Bukspyttkjertelen tissue-avledet ekstracellulære Matrix Bioink for utskrift 3D Cell-Laden bukspyttkjertelen vev konstruksjoner
Summary
Decellularized ekstracellulære Matrix (dECM) kan gi egnede microenvironmental signaler for å recapitulate de iboende funksjonene til målet vev i en konstruert konstruere. Denne artikkelen kaster protokollene for decellularization av bukspyttkjertelen vev, evaluering av bukspyttkjertelen vev-avledet dECM bioink, og generering av 3D bukspyttkjertelen vev konstruksjoner ved hjelp av en bioprinting teknikk.
Abstract
Transplantasjon av bukspyttkjertelen holmer er en lovende behandling for pasienter som lider av type 1 diabetes ledsaget av hypoglykemi og sekundære komplikasjoner. Imidlertid har Holme transplantasjon fortsatt flere begrensninger som lav levedyktighet av transplanterte holmer på grunn av dårlig Holme engraftment og fiendtlige miljøer. I tillegg har insulin-produserende celler differensiert fra humant Pluripotent stamceller begrenset evne til å skille ut tilstrekkelige hormoner som kan regulere blodsukkeret; Derfor, forbedre modning av dyrking celler med riktig microenvironmental signaler er sterkt nødvendig. I denne artikkelen, vi belyse protokoller for å utarbeide en bukspyttkjertel vev-avledet decellularized ekstracellulære matrise (pdECM) bioink å gi en gunstig mikromiljøet som kan øke glukose følsomhet av bukspyttkjertelen holmer, etterfulgt av beskriver prosessene for å generere 3D bukspyttkjertel vev konstruksjoner ved hjelp av en microextrusion-basert bioprinting teknikk.
Introduction
Nylig, bukspyttkjertel Holme transplantasjon har vært betraktet som en lovende behandling for pasienter med type 1 diabetes. Den relative sikkerhet og minimale invasiveness av prosedyren er store fordeler ved denne behandlingen1. Men det har flere begrensninger som lav suksess rate av isolere holmer og bivirkninger av immunsuppressiv narkotika. Videre synker antall engrafted holmer jevnt etter transplantasjon på grunn av fiendtlig miljø2. Ulike biokompatible materialer som alginat, kollagen, Poly (melkes-co-glykolsyre acid) (PLGA) eller polyetylen-glykol (PEG) har blitt brukt til bukspyttkjertelen Holme transplantasjon for å overvinne disse vanskelighetene.
3D celle utskrift teknologi fremstår i vev engineering på grunn av sitt store potensial og høy ytelse. Unødvendig å si, bioinks er kjent som viktige komponenter for å gi en passende mikromiljøet og muliggjør forbedring av cellulære prosesser i trykt vev konstruksjoner. Et betydelig antall skjær-tynning hydrogeler som fibrin, alginat, og kollagen er mye brukt som bioinks. Men disse materialene viser en mangel på strukturelle, kjemiske, biologiske og mekaniske kompleksitet i forhold til ekstracellulære matrise (ECM) i native tissue3. Microenvironmental signaler som samspillet mellom holmer og ECM er viktige signaler for å forbedre funksjonen av holmer. Decellularized ECM (dECM) kan gjenskape den vevs spesifikke sammensetningen av ulike ECM-komponenter, inkludert kollagen, glykosaminoglykaner (GAGs) og glykoproteiner. For eksempel, primær holmer som beholder sin perifere ECMs (f. eks, type I, III, IV, V, og VI kollagen, laminin, og fibronektin) viser lav apoptose og bedre insulinfølsomhet, og dermed indikerer at vev-spesifikke celle-matrise interaksjoner er viktig for å forbedre deres evne til å fungere på samme måte som originale vev4.
I denne utredningen belyse vi protokoller for å utarbeide bukspyttkjertel vev-avledet decellularized ekstracellulære matrise (pdECM) bioink for å gi gunstige microenvironmental stikkord for å øke aktiviteten og funksjonene til bukspyttkjertelen holmer, etterfulgt av prosessene for å generere 3D bukspyttkjertel vev konstruksjoner ved hjelp av en microextrusion-basert bioprinting teknikk (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskrev utviklingen av pdECM bioinks og fabrikasjon av 3D bukspyttkjertelen vev konstruksjoner ved hjelp av 3D-celle utskrift teknikker. For å recapitulate mikromiljøet av mål vevet i 3D utviklet vev konstruere, valg av bioink er kritisk. I en tidligere studie, validerte vi at vev-spesifikke dECM bioinks er gunstig for å fremme Stamcelle differensiering og spredning10. Sammenlignet med syntetiske polymerer, kan dECM tjene som en celle-gunstig miljø på grunn av vev-spesifikk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av bio & Medical Technology Development program for National Research Foundation (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (MSIT) (2017M3A9C6032067) og “IKT Consilience Creative program” (IITP-2019-2011-1-00783) tilsyn av IITP (Institutt for informasjons & Communications Technology Planning & evaluering).
Materials
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing?. Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
