Summary
Decellularized מטריקס מסחטות (dECM) יכול לספק רמזים מיקרו סביבתי מתאים כדי ללכוד את הפונקציות הטמונות של רקמות היעד במבנה מהונדס. מאמר זה מהבהיר את הפרוטוקולים עבור decellularization של רקמת הלבלב, הערכה של רקמת הלבלב הנגזרת dECM ביודיו, והדור של בנייה רקמת הלבלב 3D באמצעות טכניקת ביוריטינג.
Abstract
השתלת איונים הלבלב הוא טיפול מבטיח עבור חולים הסובלים מסוכרת סוג 1 מלווה על ידי היפוגליקמיה וסיבוכים משניים. עם זאת, השתלת איון עדיין יש מספר מגבלות כגון הכדאיות הנמוכה של איונים מושתלים בשל מעבר איון העניים בסביבות עוינות. בנוסף, את האינסולין לייצר תאים הבדיל מתאי גזע האדם בעלי עוצמה גבוהה יש יכולת מוגבלת להפריש הורמונים מספיקים שיכולים לווסת את רמת הגלוקוז בדם; לכן, לשפר את ההבשלה על ידי תאים culturing עם רמזים מיקרוסביבתיים הנכון נדרש מאוד. במאמר זה, אנו להבהיר פרוטוקולים התאריך להכנת רקמת הלבלב נגזר decellularized מטריקס מטריצה (pdECM) bioink לספק מיקרוסביבה מועילה כי יכול להגביר את רגישות הגלוקוז של איולי הלבלב, ואחריו תיאור את התהליכים ליצירת בונה רקמת הלבלב תלת-ממד באמצעות טכניקת ביוטריטינג מיקרוסטרומה.
Introduction
לאחרונה, השתלת איון הלבלב נחשב טיפול מבטיח עבור חולים עם סוכרת מסוג 1. הבטיחות היחסית והפלישה המינימלית של ההליך הם היתרונות הגדולים של טיפול זה1. עם זאת, יש לו מספר מגבלות כגון שיעור ההצלחה הנמוכה של בידוד איונים ותופעות לוואי של תרופות מדכאים חיסוני. יתר על כן, מספר האיים מנופה מקטין בהתמדה לאחר ההשתלה בשל הסביבה העוינת2. חומרים ביולוגיים שונים כגון alginate, קולגן, פולי (לקטית-co-חומצה גליקולית) (PLGA) או פוליאתילן גליקול (יתד) הוחלו על השתלת איון הלבלב כדי להתגבר על הקשיים האלה.
3D טכנולוגיית הדפסה של התא מתגלה הנדסת רקמות בשל הפוטנציאל הגדול שלה ביצועים גבוהים. למותר לציין, ביודיו ידועים כרכיבים חשובים למתן סביבת מיקרו מתאימה ולאפשר שיפור של תהליכים סלולאריים במבנה רקמות מודפסות. מספר משמעותי של הידרולים דליל, כגון פיברומין, alginate, ו קולגן נמצאים בשימוש נרחב כמו ביודיו. עם זאת, חומרים אלה מראים חוסר של מבנה, כימי, ביולוגי, ומורכבות מכנית לעומת מטריצה החילוץ (ECM) ברקמות יליד3. רמזים מיקרוסביבתיים כגון האינטראקציות בין איונים ו-ECM הם אותות חשובים לשיפור הפונקציה של איונים. Decellularized ECM (dECM) יכולה ליצור מחדש את ההרכב הספציפי לרקמה של רכיבי ECM שונים, כולל קולגן, גליקוזנוגליקנים (מבוים) וגליקורופנס. לדוגמה, איונים ראשוניים ששומרים על ECMs ההיקפית שלהם (למשל, סוג I, III, IV, V, ו-VI השישי, למינציה, ו fibronectin) מוצג ואפופטוזיס נמוך ורגישות אינסולין טובה יותר, ובכך לציין כיהרקמותהספציפיות מטריקס האינטראקציה הם חשובים לשיפור היכולת שלהם לתפקד באופן
במאמר זה, אנו להבהיר פרוטוקולים תאריך להכנת רקמת הלבלב נגזר decellularized מטריקס מטריצה (pdECM) bioink כדי לספק רמזים מיקרוסביבתיים מועילים עבור האצת הפעילות ופונקציות של איונים הלבלב, ואחריו את התהליכים ליצירת בונה רקמת הלבלב 3D באמצעות טכניקה מיקרוהבלטה מבוססי ביופסיה (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמות הלבלב של פורצין נאספו מבית מטבחיים מקומי. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של מרכז רפואי, סאול, קוריאה.
1. decellularization רקמה
- הכינו את הפתרונות לdecellularization.
הערה: 1x פוספט באגירה מלוחים (PBS) המשמש בכל ההכנות הפתרון הוא מדולל על ידי הוספת מים מזוקקים כדי 10x PBS.- עבור 1% טריטון-X 100 פתרון, לפזר 100 mL של 100% טריטון-X 100 הפתרון ב 900 mL של 1x PBS באמצעות מגנטי מעורר בר עם ערבוב ב-150 סל ד עבור 6 h. לעשות 400 mL של 1% טריטון-X 100 פתרון עם 40 mL של 10% טריטון-X 100 פתרון ו 360 mL של 1x PBS הכינה ממש לפני השימוש.
הערה: הפתרון של 10% טריטון-X 100 יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר עד לצורך. - עבור 0.1% החומצה מפרכאצטט הפתרון, לדלל 8.5 mL של 4.7% הפרג חומצה לתוך 22.8 mL של 70% אתנול עם 368.7 mL של מים מזוקקים ממש לפני השימוש.
- עבור 1% טריטון-X 100 פתרון, לפזר 100 mL של 100% טריטון-X 100 הפתרון ב 900 mL של 1x PBS באמצעות מגנטי מעורר בר עם ערבוב ב-150 סל ד עבור 6 h. לעשות 400 mL של 1% טריטון-X 100 פתרון עם 40 mL של 10% טריטון-X 100 פתרון ו 360 mL של 1x PBS הכינה ממש לפני השימוש.
- להסיר את הרקמות ההיקפית של הלבלב ולחתוך את הרקמה לפני decellularization.
- לשטוף את הלבלב חזירי מחדש עם הפעלת מי ברז ולהסיר את הרקמות ההיקפית באמצעות מספריים מעוקר.
- להעביר את הלבלב לתוך שקית ניילון עם מלקחיים להקפיא ב-80 ° צ' עבור 1 h כדי לעזור לחתוך את הלבלב ביעילות לשלב הבא.
- פורסים את הלבלב הקפוא לחתיכות בעובי 1 מ"מ באמצעות פומפייה.
- העברת 50 גרם של הרקמה הפרוסה לתוך מכולה פלסטיק 500 mL.
הערה: מיכל פלסטיק עם מכסה מומלץ כאן כדי להגן על רקמות מפני זיהום ולמנוע אידוי פתרון.
- טיפול עם ריאגנטים.
הערה: התהליך הdecellularization כולו צריך להתבצע ב -4 ° c על שייקר מסלולית דיגיטלי ב 150 סל ד. בכל השלבים decellularization, ניתוק פיזי באמצעות מלקחיים נדרש כדי למנוע את פרוסות של הלבלב מדבק יחד. לשטוף את המיכל עם מים מזוקקים הוא הכרחי כדי להסיר את שרידי ריאגנטים לחלוטין במיכל.- לפני כל טיפול מגיב, לשטוף 50 g של לבלב פרוס עם 300 mL של מים מזוקקים באמצעות שייקר.
- מערבבים את הרקמה ברציפות ב-150 סל ד עד שהמים העכורים נעלמים (לאחר כ -12 שעות). להחליף את המים מזוקקים כל 2 שעות.
הערה: שינוי המים המזוקקת מדי שעה מומלץ ליעילות להסרת המים העכורים מהר יותר. - להיפטר המים ולטפל 50 g של רקמות עם 400 mL של 1% טריטון-X 100 בפתרון PBS 1x עבור 84 h. רענן את הפתרון כל 12 h.
הערה: בשלב זה, כמות הרקמה תפחית משום שהרכיבים הסלולריים מתחילים להיות מוסרים. - לטפל עם 400 mL של איזופנול (IPA) עבור 2 h כדי להסיר את השומן שנותר מן הלבלב.
הערה: זה נורמלי הרקמה להיות קשה עקב הסרת שומן בתהליך זה. - לאחר 2 h, להסיר את IPA ולשטוף את הרקמה עם 400 mL של 1x PBS עבור 24 שעות. לרענן את ה-PBS 1x כל 12 h.
- כדי לחטא את רקמת decellularized, למחוק את הפתרון הקודם ולטפל עם 400 mL של 0.1% חומצה peracetic ב 4% אתנול עבור 2 h.
- כדי להסיר כביסה שיורית, לשטוף את הרקמה עם 400 mL של 1x PBS עבור 6 h. רענן את הפתרון כל 2 h.
- לאסוף את רקמות decellularized ב שפופרת חרוט 50 mL עם מלקחיים.
- הקפא את המדגם ב-80 ° c עבור 1 h. כסו את צינורית החרוט בעזרת מחיקה נטולת-מוך במקום מכסה המכסה והתקן עם גומייה לליאופליזציה היעילה.
- ליאופליז הרקמה הdecellularized ב-50 ° c עבור 4 ד.
הערה: עבור שלב 1.3, 1 גרם של רקמות שאינן decellularized צריך גם להקפיא מיובשים תחת אותם תנאים.
2. הערכת רקמות decellularized
הערה: כדי להעריך את כמות השאריות של dsDNA, גליקוזאמינוגליקנים (בדיחות), ו קולגן ברקמת decellularized לעומת רקמת יליד, לפחות 1 g של כל אחת הרקמה הלא decellularized (רקמות יליד) ו decellularized רקמות נדרשות עבור אחד הערכה. הכמות של dsDNA, בדיחות, ו קולגן ניתן לחשב בהתבסס על המשקל היבש של הרקמה.
- הכינו את הפתרונות לספר הביוכימי.
- להכין פתרון פפאין לעיכול לדוגמה.
הערה: ניתן לכוונן את כמות המאגר להתאמה בהתאם למספר הדגימות.- התמוססות 119 מ"ג של 0.1 M נתרן פוספט (חד-בסיסי), 18.6 mg של 0.5 mM Na2-EDTA, ו 8.8 mg של 5 מ"מ cysteine-HCl ב 10 מ ל של מים אוטוקלבים.
- להתאים את ה-pH של הפתרון כדי 6.5 על ידי הוספת 10 מ NaOH פתרון.
- הוסף 125 μl של 10 מ"ג/mL פפאין פתרון מניות לפתרון לעיל מערבולת, המאפשר לכל אלמנט לערבב באופן שווה.
- הכינו פתרונות למתילן כחול דימתיל (DMMB).
- כדי להפוך את הצבע DMMB, לפזר 8 מ"ג של 1, 9-diמתיל-מתילן כחול אבץ כלוריד מלח כפול, 1.52 g של גליצין, ו 1.185 g של הנאל ב 500 mL של מים אוטוקלבים. להתאים את ה-pH כדי 3 על ידי הוספת 0.5 M הפתרון HCl תוך מדידת השינוי של ה-pH באמצעות מד pH העליון הספסל. אז, לסנן את זה באמצעות מסנן ואקום העליון 500 mL.
- להפוך 15 μL של 10 מ"ג/mL כונדרויטין סולפט פתרון סטנדרטי.
- הכינו פתרונות לשיטת הידרוקסיפרוקו.
- עבור פתרון עבודה כלוראמין, לפזר 2.4 גרם של סודיום אצטט, 1 גרם של חומצת לימון, ו 0.68 g של נתרן הידרוקסיד 24 מ ל של מים מזוקקים ולהוסיף 240 μL של חומצה אצטית קרחוני, 10 μL של toluene, ו 6 מ ל IPA.
הערה: לפזר את כל אבקות בתמיסה באמצעות מערבל מערבולת. ניתן לאחסן את פתרון העבודה כלוראמין ב-4 ° צ' עד שלושה חודשים. - עבור תמיסת כלורמין T, לפזר 0.35 g של כלורמין T ב 20 מ ל של פתרון עובד כלוראמין ולהוסיף 2.5 mL של IPA. מערבולת לערבב את כל הרכיבים.
הערה: התכונן מיד לפני השימוש. - עבור הפתרון P-perchloric, לשים 3.75 g של P-לתוך 6.5 mL של חומצה 15 מ ל של IPA; עטוף אותו ברדיד אלומיניום.
הערה: התכונן מיד לפני השימוש.
- עבור פתרון עבודה כלוראמין, לפזר 2.4 גרם של סודיום אצטט, 1 גרם של חומצת לימון, ו 0.68 g של נתרן הידרוקסיד 24 מ ל של מים מזוקקים ולהוסיף 240 μL של חומצה אצטית קרחוני, 10 μL של toluene, ו 6 מ ל IPA.
- להכין פתרון פפאין לעיכול לדוגמה.
- הוסף 1 מ ל של פתרון פפאין ל 10 מ"ג של רקמת ליאופ, ב שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ו מערבולת הצינור כדי לעכל טוב יותר את המדגם.
- מניחים את שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL במתלה גומי ומעכלים את הדגימות בגביע משנת 500 mL המכיל 300 mL של מים בשעה 60 ° c עבור 16 h.
- צנטריפוגה ב 9,500 x g עבור 20 דקות, לאסוף את supernatant, ולהעביר אותו צינור חדש.
- לכמת את ה-DNA שיורית ואת החלבונים העיקריים ברקמת decellularized.
- טען 1 μL של דגימה מתעכלת לתוך ספקטרומטר ולמדוד את כמות dsDNA על פי הוראות היצרן.
הערה: הניסויים צריכים לקשור את השיער לאחור ולחבוש מסכה כדי להימנע מזיהום המדגם.
- טען 1 μL של דגימה מתעכלת לתוך ספקטרומטר ולמדוד את כמות dsDNA על פי הוראות היצרן.
- בצע שיטת DMMB כדי לכמת את כמות הבדיחות שנשאר ברקמת decellularized.
- מערבבים 1 μL של כונדרויטין סולפט פתרון ו-499 μL של 1x PBS כדי ליצור סטנדרטים. דלל את כונדרויטין סולפט פתרון עם מים מזוקקים בריכוזים של 0, 4, 8, 12, 16, ו-20 μg/mL.
- טען מטריליטים של 50 μL של כל ריכוז של התקן ודגימות מתעכל לצלחת 96-באר.
- הוסף 200 μL של הצבע DMMB לכל טוב באמצעות הצינורות מרובת ערוצים.
- קרא מיד את ספיגת ב525 ננומטר על קורא מיקרולוח.
- בצע שיטת הידרוקסיפרוקו כדי לכמת את כמות הקולגן.
- כדי לבצע שיטת הידרוקסיפרוקו, מ250 μL של מדגם מתעכל עם כמויות שוות של HCl ב 120 ° c עבור 16 h.
- יבש את השקעים בטמפרטורת החדר עבור 3 שעות כדי לצנן את הדגימות ולאחר מכן לפזר מחדש את דגימות 1 מ ל של 1x PBS.
- צנטריפוגה ב 2,400 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
- הכינו 100 μg/mL הידרוקסיקו פתרון כסטנדרט.
- לדלל פתרון הידרוקסיקו עם מים מזוקקים בריכוז של 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL עבור פתרון סטנדרטי.
- טען מטריליטים של 50 μL של דגימות ופתרון סטנדרטי לצלחת ברמה 96.
- הוסף 50 μL של הפתרון של כלורמין T ולאחר מכן דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 50 μL של הפתרון p-לייט ו-דגירה עבור 30 דקות ב 60 ° c.
הערה: הורדה בחדר חשוך. לאחר התוספת, לעטוף את הצלחת עם רדיד אלומיניום. - דגירה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
- לאחר צינון, למדוד את ספיגת ב 540 ננומטר על קורא מיקרופלייט.
3. הכנה לביודיו
הערה: ניתן לאחסן אבקת pdECM באופן בלתי נשכח ב-80 ° c לפחות שנה אחת. לפני התאמת ה-pH, ניתן לאחסן את הפתרון pdECM מתעכל ב-20 ° צ' לחודש אחד. לפני השימוש, להפשיר את המדגם של פתרון pdECM קפוא ב 4 ° c לילה. ניתן לאחסן את פתרון ה-pH-מנוכי pdECM ב-4 ° צ' עד שבוע אחד. הפתרון pdECM מתעכל ניתן לאחסן ב 4 ° צ' לפחות כמה ימים, אבל לא צריך לחרוג 1 שבוע.
- לעכל את ההקפאה מיובש pdECM עם pepsin.
- לצורך עיכול אפקטיבי של הביודיו, השתמשו בחנקן נוזלי באמצעות מרגמה ומכתש.
- לאסוף 200 מ ג של אבקת pdecm ב-50 ml חרוט ולהוסיף 20 מ"ג של פפסין ו 8.4 mL של חומצה אצטית 0.5 M (הריכוז הסופי הוא 2 w/v%).
- מניחים את בר המהומה המגנטי בצינור 50 mL ו מערבבים ב 300 rpm עבור 96 h.
- כוונן את ה-pH של פתרון pdECM מתעכל.
הערה: כדי למנוע התאמה לפני התאמת החומציות, תהליך זה צריך להתבצע על קרח.- מסננים את החלקיקים לא מעוקרים בפתרון pdecm באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר באמצעות פיפטה הזחה חיובית על קרח כדי להשיג את העיכול האופטימלי של חלקים.
- הוסף 1 mL של PBS 10x ו מערבולת לפני השימוש NaOH.
- להתאים את ה-pH ל 7 עם 10 מ NaOH בדיקת ה-pH עם רצועות מחוון pH.
הערה: מערבולת בכל פעם NaOH הוא הוסיף כך bioink מעורבב ביסודיות עם ריאגנטים אחרים.
4. אנליזה רטיולוגית
- התקנה ניסויית
- הכן את 1.5% (w/v) של bioink pdECM כדי להעריך את המאפיינים rheological.
- להקים 20 מ"מ צלחת קונוס העדשה (קוטר חרוט של 20 מ"מ עם זווית 2 °) במצב מבוקרת קצב של rheometer.
- צור רצפים ניסיוניים בתוכנה המותקנת (שלישיות) כדי למדוד את הצמיגות, הקינטיקה הגלגנציה והמודוללי הדינאמי של הביודיו pdECM.
- צמיגות: מקום bioink pdECM על הצלחת. מדידת צמיגות מורכבת (Pa · s) של ביודיו pdECM תחת קצב הטיה גדל מ 1 עד 1,000 s-1 בטמפרטורה קבועה של 15 ° c.
- הגלציה קינטיקה: מניחים את הביודיו pdECM על הצלחת. חישוב מודולוס המורכב (G *) על ידי מדידת האחסון וההפסד של מודול ה-pdECM bioink ב 4-37 ° c עם קצב עלייה מצטבר של 5 ° צ'/מינימום (מצב לטאטא זמן).
- מודול דינמי: מניחים את ביודיו pdECM על הצלחת ב 37 ° c עבור 60 דקות לפני המדידה. למדוד את מודול האחסון תלוי התדר (G ') ואת מודול הפסד (G ') של bioink pdECM בטווח של 0.1-100 rad/s ב 2% המתח.
5.3D הדפסה תא של מבנים רקמת הלבלב באמצעות איון
- הכנת איונים מבודדים
- בודד איונים ראשוניים מחולדה בהתאם לפרוטוקולים המתוארים בעבודה קודמת5.
- כדי להפריד הריסות ותאים מתים מן איון מבודד, לעבור את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 יקרומטר. איונים עם קוטר קטן יותר מ-70 יקרומטר נחשבים מתים או חריגים.
- להשעות את איונים מבודדים ב RPMI-1640 בינוני ולמקם אותם על צלחת פטרי. הסרת איונים גדולים יותר מ-300 יקרומטר בקוטר באמצעות P200 volume מתחת למיקרוסקופ (4x המטרה עדשה) בארון אבטחה טיחות.
- עטיפת איון לתוך הביודיו של pdECM
- הכנת ה-pH המותאם הביודיו pdECM ו איון מבודד.
הערה: כדי למנוע הגברה לפני התאמת ה-pH, יש לבצע תהליך זה על הקרח. - בעדינות לערבב את הביודיו pdECM ואת התקשורת הושעו עם איונים (יחס 3:1) באמצעות פיפטה העקירה חיובי עד אחיד מעורב.
הערה: הריכוז הסופי של הביודיו pdECM הוא 1.5% וצפיפות התא בביודיו pdECM היא 3,000 IEQ/mL.
- הכנת ה-pH המותאם הביודיו pdECM ו איון מבודד.
- 3D הדפסה תא של מבנים רקמת הלבלב
- להכין מזרק עקר ו -22 גרם זרבובית.
הערה: מד זה נבחר עבור הדפסת איונים עם קוטר של 100-250 μm. - טען הביודיו של איון-לאדן pdECM לתוך המזרק.
- הדפס את הbioink עם תנאי ההדפסה הממוטב (קצב הזנה: 150 מ"מ/min; לחץ פניאומטי: 15 kPa) ב -18 ° c בצורת סריג.
- כדי להצליב את הביו-דיו, הציבו את המבנה המודפס בחממה למשך 30 דקות.
- לטבול את המבנה המודפס לתוך התקשורת התרבות איון אשר הוא RPMI-1640 בינוני עם 10% סרום עוברי (FBS), 100 U/mL פניצילין 100 U/mL סטרפטומיצין.
- להכין מזרק עקר ו -22 גרם זרבובית.
6.3D הדפסה תא של בניית הלבלב עם מבנה תבנית
- הכנת שני סוגי הביודיו
- כדי לאמת את רב-תכליתיות ההדפסה באמצעות מספר ביודיו מרובים, הכינו שתי סדרות של ביודיו pdECM והכתים אותן על-ידי הוספת 0.4% טריפה כחול ורדים בנגלי לתוך כל ביודיו pdECM ביחס של 1:20, בהתאמה.
הערה: כדי למנוע התאמה לפני התאמת pH, תהליך זה צריך להתבצע על קרח. - בעדינות לערבב את הביודיו pdECM ואת התקשורת הושעו עם איונים (יחס 3:1) באמצעות פיפטה העקירה חיובי עד אחיד מעורב.
הערה: הריכוז הסופי של הביודיו pdECM הוא 1.5% וצפיפות התא בביודיו pdECM היא 3,000 IEQ/mL.
- כדי לאמת את רב-תכליתיות ההדפסה באמצעות מספר ביודיו מרובים, הכינו שתי סדרות של ביודיו pdECM והכתים אותן על-ידי הוספת 0.4% טריפה כחול ורדים בנגלי לתוך כל ביודיו pdECM ביחס של 1:20, בהתאמה.
- הדפסת תא תלת-ממד של מבנים מבוססי מרובת חומרים ברקמת הלבלב
- להכין מזרקים מעוקר ו 25 גרם זרבובית.
- לטעון כל bioink (כחול ואדום) לשני מזרקים שונים, בהתאמה.
- הדפס את הביודיו עם תנאי הדפסה ממוטבים (קצב הזנה: 150 מ"מ/min; לחץ פניאומטי: 15 מעלות במהירות 18 ° c בצורת סריג עם קווים מתחלפים של כחול ואדום.
- כדי להצליב את הביו-דיו, הציבו את המבנה המודפס בחממה למשך 30 דקות.
- לטבול את המבנה המודפס לתוך התקשורת התרבות איון אשר הוא RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% סרום בפרה העובר (FBS), 100 U/mL פניצילין 100 U/mL סטרפטומיצין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularization של רקמות הלבלב
פיתחנו את התהליך עבור הכנת הביודיו pdECM כדי לספק הלבלב מיקרוסביבות ספציפיות לרקמות לשיפור הפונקציונליות של איונים במבנה רקמות 3D ביוריטד (איור 2א). לאחר התהליך decellularization, 97.3% של dsDNA הוסר והנציג רכיבי ECM כגון קולגן ו בדיחות נשאר ב 1278.1% ו 96.9% לעומת זה של רקמת הלבלב יליד, בהתאמה (איור 2ב).
הכנה לביודיו
כדי להחיל את pdecm בתהליך ההדפסה, אבקת pdecm היה מסיסות בחומצה חלשה עם פפסין ולנטרל באמצעות הפתרון 10 M naoh. הפתרון pdECM מתעכל אז יכול להיות מדולל דרך ערבוב עם תרבות תא בינונית או 1x PBS. במחקר זה, הכנו bioink pdECM בריכוז הסופי של 1.5% למחקר נוסף. הביודיו pdECM שמרו על שלב הפתרון כאשר הוא הוצב תחת טמפרטורת החדר והוסב מיד לשלב ג'ל לאחר הדגירה ב 37 ° c עבור 30 דקות. כדי לחקור את ההשפעה של הביודיו pdecm על איונים, מבודדים היו כפרו ב pdecm, קילוף פלסטיצידיות וביודיו קולגן בריכוז של 1.5%. התוצאה של בדיקת הפרשות האינסולין מגורה הראה איונים ב-pdECM bioink ייצג את המדד הגבוה ביותר (כ 3.174) בין קבוצות ניסיוני, המציין פונקציונליות גבוהה יותר על הידרוג'לים נרחב החלים על כימוס איון5.
אנליזה רטיולוגית
צמיגות היא אחד המאפיינים קריטי כאשר בהתחשב בסמנים להדפסה. מדדנו צמיגות של הביודיו pdecm בתדר החל מ 1 עד 1,000 Hz ב 15 ° c עבור הדפסת ביודיו שונים decm6,7,8. Bioink pdECM הראה התנהגות גזירה-דליל והערך היה כ 10 האבא · s בקצב ההטיה של 1/s, המציין את הביודיו pdECM היה מאפייני rheological המתאים עבור שחול דרך זרבובית (איור 3א). קינטיקה הגלגנציה בטמפרטורה של 4 עד 37 ° צ' מציינת את התנהגות הגגנציה של הביודיו pdECM בטמפרטורות הרלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. מודול הקומפלקס החל לגדול כאשר הטמפרטורה הגיעה ל -15 ° c, והיא הוגדלה במהירות כאשר הטמפרטורה נשמרה ב-37 ° c, המציינת את מעבר הסול-ג'ל של הביודיו pdECM (איור 3ב). ה-G הדינאמי ו-G "של הביודיו pdECM נחקרו בטמפרטורות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית כדי להבטיח את יציבותו לאחר תהליך ההדפסה, אשר הביא לידי מודול יציב תחת המצב לטאטא תדירות (איור 3ג).
הדפסת תאים תלת-ממדית
3D תא-לאדן מבנים רקמת הלבלב היו מפוברק באמצעות תהליך הדפסה מיקרוהבלטה מבוססי. כדי לבנות מבנה המכיל לפחות 3,000 המקבילה איון (ieq), המתאים לנפח הרקמה של איון כדורית לחלוטין עם קוטר של 150 יקרומטר9, עיצבנו את המבנה עם ממד של 10 מ"מ x 10 מ"מ x 3 מ"מ (איור 4א). הפרמטרים התהליך והתנאים להדפסת איונים הלבלב נבחרו לכמס, שהם אשכולות סלולריים גדולים בגדלים ה100-250 יקרומטר בקוטר (איור 4ב'). באמצעות מערכת הדפסה מרובת ראשים, סוגים שונים של בנייה תלת-ממדית-כגון צורת הסריג לאחר שורות חלופיות של כחול ואדום-היו מפוברק באמצעות pdecm המפותחות (איור 4ג), המציין את צדדיות של pdecm למטרת ביוריטינג 3d להרמוניה שני סוגים או יותר של תאים חיים בסידור
איור 1: סכמטית של ההתפתחות של רקמת הלבלב decellularized, הערכה של ביודיו pdECM וייצור של מבנים רקמת הלבלב 3d. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מייצגות של התהליך הdecellularization והאפיון הביוכימי של pdECM. (א) סקירה של הdecellularization של רקמת הלבלב של חזירי. (ב) תוצאות הביוכימית של רקמות מקוריות ו-pdECM. קווי שגיאה מציגים סטיית תקן. זכויות יוצרים (2019) החברה המלכותית לכימיה5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח רטיולוגי של הביודיו pdECM. (א) צמיגות של pdECM וביודיו קולגן הציגו הטיה דילול התנהגות. (ב) קינטיקה גלגנציה של pdECM וביודיו קולגן במהלך שינוי הטמפרטורה. (ג) מודול מורכב של הצלב pdECM ו ביודיו קולגן. זכויות יוצרים (2019) של האגודה המלכותית לכימיה5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדפסת תא תלת-ממד של תא-לאדן pdECM bioink עבור מבנים 3d רקמת הלבלב. (א) מימדים של מבנים ברקמת הלבלב 3d. (ב) הלבלב איון-לאדן ו (ג) Multimaterial מבוססי 3d רקמת הלבלב מבנים. זכויות יוצרים (2019) של האגודה המלכותית לכימיה5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה תיאר את ההתפתחות של הביודיו pdECM והייצור של מבנים רקמת הלבלב 3D באמצעות שימוש בטכניקות הדפסה תא תלת-ממד. כדי לבנות מראש את המיקרו-סביבה של רקמת המטרה במבנה הרקמה מהונדסים תלת-ממד, הבחירה של bioink היא קריטית. במחקר הקודם, אנו מאומת כי הרקמה הספציפית ביודיו dECM מועילים לקדם בידול תא גזע והפצת10. לעומת פולימרים סינתטיים, dECM יכול לשמש כסביבה חיובית תאים בגלל רקמת הרכב ספציפי וארכיטקטורה11. לכן, התהליך הdecellularization צריך להיחשב ברצינות עבור שימור גבוה של מרכיבים עיקריים ב-dECM.
הבחירה של דטרגנטים שונים לdecellularization של רקמת הלבלב משתנה את שיורית ECM המכוננת12. בתהליך של decellularization, הבחנו כי השימוש נתרן dodecyl סולפט (SDS) יכול להשפיע על אובדן חלבונים ECM13. לכן, שינו את הפרוטוקול הקודם שלנו על-ידי ביטול הצעד לטיפול בתמיסה של SDS, שהוא משתמש בתהליכי ניקוי וdecellularization רבים הכוללים מאפיינים קשים יחסית בהשוואה לאחרים כגון Trion-X 100, או 3-[(3-cholamidopropyl) דימתיל-lammonio] -1-propane, בחורים. בפרוטוקול זה, השתמשנו 1% טריטון-X 100 פתרון עבור 84 h במקום הפתרון SDS, אשר היה מסוגל להסיר את הרכיבים הסלולריים ביעילות תוך שמירה על חלבונים מבוססי וכלי קולגן. בנוסף, ציינו כי הסרת שרידי שומנים על ידי הטיפול ב-IPA הוא גם תהליך מכריע מאוד לגרימת המקשר של bioink pdECM והוא יכול להיות מובן באותו הקשר כמו מאמר שפורסם בעבר4. טיפול עם חומצה פרואצטט פתרון הוחל גם על עיקור של רקמות decellularized. בנוסף, הסרת חומרי הניקוי והכימיקלים הנותרים ברקמת הdecellularized היא צעד מכריע כדי למנוע את תגובת המארח הדלקתי. עם זאת, לא דנו בנושא זה בפרוטוקול זה. פרוטוקולים הכוללים תהליך החיטוי בסוף decellularization ישפרו את התאימות של החומר הdecellularized. יתרה מזאת, יש לשקול סטנדרטים לקריטריוני הערכה כדי להבטיח שחומרי ניקוי וכימיקלים יוסרו לחלוטין.
העיכול של הביודיו pdecm עם פפסין בוצע כדי להשיג ערבוב הומוגנית של אבקת pdecm בפתרון חומצי על ידי מחשוף של אזור telopeptide גאות בחלבון הקולגן. בתהליך התאמת ה-pH, שמירה על ביודיו pdECM על הקרח היא קריטית לשימור הגגנציה. לאחר מכן, אנו יכולים לייצר באופן פיזי מוצלבות pdECM הביו-ג'ל ביודיו שיכול להיכנס למצב ג'ל על ידי הדגירה ב 37 ° c, שהוא אחד היתרונות העיקריים של הביודיו מבוססי dECM. הבחירה של הריכוז הנכון של הביודיו pdECM הוא גם חשוב10. ביודיו אידיאלי צריך להגן על תאים מפני נזקים חיצוניים המתרחשת במהלך תהליך ההדפסה כגון לחץ פנאומטי ושינוי טמפרטורה. ידוע כי כוח ההטיה המוחל עלול לגרום נזק לתאים ולהקטין את הכדאיות התאית במבנה המודפס10. כמו כן, שיפור ריכוזי הביודיו עלול לגרום למוות התאים5. לעומת זאת, ריכוזים נמוכים של bioink משרה צמיגות נמוכה שפירושה הדפסה ירודה ואמינות צורה במהלך ההדפסה. יש צורך לבדוק את צמיגות הביודיו ולמטב את הריכוז שלה.
כיום, החוקרים הם באופן פעיל לימוד התפתחות של סוגים שונים של ביודיו ברקמות נגזרות עבור הדפסה 3d רקמה בנייה14,15,16. תוצאות מחקרים אלה עולה כי הביודיו יכול לספק מיקרוסביבות ספציפיות לרקמות עבור תאים. תנאים ייחודיים אלה יכולים לקדם את הבידול או התבגרות של תאי גזע והתפשטות של תאים. יתר על כן, ניצול מערכת הדפסה מרובת ראשים מצויד 3D מאפשר להדפיס סוגים מרובים של ביודיו עם דיוק גבוה בו. באמצעות טכניקה זו, מבנה עם תבנית מסוימת ניתן לייצר, ובכך מראה רב-תכליתיות עיצוב. בנוסף, זה אפשרי לכמס סוגים שונים של תאים לתוך כל bioink כדי לחקות את הסידור התא יליד17. אלה מבנים בדוגמת יכול להיות מנוצל אינדוקציה של האפקט של vascularization או תרבות שיתוף ידי שיפור אינטראקציות תא לתאים, אשר יכולים להיות גורמים מרכזיים להישרדות לטווח ארוך של תאים ספציפיים18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי התוכנית הרפואית לפיתוח ביו & טכנולוגיה של הקרן הלאומית למחקר (NRF) ממומן על ידי הממשלה הקוריאנית (MSIT) (2017M3A9C6032067) ו "הטכנולוגיה היצירתית של התוכנית" (IITP-2019-2011-1-00783) בהשגחת IITP (המכון למידע & תכנון טכנולוגיות תקשורת & הערכה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
