mL의 40mL로 100mL, 100% 트리톤-X 100mL용으로 100mL, 100mL의 트리톤-X 100mL용을 100mL로 용해 PBS는 사용하기 직전에 준비되었습니다.
참고 : 10 % Triton-X 100 용액은 필요할 때까지 실온에서 보관 할 수 있습니다. - 0.1% 퍼라세산 용액의 경우, 사용 직전에 증류수 368.7 mL로 70% 에탄올의 22.8 mL로 4.7% peracetic acid의 8.5 mL를 희석하십시오.
- 1% Triton-X 100 용액의 경우, 100% 트리톤-X 100 용액의 100mL를 100% 트리톤-X 100 용액을 100% 트리톤-X 100 용액의 100mL을 100mL의 100mL용으로 용해하여 150rpm의 자석 교반 바를 사용하여 100mL의 100mL를 100% 트리톤-X 100 mL의 100mL 및 10% 트리톤-X 100mL의 40mL로 100mL, 100% 트리톤-X 100mL용으로 100mL, 100mL의 트리톤-X 100mL용을 100mL로 용해 PBS는 사용하기 직전에 준비되었습니다.
- 췌장의 말초 조직을 제거하고 탈세포화 전에 조직을 슬라이스하십시오.
- 용해 된 돼지 췌장을 흐르는 수돗물로 씻고 멸균 된 가위를 사용하여 주변 조직을 제거하십시오.
- 췌장을 집게가 있는 비닐 봉지에 옮기고 다음 단계를 위해 췌장을 효과적으로 자르도록 1시간 동안 -80°C에서 동결합니다.
- 냉동 된 췌장을 강판을 사용하여 1mm 두께의 조각으로 자릅니다.
- 슬라이스 된 조직 50g을 500 mL 플라스틱 용기에 옮긴다.
참고: 조직을 오염으로부터 보호하고 용액 증발을 방지하기 위해 뚜껑이 있는 플라스틱 용기가 권장됩니다.
- 시약으로 치료.
참고: 전체 탈세포화 과정은 150rpm에서 디지털 궤도 셰이커에서 4°C에서 수행되어야 합니다. 모든 탈세포화 단계에서, 집게를 이용한 물리적 분리는 췌장의 조각이 서로 달라붙는 것을 막기 위해 요구된다. 용기에 잔류 시약을 완전히 제거하려면 증류수로 용기를 세척할 필요가 있습니다.- 시약 처리 전에 셰이커를 사용하여 300 mL의 증류수로 얇게 썬 췌장 50g을 씻으소서.
- 흐린 물이 사라질 때까지 150rpm에서 조직을 계속 저어줍니다 (약 12 시간 후). 2시간마다 증류수를 교체하십시오.
참고: 효율성을 위해 매시간 증류수를 교체하여 흐린 물을 더 빨리 제거하는 것이 좋습니다. - 물을 버리고 1x PBS 용액에 1% 트리톤-X 100의 400 mL로 50g의 조직을 84 시간 동안 치료하십시오.
참고 : 이 시점에서 세포 성분이 제거되기 시작하기 때문에 조직의 양이 감소합니다. - 400 mL의 이소프로판올 (IPA)으로 치료하여 2 시간 동안 췌장에서 남은 지방을 제거하십시오.
참고 : 이 과정에서 지방제거로 인해 조직이 단단해지는 것은 정상입니다. - 2시간 후, IPA를 제거하고 24시간 동안 1x PBS의 400 mL로 티슈를 세척합니다.
- 탈세포조직을 살균하기 위해, 이전 용액을 버리고 400 mL의 0.1 % peracetic acid를 4 % 에탄올에서 2 시간 동안 치료하십시오.
- 잔류 세제를 제거하려면 400 mL의 1x PBS로 6 시간 동안 조직을 씻으소서 2 시간마다 용액을 새로 고칩니다.
- 집게와 50 mL 원추형 튜브에서 탈세포 조직을 수집합니다.
- 샘플을 -80°C에서 1시간 동안 동결시키고 뚜껑 대신 보풀이 없는 물티슈로 원엽 튜브를 덮고 효율적인 동결 건조를 위해 고무 밴드로 고정합니다.
- 4 d에 대한 -50 °C에서 탈세포화된 조직을 동구우성화시켰다.
참고 : 1.3 단계의 경우, 비 세포화 된 조직 1 g도 동일한 조건에서 동결 건조되어야합니다.
2. 탈세포조직의 평가
참고: dsDNA, 글리코사미노글리칸(GAGs) 및 콜라겐의 잔류량을 네이티브 조직과 비교하여 탈세포화된 조직에서 평가하기 위해, 각각의 비세포화 조직(기본 조직) 및 탈세포화된 조직의 적어도 1g이 필요합니다. 일괄 평가. dsDNA, GAGs 및 콜라겐의 양은 조직의 건조 중량에 기초하여 계산될 수 있다.
- 생화학 분석을 위한 해결책을 준비하십시오.
- 샘플 소화를 위한 파파인 용액을 준비합니다.
참고: 만들 버퍼의 양은 샘플 수에 따라 조정할 수 있습니다.- 119 mg의 용해 0.1 M M 나트륨 인산염 (모노 베이직), 18.6 mg의 0.5 mM Na2-EDTA, 8.8 mg의 5 mM 시스테인-HCl의 10 mL의 오토 클레이브 워터.
- 10 M NaOH 용액을 추가하여 용액의 pH를 6.5로 조정합니다.
- 위의 용액과 소용돌이에 10 mg/mL 파페인 스톡 솔루션 125 μL을 추가하여 각 요소가 고르게 혼합될 수 있도록 합니다.
- 디메틸 메틸렌 블루(DMMB) 분석법을 위한 용액을 준비합니다.
- DMMB 염료를 만들려면, 8 mg의 1,9-디메틸-메틸렌 블루 염화물 이중 소금, 글리신 1.52 g, 그리고 500 mL의 오토클레이브 워터에 NaCl 1.185 g을 녹입니다. 벤치탑 pH 측정기를 사용하여 pH의 변화를 측정하면서 0.5 M HCl 용액을 추가하여 pH를 3으로 조정합니다. 그런 다음 500 mL 병 상단 진공 필터를 통해 이를 필터링합니다.
- 15 μL의 10 mg/mL 콘드로이틴 황산염 용액을 표준용으로 만드세요.
- 하이드록시프롤린 분석법을 위한 솔루션을 준비합니다.
- 클로라민 작동 용액의 경우, 아세테이트 나트륨 2.4 g, 구연산 1 g, 수산화 나트륨 0.68 g을 증류수 24 mL에 용해하고 빙하 아세트산 240 μL, 톨루엔 10 μL 및 IPA 6 mL을 첨가합니다.
참고: 와류 믹서를 사용하여 용액에 있는 모든 분말을 용해시다. 클로라민 작업 용액은 최대 3 개월 동안 4 °C에서 보관할 수 있습니다. - 클로라민 T 용액의 경우, 클로라민 가공 용액 20 mL에 0.35 g의 클로라민 T를 용해시키고 2.5 mL의 IPA를 추가하십시오. 모든 구성 요소를 혼합하는 소용돌이.
참고: 사용하기 직전에 준비하십시오. - P-DAB 용액의 경우, 3.75 g의 P-DAB를 6.5 mL의 과염산과 15 mL의 IPA에 넣습니다. 알루미늄 호일에 싸서.
참고: 사용하기 직전에 준비하십시오.
- 클로라민 작동 용액의 경우, 아세테이트 나트륨 2.4 g, 구연산 1 g, 수산화 나트륨 0.68 g을 증류수 24 mL에 용해하고 빙하 아세트산 240 μL, 톨루엔 10 μL 및 IPA 6 mL을 첨가합니다.
- 샘플 소화를 위한 파파인 용액을 준비합니다.
- 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 10 mg의 용서 구성 조직에 파파인 용액 1 mL을 추가하고 튜브를 소용돌이로 하여 샘플을 더 잘 소화시십시오.
- 1.5 mL 미세 원심 분리튜브를 고무 랙에 놓고 16 시간 동안 60 °C에서 300 mL의 물을 포함하는 500 mL 비커에서 샘플을 소화합니다.
- 20 분 동안 9,500 x g의 원심 분리기를 수집하고 상류를 수집하고 새 튜브로 옮긴다.
- 탈세포화된 조직에서 잔류 DNA 및 주요 단백질을 정량화합니다.
- 소화된 시료 1μL을 분광계에 적재하고 제조업체의 지침에 따라 dsDNA의 양을 측정합니다.
참고: 실험자는 시료를 오염하지 않도록 머리를 다시 묶고 마스크를 착용해야 합니다.
- 소화된 시료 1μL을 분광계에 적재하고 제조업체의 지침에 따라 dsDNA의 양을 측정합니다.
- DMMB 분석을 수행하여 탈세포화된 조직에 남아 있는 GGs의 양을 정량화합니다.
- 콘드로이틴 황산염 A 용액 1 μL과 1x PBS 499 μL을 혼합하여 표준을 만듭니다. 콘드로이틴 황산염 A 용액을 0, 4, 8, 12, 16 및 20 μg/mL의 농도로 증류수로 희석합니다.
- 표준 및 소화된 시료의 각 농도당 50 μL의 삼중량을 96웰 플레이트에 로드합니다.
- 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에 DMMB 염료 200 μL을 추가합니다.
- 즉시 마이크로 플레이트 리더에 525 nm에서 흡광도를 읽습니다.
- 하이드록시프롤린 분석기를 수행하여 콜라겐의 양을 정량화합니다.
- 하이드록시프롤린 분석결과를 수행하기 위해, 16시간 동안 120°C에서 동일한 부피의 HCl로 250 μL의 소화된 시료를 배양한다.
- 샘플을 냉각하기 위해 실온에서 잔류물을 3시간 동안 건조한 다음 샘플을 1mL의 1mL에서 다시 용해시도록 합니다.
- 2,400 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 100 μg/mL 하이드록시프롤린 솔루션을 표준으로 준비합니다.
- 표준 용액을 위해 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL의 농도로 증류수로 하이드록시프롤린 용액을 희석하십시오.
- 50 μL의 샘플 및 표준 용액을 96웰 플레이트에 적재하십시오.
- 클로라민 T 용액 50 μL을 넣고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
- p-DAB 용액 50 μL을 넣고 60°C에서 30분 동안 배양합니다.
참고 : 어두운 방에서 알리 쿼트. 첨가 후, 알루미늄 호일로 플레이트를 감쌉다. - 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 냉각 후, 마이크로플레이트 리더에서 540 nm에서 흡광도를 측정합니다.
3. 바이오 잉크 준비
참고: pdECM 분말은 적어도 1년 동안 -80°C에서 안정적으로 보관할 수 있다. pH 조정 전에, 소화된 pdECM 용액을 -20°C에서 1개월 동안 저장할 수 있다. 사용하기 전에, 밤새 4°C에서 냉동 pdECM 용액의 샘플을 해동한다. pH 조절 pdECM 용액은 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있다. 소화된 pdECM 용액은 적어도 며칠 동안 4°C에서 보관될 수 있으나 1주를 초과해서는 안 된다.
- 동결 건조 된 pdECM을 펩신으로 소화시킵니다.
- 바이오 잉크의 효과적인 소화를 위해, 모르타르와 유봉을 사용하여 액체 질소로 동독 pdECM을 분쇄하십시오.
- 50 mL 원엽 튜브에 pdECM 분말 200 mg을 수집하고 펩신 20 mg과 0.5 M 아세트산 8.4 mL을 추가합니다 (최종 농도는 2 w / v %).
- 자기 교반 막대를 50 mL 원추형 튜브에 넣고 96 시간 동안 300 rpm에서 저어줍니다.
- 소화된 pdECM 용액의 pH를 조정합니다.
참고 : pH 조정 전에 겔화를 피하기 위해이 과정은 얼음에서 수행되어야합니다.- 얼음에 양성 변위 파이펫을 사용하여 40 μm 세포 스트레이너를 사용하여 pdECM 용액에서 소화되지 않은 입자를 걸레로 걸트리하여 부품의 최적의 소화를 얻습니다.
- NaOH를 사용하기 전에 10x PBS 및 소용돌이의 1 mL을 추가합니다.
- pH 를 pH 표시기 스트립으로 pH를 검사하는 10 M NaOH로 pH를 7로 조정합니다.
참고 : 바이오 잉크가 다른 시약과 철저히 혼합되도록 NaOH가 첨가 될 때마다 소용돌이.
4. 유변학 분석
- 실험 설정
- 유변학적 특성을 평가하기 위해 pdECM 바이오잉크의 1.5%(w/v)를 준비한다.
- 레오미터의 속도 제어 모드에서 20mm 콘 플레이트 형상(2°각도의 원뿔 직경 20mm)을 설정합니다.
- 설치된 소프트웨어(TRIOS)에서 실험 시퀀스를 생성하여 pdECM 바이오잉크의 점도, 겔화 역학 및 동적 계수를 측정합니다.
- 점도: 판에 pdECM 바이오잉크를 놓습니다. 15°C의 일정한 온도에서 1~1,000s-1의 전단 속도를 증가시켜 pdECM 바이오잉크의 복합 점도(Pa·s)를 측정합니다.
- 겔화 역학: 판에 pdECM 바이오잉크를 놓습니다. 4-37°C에서 pdECM 바이오잉크의 저장 및 손실 계수를 측정하여 5°C/min(시간 스윕 모드)의 증분 증가율을 측정하여 복잡한 계수(G*)를 계산합니다.
- 동적 계수: pdECM 바이오잉크를 측정 전 60분 동안 37°C에서 플레이트에 놓습니다. 2% 스트레인에서 0.1-100 rad/s의 범위에서 pdECM 바이오잉크의 주파수 의존적 저장 계수(G') 및 손실 계수(G'')를 측정합니다.
5. 췌도를 사용하여 췌장 조직 구조의 3D 세포 인쇄
- 고립 된 섬의 준비
- 전작5에기재된 프로토콜에 따라 쥐로부터 1차 섬을 분리한다.
- 분리된 아일렛으로부터 파편과 죽은 세포를 분리하려면 70 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. 직경이 70 μm보다 작은 섬은 죽었거나 비정상으로 간주됩니다.
- RPMI-1640 매체에 고립 된 섬을 일시 중단하고 페트리 접시에 놓습니다. 생물 안전성 캐비닛에서 현미경(4x 대물 렌즈)에서 P200 볼륨 파이펫을 사용하여 직경 300 μm보다 큰 섬을 제거합니다.
- pdECM 바이오 잉크로 의 아일렛 캡슐화
- pH 조절 된 pdECM 바이오 잉크 및 단리 된 아일렛을 준비합니다.
참고 : pH 조정 전에 겔화를 피하려면이 과정을 얼음에서 수행해야합니다. - pdECM 바이오잉크와 매염액(비율 3:1)을 균일하게 혼합할 때까지 양수 변위 파이펫을 사용하여 부드럽게 혼합한다.
참고: pdECM 바이오잉크의 최종 농도는 1.5%이고 pdECM 바이오잉크의 세포 밀도는 3,000 IEQ/mL이다.
- pH 조절 된 pdECM 바이오 잉크 및 단리 된 아일렛을 준비합니다.
- 췌장 조직 구조의 3D 세포 인쇄
- 멸균 된 주사기와 22G 노즐을 준비하십시오.
참고: 이 게이지는 직경이 100-250 μm인 작은 섬을 인쇄하기 위해 선택되었습니다. - 주사기에 하중 아일렛 라덴 pdECM 바이오 잉크.
- 격자 모양으로 18°C에서 최적화된 인쇄 조건(이송 속도: 150mm/min; 공압 압력: 15 kPa)으로 바이오잉크를 인쇄합니다.
- 바이오잉크를 교차 연결하려면 인쇄된 구슬을 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
- 10% 태아 소 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 U/mL 스트렙토미신을 보충한 RPMI-1640 배지인 아일레 배양 매체에 인쇄된 구성물을 담급감.
- 멸균 된 주사기와 22G 노즐을 준비하십시오.
6. 패턴 구조의 췌장 구조의 3D 세포 인쇄
- 바이오 잉크의 두 가지 유형의 제조
- 여러 개의 바이오잉크를 사용하여 인쇄 의 다양성을 검증하기 위해, pdECM 바이오 잉크 2 세트를 준비하고 각각 1:20의 비율로 각 pdECM 바이오 잉크에 0.4 % Trypan Blue 및 Rose 벵골 용액을 추가하여 얼룩을 지습니다.
참고 : pH 조정 전에 겔화를 피하려면이 과정을 얼음에서 수행해야합니다. - pdECM 바이오잉크와 매염액(비율 3:1)을 균일하게 혼합할 때까지 양수 변위 파이펫을 사용하여 부드럽게 혼합한다.
참고: pdECM 바이오잉크의 최종 농도는 1.5%이고 pdECM 바이오잉크의 세포 밀도는 3,000 IEQ/mL이다.
- 여러 개의 바이오잉크를 사용하여 인쇄 의 다양성을 검증하기 위해, pdECM 바이오 잉크 2 세트를 준비하고 각각 1:20의 비율로 각 pdECM 바이오 잉크에 0.4 % Trypan Blue 및 Rose 벵골 용액을 추가하여 얼룩을 지습니다.
- 다물질 계 췌장 조직 구조의 3D 세포 인쇄
- 멸균 된 주사기와 25G 노즐을 준비하십시오.
- 각 바이오잉크(파란색과 빨간색)를 각각 두 개의 서로 다른 주사기에 로드합니다.
- 최적화된 인쇄 조건(이송 속도: 150mm/min; 공압 압력: 15 kPa)을 파란색과 빨간색의 교대선으로 격자 모양으로 18°C에서 인쇄합니다.
- 바이오잉크를 교차 연결하려면 인쇄된 구슬을 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
- 10% 태아 소 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 U/mL 스트렙토미신을 보충한 RPMI-1640 배지인 아일레 배양 매체에 인쇄된 구성물을 담급감.
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Representative Results
췌장 조직의 세포화
우리는 3D 생체 인쇄 조직 구조에서 췌도의 기능을 향상시키기위한 췌장 조직 특이적 미세 환경을 제공하기 위해 pdECM bioink를 준비하는 과정을 개발했습니다(그림 2A). 탈세포화 과정 후, dsDNA의 97.3%가 제거되었고 콜라겐 및 GAGs와 같은 대표적인 ECM 성분은 각각 원어민 췌장 조직에 비해 1278.1% 및 96.9%로 유지되었다(도2B).
바이오잉크 제제
프린팅 공정에 pdECM을 적용하기 위해, pdECM 분말을 펩신으로 약한 산으로 용해시키고 10 M NaOH 용액을 사용하여 중화시켰다. 소화된 pdECM 용액은 세포 배양 배지 또는 1x PBS와 혼합하여 희석될 수 있었다. 본 연구에서, 우리는 추가 연구를 위해 1.5%의 최종 농도로 pdECM 바이오잉크를 준비하였다. pdECM 바이오잉크는 실온 하에 놓고 37°C에서 30분 동안 배양 후 즉시 겔상으로 전환되었을 때 용액 상을 유지하였다. 아일즈에 대한 pdECM 바이오잉크의 효과를 조사하기 위해, 단리된 섬은 1.5%의 농도로 pdECM, 알긴산 및 콜라겐 바이오잉크에 캡슐화하였다. 포도당 자극인슐린 분비 시험의 결과는 pdECM 바이오잉크에서 아일렛이 실험군 중 가장 높은 지수(약 3.174)를 나타내며, 아일렛캡슐화에대해 널리 적용된 하이드로겔에 비해 더 높은 기능을 나타낸다.
유변학 분석
점도는 인쇄 가능한 생체 물질을 고려할 때 중요한 특성 중 하나입니다. 우리는 다양한 dECM 바이오 잉크6, 7,8을인쇄하기 위해 15 °C에서 1 ~ 1,000 Hz의 주파수에서 pdECM 바이오 잉크의 점도를측정했습니다. PDECM 바이오잉크는 전단 숱이 거동을 나타내고 그 값은 1/s의 전단 속도에서 약 10Pa·s였으며, pdECM 바이오잉크는 노즐을 통한 압출에 대한 적절한 유변학적 특성을 가졌다는 것을나타낸다(도 3A). 4~37°C 범위의 온도에서 겔화 역학은 생리학적으로 관련된 온도에서 pdECM 바이오잉크의 겔화 거동을 나타냈다. 복잡한 계수는 온도가 15°C에 도달했을 때 증가하기 시작했고, 온도가 37°C에서 유지되었을 때 급격히 증가하여 pdECM 바이오잉크의 졸겔 전이를나타낸다(도 3B). pdECM 바이오잉크의 동적 G'와 G"는 인쇄 공정 후 의 안정성을 보장하기 위해 생리학적으로 관련된 온도에서 조사되었고, 그 결과 주파수 스윕 조건 하에서 안정적인 계수를 갖는 결과를 초래하였다(도3C).
3D 셀 인쇄
3D 세포-라덴 췌장 조직 구조는 미세 압출 기반 인쇄 공정을 사용하여 제조되었다. 직경 150 μm9의완벽하게 구형 아일렛의 조직 부피에 해당하는 3,000 개의 아일렛 등가물 (IEQ)을 포함하는 구성을 구축하기 위해 10mm x 10mm x 3mm의 치수로 구성을 설계했습니다(그림 4A). 췌도 인쇄를 위한 공정 파라미터 및 조건은 직경 100-250 μm에 이르는 크기의 큰 셀룰러 클러스터인 섬을 캡슐화하기 위해 선택되었다(도4B). 다중 헤드 프린팅 시스템을 사용하여, 청색과 적색의 대체 라인을 갖는 격자의 형상과 같은 다양한 유형의 3D 구성물-개발된 pdECM(도4C)을이용하여 제작하였으며, 3D 바이오프린팅을 목적으로 하는 pdECM의 다기능성을 나타내는 조직형 배열로 2종 이상의 살아있는 세포를 조화시켰다.
그림 1: 탈세포화 췌장 조직의 개발의 회로도, pdECM 바이오잉크의 평가 및 3D 췌장 조직 구조의 제조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: PDECM의 탈세포화 과정 및 생화학적 특성의 대표적인 이미지. (A)돼지 췌장 조직의 탈세포화 개요. (B)네이티브 조직 및 pdECM의 생화학 적 분석을 결과. 오류 막대는 표준 편차를 표시합니다. 저작권 (2019) 화학왕립학회5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: pdECM 바이오잉크의 유변학적 분석. (a)전단 숱이 거동을 나타낸 pdECM 및 콜라겐 바이오잉크의 점도. (B)pdECM및 콜라겐 바이오 잉크의 겔화 역학은 온도 변화 시. (C)가교 pdECM 및 콜라겐 바이오 잉크의 복잡한 계수. 저작권 (2019) 화학 왕립 학회5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 3D 췌장 조직 구성을 위한 세포-라덴 pdECM 바이오잉크의 3D 세포 프린팅. (A)3D 췌장 조직의 치수가 구성됩니다. (B)췌도 -라덴 및(C)다중 물질 계 3D 췌장 조직 구성. 저작권 (2019) 화학 왕립 학회5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 pdECM 바이오 잉크의 개발및 3D 세포 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구성의 제조를 설명했다. 3D 엔지니어링 조직 구성에서 표적 조직의 미세 환경을 재환기시키기 위해 bioink의 선택은 매우 중요합니다. 이전 연구에서, 우리는 조직 특이적 dECM 바이오잉크가 줄기세포 분화 및 증식을 촉진하는 데 유익하다는 것을검증했다 10. 합성 중합체에 비해, dECM은 조직 특이적 조성물 및아키텍처(11)때문에 세포 유리한 환경으로서 작용할 수 있다. 따라서, 탈세포화 과정은 dECM에서 주요 성분의 높은 체류를 진지하게 고려되어야 한다.
췌장 조직의 탈세포화를 위한 상이한 세제의 선택은 잔류 ECM성분(12)을변화시다. 탈세포화 과정에서, 우리는 나트륨 도데실 황산염 (SDS)의 사용이 ECM 단백질(13)의손실에 영향을 미칠 수 있음을 발견했다. 따라서, 우리는 트리온-X 100, 또는 3-[(3-cholamidopropyl) 디메틸-라모니오]-1-프로판화 (CHAPS)와 같은 다른 사람에 비해 상대적으로 가혹한 특성을 특징으로 하는 많은 세척 및 탈세포화 과정에 사용되는 많은 세척 및 탈세포화 과정에 사용되는 SDS 용액의 처리를 위한 단계를 제거함으로써 우리의 이전 프로토콜을 수정했습니다. 이 프로토콜에서는 GGs와 콜라겐 단백질을 보존하면서 세포 성분을 효과적으로 제거할 수 있었던 SDS 솔루션 대신 84시간 동안 1% Triton-X 100 솔루션을 사용했습니다. 또한, IPA로 치료함으로써 잔류 지질의 제거는 또한 pdECM 바이오잉크의 가교를 유도하는 매우 중요한 과정이며 이전에 발표된 기사4와동일한 맥락에서 이해될 수 있다는 점에 주목한다. 비세포성 용액을 가진 처리는 또한 탈세포화 된 조직의 살균을 위해 적용되었다. 또한, 탈세포화된 조직에서 잔류세제 및 화학물질의 제거는 염증성 숙주 반응을 방지하는 중요한 단계이다. 그러나 이 프로토콜에서는 이 문제에 대해 논의하지 않았습니다. 탈세포화의 말단에 살균 공정을 포함하는 프로토콜은 탈세포화 물질의 생체 적합성을 향상시킬 것이다. 또한 세제와 화학물질을 완전히 제거할 수 있도록 평가 기준에 대한 표준을 고려해야 합니다.
펩신을 함유한 pdECM 바이오잉크의 소화는 콜라주누성 단백질에서 텔로펩티드 영역의 절단에 의해 산성 용액에서 pdECM 분말의 균질혼합을 달성하기 위해 수행되었다. pH 조정 과정에서, 얼음에 pdECM 바이오 잉크를 유지하는 것은 겔화의 보존을 위해 중요하다. 그 후, 우리는 dECM 기반 바이오 잉크의 주요 장점 중 하나인 37°C에서 배양하여 겔 상태로 진입할 수 있는 물리적으로 가교 가능한 pdECM 프리 겔 바이오잉크를 생산할 수 있다. pdECM 바이오잉크의 적절한 농도의 선택은 또한10의중요한 것이다. 이상적인 bioink는 공압 및 온도 변화와 같은 인쇄 과정에서 발생하는 외부 손상으로부터 세포를 보호해야 합니다. 적용된 전단력은 세포에 손상을 일으킬 수 있고 인쇄된구문(10)에서세포 생존력을 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 바이오 잉크의 농도 향상 세포 죽음을 유도할 수5. 대조적으로, 바이오 잉크의 낮은 농도는 인쇄 하는 동안 가난한 인쇄 및 모양 충실도 를 의미 하는 낮은 점도를 유도. 바이오 잉크의 점도를 확인하고 농도를 최적화할 필요가 있습니다.
현재 연구자들은 3D조직구성14,15,16을인쇄하기 위한 다양한 유형의 조직 유래 바이오잉크의 개발을 활발하고 있다. 이 연구 결과의 결과는 bioink가 세포를 위한 조직 특정 마이크로 환경을 제공할 수 있었다는 것을 표시합니다. 이러한 독특한 조건은 줄기 세포의 분화 또는 성숙을 촉진하고 세포의 증식을 촉진 할 수있다. 또한 멀티 헤드 장착 3D 셀 프린팅 시스템을 활용하여 여러 종류의 바이오 잉크를 고정밀로 동시에 인쇄할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 특정 패턴을 가진 구조를 생성할 수 있으므로 디자인의 다양성이 표시됩니다. 또한, 네이티브 세포배열(17)을모방하기 위해 각 바이오잉크내로 상이한 유형의 세포를 캡슐화하는 것이 가능하다. 이러한 패턴 구조는 특정 세포의 장기 생존에 핵심인자일 수 있는 세포 대 세포 상호작용을 개선함으로써 혈관화 또는 공동 배양 효과의 유도에 활용될 수있다(18,19).
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
이 연구는 한국 정부(MSIT)(2017M3A9C6032067)와 "ICT 융합 창의프로그램"(IITP-2019-2011-1-00783)의 지원을 받아 국립연구재단(NRF)의 바이오 및 의료기술 개발 프로그램을 지원받았습니다. IITP(정보통신기술기획평가연구원)의 감독을 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
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