Summary
تقدم هذه المقالة بروتوكولا لطرد التفاضلية السرعة في تركيبه مع طرد التدرج الكثافة لفصل الميتوكوندريا من انسجه سرطان المبيض البشرية والتحكم في انسجه المبيض للتحليل الكمي للبروبروتيميكس ، مما ادي إلى عينه عاليه الجودة الميتوكوندريا وعاليه الانتاجيه وعاليه الاستنساخ تحليل البروتين النوعي لسرطان المبيض الميتوكوندريا بروسوم الإنسان.
Abstract
سرطان المبيض هو سرطان الامراض النسائية الشائعة مع ارتفاع معدل الوفاات ولكن اليه الجزيئية غير واضحة. يتم تشخيص معظم سرطانات المبيض في المرحلة المتقدمة ، والتي تعيق العلاج بشكل خطير. التغييرات الميتوكوندريا هي السمة المميزة لسرطان المبيض البشري ، والميتوكوندريا هي مراكز استقلاب الطاقة ، وإشارات الخلية ، والاكسده. والرؤى المتعمقة في التغيرات من بروسوم الميتوكوندريا في سرطان المبيض مقارنه بالتحكم في انسجه المبيض سوف تستفيد من فهم متعمق للأليات الجزيئية لسرطان المبيض ، واكتشاف المؤشرات الحيوية الفعالة والموثوقه والأهداف العلاجية. يتم تقديم طريقه فعاله لاعداد الميتوكوندريا إلى جانب علامة ايزوماريك للقياس الكمي النسبي والمطلق (iTRAQ العراق) البروتينية الكمية هنا لتحليل سرطان المبيض البشري والسيطرة علي البروتينات المتقدريه ، بما في ذلك طرد التفاضلية السرعة ، طرد التدرج الكثافة ، وتقييم جوده عينات الميتوكوندريا ، وهضم البروتين مع التريبسين ، ووضع العلامات في العراق ، وتجزئه تبادل الموجبات القوية (اس اس) ، واللوني السائل (LC) ، والطيف الكتلي الترادفي (MS/ MS) ، وتحليل قاعده البيانات ، والتحليل الكمي للبروتينات الميتوكوندريا. وقد تم التعرف علي العديد من البروتينات بنجاح لتحقيق اقصي قدر من التغطية لسرطان المبيض الميتوكوندريا بروتينيه البشرية والتعبير عن مختلف بشكل مختلف الشخصية البروتين الميتوكوندريا في سرطان المبيض البشري.
Introduction
سرطان المبيض هو سرطان الامراض النسائية الشائعة مع ارتفاع معدل الوفاات ولكن اليه الجزيئية غير واضحة1,2. يتم تشخيص معظم سرطانات المبيض في المرحلة المتقدمة ، والتي تعيق العلاج بشكل خطير. التغييرات الميتوكوندريا هي السمة المميزة لسرطان المبيض البشري ، والميتوكوندريا هي مراكز استقلاب الطاقة ، وإشارات الخلية ، والاكسده3،4،5،6،7. والرؤى المتعمقة في التغيرات من بروسوم الميتوكوندريا في سرطان المبيض مقارنه بالتحكم في انسجه المبيض سوف تستفيد من فهم متعمق للأليات الجزيئية لسرطان المبيض ، واكتشاف المؤشرات الحيوية الفعالة والموثوقه والأهداف العلاجية. وقد اقترح الأيض الميتوكوندريا والمعترف بها كهدف لعلاج السرطان, والعلاج المتقدرات قد تكون في نهاية المطاف مفيده جدا لمنع تكرار وورم خبيث من السرطان8. التنميط الأيضي الفردية كما يمارس بالفعل كاداه مفيده لتقسيم السرطان الطبقية والاستراتيجيات التنبؤيه9,10.
الهدف علي المدى الطويل من هذا البحث هو تطوير واستخدام طريقه بروتينيه الميتوكوندريا الكمية لدراسة سرطان المبيض لتوضيح التعديلات بروميتومي الميتوكوندريا بين سرطان المبيض والسيطرة علي انسجه المبيض ، والتعديلات شبكتهم الجزيئية من المنهجية متعددة الomics زاوية11،12، والتي سوف تؤدي إلى اكتشاف الميتوكوندريا-البيولوجية الجزيئية المستهدفة13 لتوضيح أليات الجزيئية لسرطان المبيض ، التنبؤ ، والعلاج الشخصي لمرضي سرطان المبيض. علامات ايزوماريك للقياس الكمي النسبي والمطلق (itraq العراق) وضع العلامات3,4 هي طريقه فعاله لقياس التغيرات البروتين الميتوكوندريا. اعداد عينات الميتوكوندريا عاليه الجودة من سرطان المبيض البشري والسيطرة علي انسجه المبيض هي الشرط المسبق للتحليل الكمي لل iTRAQ العراق من البروتينات المتقدريه3. تغييرات الشبكة في سرطان المبيض البشري5, بما في ذلك التعديلات في استقلاب الطاقة4, استقلاب الدهون, وميتوفاجي المسار-نظم3.
وقد وجدت الدراسات السابقة ان طرد التفاضلية السرعة في تركيبه مع طرد التدرج الكثافة هو وسيله فعاله لعزل وتنقيه الميتوكوندريا من سرطان المبيض البشري والسيطرة علي انسجه المبيض3,4,5,14. الوسم iTRAQ العراق مقرونا بتبادل الموجبة قويه (سي اس)-اللوني السائل (LC)-ترادفي الطيف الكتلي (MS/MS) هو الأسلوب الرئيسي للكشف عن وتحديد وقياس البروتينات من عينات الميتوكوندريا المعدة.
هنا ، يتم وصف البروتوكولات المفصلة لاعداد الميتوكوندريا إلى جانب البروتينات البروتينية الكمية. وقد استخدمت هذه بنجاح في تحليل الإنسان المبيض الانسجه السرطانية الميتوكوندريا. وتشمل البروتوكولات اعداد العينات ، طرد تفاضلية السرعة ، طرد التدرج الكثافة ، وتقييم جوده عينات الميتوكوندريا ، وهضم البروتين مع التريبسين ، ووضع العلامات في العراق ، والتجزئة ، LC ، MS/MS ، والبحث في قاعده البيانات ، والتحليل الكمي للبروتينات المتقدريه. وعلاوة علي ذلك ، هذا البروتوكول يترجم بسهوله لتحليل الانسجه البشرية الأخرى الميتوكوندريا البروتينية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عينات انسجه المبيض بما في ذلك انسجه سرطان المبيض (ن = 7) وانسجه المبيض التحكم العادي (ن = 11) واستخدمت لهذا البروتوكول. البروتوكول الحالي3،4،5 معتمد من قبل لجنه الأخلاقيات الطبية في مستشفي شيانغيا بجامعه الجنوب الوسطي ، الصين.
1. اعداد الميتوكوندريا من انسجه سرطان المبيض البشري
- اعداد 250 مل من العازلة العزلة الميتوكوندريا من خلال خلط 210 mm mannitol ، 70 mm السكروز ، 100 mm كلوريد البوتاسيوم (kcl) ، 50 mm تريس-HCl ، 1 مم دياميني حمض رباعي الخل (أدتا) ، 0.1 mm الاثيلين جلايكول bis (2-امينوايثيل الأثير) حمض تتراكسي (egta) ، 1 مم المثبط البروتيني فينيلميثانولفونيل (PMSF) ، 2 مم الصوديوم التقويمية (V) ، و 0.2 ٪ الزلال المصل البقري (بوسنيا) ، pH 7.4.
- ضع ~ 1.5 غرام من انسجه سرطان المبيض في طبق زجاجي نظيف.
- أضافه 2 مل من العازلة العزلة الميتوكوندريا قبل المبردة لغسل بخفه الدم من سطح الانسجه 3x.
- استخدام مقص العيون نظيفه لفرم النسيج تماما في حوالي 1 مم3 قطع ، ونقل الانسجه المفرومة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 mL.
- أضافه 13.5 mL من العازلة العزلة الميتوكوندريا التي تحتوي علي 0.2 mg/mL nagarse ، ومن ثم استخدام الخالط الكهربائية لتجانس (استخدام مقياس 2 ، 10 ق 6x ، الفاصل 10 ق) الانسجه المفرومة (2 دقيقه ، 4 درجه مئوية).
- أضافه 3 مل آخر من العازلة العزلة الميتوكوندريا في المتجانسات الانسجه ومزجها جيدا عن طريق التنضيد.
- الطرد المركزي الانسجه المحضرة الخالطون (1,300 x g، 10 دقيقه ، 4 درجه مئوية). أزاله الجزء النووي الخام (اي بيليه) والحفاظ علي supernatant.
- الطارد الفائق لل ماده طافي (10,000 x g, 10 دقيقه, 4 °c). أزاله microsomes (اي ، supernatant) والحفاظ علي بيليه.
- أضافه 2 مل من العازلة العزلة الميتوكوندريا وأعاده التعليق بيليه جيدا بواسطة الأنابيب الخفيفة.
- الطرد المركزي التعليق بيليه (7,000 x g، 10 دقيقه ، 4 درجه مئوية). تجاهل ماده طافي والحفاظ علي الميتوكوندريا الخام (اي ، بيليه).
- أضافه 12 مل من متوسط التدرج الكثافة 25 ٪ (اي ، Nyال# اسم الرمزي) لأعاده تعليق الميتوكوندريا الخام المستخرجة.
- جعل التدرج كثافة المتقطع عن طريق ملء أنبوب من أسفل إلى اعلي مع 5 مل من 34 ٪ ، 8 مل من 30 ٪ ، 12 مل من 25 ٪ (التي تحتوي علي الميتوكوندريا الخام من الخطوة 1.11) ، 8 مل من 23 ٪ ، و 3 مل من 20 ٪ كثافة التدرج المتوسطة ، وأجهزه الطرد المركزي انه (52,000 x g، 90 min ، 4 °c
- استخدام حقنه طويلة وحاده لجمع الميتوكوندريا المنقية في واجهه بين 25 ٪ و 30 ٪ التدرج الكثافة المتوسطة في أنبوب نظيف.
- أضافه العازلة العزلة الميتوكوندريا في الميتوكوندريا التي تم جمعها لتمييع إلى حجم ثلاثه اضعاف. الطرد المركزي (15,000 x g، 20 دقيقه ، 4 درجه مئوية) وتجاهل supernatant.
- أضافه 2 مل من العازلة العزلة الميتوكوندريا لأعاده التعليق بيليه ، وأجهزه الطرد المركزي (15,000 x g، 20 دقيقه ، 4 درجه مئوية). تجاهل الخارقة والحفاظ علي بيليه.
- جمع بيليه النهائي (اي ، الميتوكوندريا المنقية) وتخزينها في-20 درجه مئوية.
ملاحظه: الجمع بين جميع الميتوكوندريا المنقية من انسجه سرطان المبيض كما عينه الميتوكوندريا للتحليل بروتينيه الكمية.
2. اعداد الميتوكوندريا من انسجه المبيض السيطرة البشرية
- اعداد 250 مل من العازلة العزلة الميتوكوندريا كما هو موضح في الخطوة 1.1.
- مكان ~ 1.5 غرام من انسجه المبيض التحكم العادي في صحن زجاجي نظيف.
- أضافه 2 مل من العازلة العزلة الميتوكوندريا قبل المبردة لغسل برفق الدم من سطح الانسجه 3x.
- استخدام مقص العيون نظيفه لفرم النسيج تماما في حوالي 1 مم3 قطع ، ونقل الانسجه المفرومة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 mL.
- أضافه 8 مل من 0.05 ٪ تريبسين/20 مم أدتا في الفوسفات-مخزنه المالحة (الخدمات التلفزيونية الخاصة) إلى انسجه التحكم المفروم ، وهضم (30 دقيقه ، درجه حرارة الغرفة) ، مما يساعد علي lyse الانسجه والخلايا والإفراج عن الميتوكوندريا. ثم أجهزه الطرد المركزي (200 x g، 5 دقيقه). تجاهل الفائقة ، والحفاظ علي الانسجه والخلايا.
- أضافه 13.5 mL من العازلة العزلة الميتوكوندريا التي تحتوي علي 0.2 mg/mL nagarse ، ومن ثم استخدام الخالط الكهربائية لتجانس (استخدام مقياس 2 ، 10 ق 6x ، الفاصل 10 ق) الانسجه المفرومة (2 دقيقه ، 4 درجه مئوية).
- أضافه 3 مل آخر من العازلة العزلة الميتوكوندريا في المتجانسات الانسجه ومزجها جيدا عن طريق التنضيد.
- الطرد المركزي الانسجه المحضرة الخالطون (1,300 x g، 10 دقيقه ، 4 درجه مئوية). أزاله الجزء النووي الخام (اي بيليه) والحفاظ علي supernatant.
- الطارد الفائق لل ماده طافي (10,000 x g، 10 دقيقه ، 4 درجه مئوية). أزاله microsomes (اي ، supernatant) والحفاظ علي بيليه.
- أضافه 2 مل من العازلة العزلة الميتوكوندريا لأعاده تعليق بيليه جيدا بواسطة الأنابيب الخفيفة.
- الطرد المركزي التعليق بيليه (7,000 x g، 10 دقيقه ، 4 درجه مئوية). تجاهل ماده طافي والحفاظ علي الميتوكوندريا الخام (اي ، بيليه).
- أضافه 12 مل من متوسط التدرج الكثافة 25 ٪ لأعاده تعليق الميتوكوندريا الخام المستخرجة.
- جعل التدرج كثافة المتقطع عن طريق ملء أنبوب من أسفل إلى اعلي مع 8 مل من 38 ٪ ، 5 مل من 34 ٪ ، 8 مل من 30 ٪ ، 12 مل من 25 ٪ (تحتوي علي الميتوكوندريا الخام من الخطوة 2.12) ، 8 مل من 23 ٪ ، و 3 مل من المتوسطة التدرج الكثافة 20 ٪ ، والطرد المركزي انه (52,000 x ز، 90 دقيقه ، 4 درجه مئوية).
- استخدام حقنه طويلة وحاده لجمع الميتوكوندريا المنقية في نطاق من واجهه بين 25 ٪ و 30 ٪ إلى واجهه بين 34 ٪ و 38 ٪ في أنبوب نظيف.
- أضافه العازلة العزلة الميتوكوندريا في الميتوكوندريا التي تم جمعها لتمييع إلى حجم ثلاثه اضعاف. الطرد المركزي (15,000 x g، 20 دقيقه ، 4 درجه مئوية) وتجاهل supernatant.
- أضافه 2 مل من العازلة العزلة الميتوكوندريا لأعاده التعليق بيليه ، والطرد المركزي عليه (15,000 x g، 20 دقيقه ، 4 درجه مئوية). تجاهل الخارقة والحفاظ علي بيليه.
- جمع بيليه النهائي (اي ، الميتوكوندريا المنقية) وتخزينها في-20 درجه مئوية.
ملاحظه: الجمع بين جميع الميتوكوندريا المنقية من انسجه المبيض التحكم كعينات الميتوكوندريا للتحليل بروتينيه الكمية.
3. التحقق من جوده عينات الميتوكوندريا الانسجه المنقية
- تاخذ أنبوب من العينات الميتوكوندريا المنقية (اي الكريات من انسجه سرطان المبيض من الخطوة 1.16 وانسجه المبيض السيطرة من الخطوة 2.17) للتحقق مع المجهر الكترون (EM).
ملاحظه: تم وصف البروتوكول المفصل في وقت سابق15،16. - اعداد العازلة استخراج البروتين الميتوكوندريا عن طريق خلط 8 م اليوريا ، 2 متر thiourea ، 40 mm تريس ، 1 مم أدتا ، 130 mm ديثيوثريتول (dtt) ، و 4 ٪ (w:v) 3-((3-تشولاميدوبروبيل) ديميثيلامونيو) -1-بروبانيسولفوناتي (الفصول). ضبط درجه الحموضة إلى 8.52.
- تاخذ أنبوب من العينات الميتوكوندريا المنقية (اي الكريات من انسجه سرطان المبيض في الخطوة 1.16 وانسجه المبيض السيطرة في الخطوة 2.17) وأضافه العازلة استخراج البروتين الميتوكوندريا (عينات الميتوكوندريا إلى العازلة استخراج البروتين ، 1:5) أعاده تعليق بيليه. تجميد العينات في النيتروجين السائل 3x وتخزينها في درجه حرارة الغرفة لمده 2 ساعة.
- جهاز الطرد المركزي في 12,000 x g، 30 دقيقه ، 4 °c ، وجمع ماده طافي (اي عينه البروتين المتقدريه المستخرجة) ، وقياس محتوي البروتين مع حمض bicinchoninic (bca) البروتين عده الفحص.
- اعداد 50 مل من 1.5 M تريس-HCl (pH 8.8) عن طريق خلط 9.08 g من تريس و 40 mL من ddH2س ، ضبط درجه الحموضة إلى 8.8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك ، وأضافه ddh2o إلى الحجم النهائي من 50 mL. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
- اعداد 50 مل من 1 متر تريس-HCl (pH 6.8) عن طريق خلط 6.06 غرام من تريس و 40 مل من ddH2س ، ضبط درجه الحموضة إلى 6.8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك ، وأضافه ddh2o إلى الحجم النهائي من 50 mL. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
- اعداد 100 مل من 30 ٪ الاكرياميد-حل مكرر من خلال خلط 29 غراما من الاكريلاميد ، 1 غرام من مكررا-الاكرياميد ، و 80 مل من ddH2o ، وأضافه ddh2o إلى الحجم النهائي من 100 ml. احفظه في زجاجه بنيه بدرجه حرارة 4 درجات مئوية.
- اعداد 1,000 مل من 10x تريس-الجليسين الكهربائي العازلة عن طريق خلط 29 غرام من الجليسين ، 58 غرام من تريس ، 3.7 غرام من كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، و 800 مل من ddH2o ، ثم أضافه ddh2o إلى الحجم النهائي من 1,000 ml.
- اعداد 10 مل من المخزن المؤقت التحميل عن طريق خلط 2 مل من الجلسرين ، 0.02 غرام من الأزرق بروموفينول ، 0.4 غرام من SDS ، 2 مل من تريس-HCl pH 6.8 ، و 7 مل من ddH2o ، ثم أضافه ddh2o إلى الحجم النهائي من 10 مل.
- اعداد 10 مل من 10 ٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات-بولياكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) حل هلام عن طريق خلط 4 مل من ddH2O ، 3.3 ml من محلول اكرياميد-بيس 30 ٪ ، 2.5 ml من 1.5 M تريس-HCl (pH 8.8) ، 0.1 مل من 10 ٪ SDS ، 0.1 مل من persulfate الأمونيوم 10 ٪ ، و 0.004 ml من تيتراميثيليثيلينيدياميني (temed). اسكب المحلول الهلامي لحل الهلام في اللوحة بين لوحات الزجاج إلى مستوي الجزء السفلي من المشط. أضافه 2 مل من الكحول الايزوبروبيل علي القمه. اتركيه لمده 30 دقيقه.
- أزاله الكحول الايزوبروبيل وغسل الأعلى مع ddH2O 3x. صب 5 ٪ تركيز هلام الحل التي تحتوي علي 4.1 مل من ddH2س ، 1.0 مل من 30 ٪ اكيلاميد-حل bis ، 0.75 مل من 1 متر تريس-HCl (pH 6.8) ، 0.06 مل من 10 ٪ SDS ، 0.06 مل من persulfate الأمونيوم 10 ٪ ، و 0.006 مل من temed. علي الفور ادراج المشط في محلول هلام التركيز ، وترك لمده 30 دقيقه ، ومن ثم إخراج المشط.
- اعداد 1x تريس-جليسين الكهربائي العازلة عن طريق تمييع 100 مل من 10x تريس-جليسين الكهربائي العازلة مع 900 مل من ddH2O وتصب في خزان الكتروريتيك.
- اخلط 30 ميكروغرام من البروتينات المتقدريه من سرطان المبيض والتحكم في انسجه المبيض من الخطوة 3.4 مع مخزن التحميل للوصول إلى الحجم النهائي من 20 μL. يغلي الخليط لمده 5 دقائق ، ثم افصله مع 10 ٪ SDS-صفحه حل هلام باستخدام الجهد المستمر من 100 V. عندما يصل الأزرق البروفينول إلى القاع ، ووقف الكهربائي.
- اعداد 1.5 L من المخزن المؤقت نقل الكهربائية عن طريق خلط 150 مل من 10x تريس-جليسين الكهربائي العازلة ، 1,050 مل من ddH2O ، و 300 مل من الميثانول.
- نقع غشاء PVDF في 100 ٪ الميثانول لمده 10 دقيقه وفي المخزن المؤقت نقل الكهربائية لمده لا تقل عن 5 دقائق. نقع خمسه أوراق من ورقه فلتر في 1x العازلة نقل elecrophoretic لمده 5 دقائق علي الأقل.
- إخراج الهلام SDS الصفحة التي تحتوي علي البروتينات ، ونقع في العازلة نقل الكهربائية لمده 10 دقيقه.
- جعل كاسيت نقل عن طريق وضع إسفنجه مبلله علي لوحه بيضاء ، وثلاث أوراق من ورقه فلتر الرطب ، وغشاء PVDF ، وهلام SDS الصفحة مع البروتينات ، وورقتين من ورق الترشيح الرطب ، والإسفنج الرطب من أسفل إلى اعلي. تجنب اي فقاعات.
- وضع كاسيت نقل في خزان الكتروريتيك ، تصب في المخزن المؤقت نقل الكهربائية ، ومن ثم نقل لمده 2 ساعة تحت ثابت 200 mA الحالية.
- اعداد 10x تريس-مخزنه المالحة (TBS) حل الأسهم عن طريق خلط 12.114 g من تريس ، 29.22 غرام من كلوريد الصوديوم ، وأضافه ddH2O إلى الحجم النهائي من 500 mL. اعداد 2 لتر من TBST 1x عن طريق خلط 200 مل من 10x TBS ، 2 مل من توين-20 ، و 1,798 مل من ddH2س. اعداد 100 ml من حل الحجب عن طريق خلط 100 مل من tbst و 5 غرام من جيش صرب الجمهورية.
- بعد نقل ، وإخراج الغشاء PVDF ، يغسل بخفه في TBST لمده 5 دقائق ، ثم منعها في حل الحظر ل 1 ح في درجه حرارة الغرفة.
- احتضان غشاء pvdf (4 °c بين عشيه وضحيها) مع الأجسام المضادة الاساسيه المختلفة المحددة لمختلف organelles الخلوية ، بما في ذلك لمين B (نواه الخلية ؛ الجسم المضاد للإنسان 1:1,000 حجب الحل) ، flotillin-1 (الخلوية ؛ أرنب المضادة للإنسان الأجسام المضادة 1:500 حل الحظر) ، COX4I1 (ميتوكندريا ؛ أرنب مكافحه الإنسان 1:1000 حل الحجب) ، GM130 (golgi جهاز ؛ الماوس مكافحه الجسم المضادة للإنسان 1:1000 حل الحجب) ، الكاتلاز (peroxisome ؛ الأرنب مكافحه الإنسان الأجسام المضادة 1:1000 حجب الحل) ، و كاتيبسين B (lysosome ؛ أرنب مكافحه الإنسان الأجسام المضادة 1:1000 حل الحجب). يغسل برفق في TBST لمده 5 دقائق 3x.
- احتضان غشاء PVDF لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة (أرنب مكافحه الماعز ، الماعز المضادة للأرانب ، أو الماعز المضادة للماوس). يغسل برفق في TBST لمده 5 دقائق 3x. تصور ذلك مع التلالؤ الكهربائي (ECL).
4. تحليل الأوراق الخاصة
ملاحظه: الإجراءات التفصيلية للقسم 4 تشير إلى تعليمات iTRAQ العراق (جدول المواد).
- أضافه الخرطوم العازلة (4 ٪ SDS ، 100 mM تريس-HCl pH 7.6 ، و 100 mM DTT) إلى عينات الميتوكوندريا المنقية (اي الكريات من انسجه سرطان المبيض من الخطوة 1.16 وانسجه المبيض السيطرة من الخطوة 2.17). دوامه العينة حتى لا يكون هناك راسب مرئية.
ملاحظه: يجب ان يكون نموذج الميتوكوندريا إلى نسبه المخزن المؤقت التفاضلية 1:5. - يغلي العينة المعاملة الخرطوم لمده 5 دقائق ، وتهدئه العينة علي الجليد ، ومن ثم أجهزه الطرد المركزي (2,000 x g، 2 دقيقه).
- جمع ماده طافي كعينات البروتين الميتوكوندريا المستخرجة وقياس محتوي البروتين مع مجموعه فحص البروتين bca.
- تاخذ الخرطوم-استخراج البروتينات الميتوكوندريا (200 ميكروغرام من كل عينه) للحد ، الالكله ، الهضم مع التريبسين ، تحليه المياه ، والتجميد3،4. قم بثلاث نسخ متماثلة لكل عينه.
- علاج الببتيدات التريتيك (100 ميكروغرام من كل عينه) من الخطوة 4.4 مع 100 mM رباعي ميثيل الأمونيوم محلول بروميد (pH 8.5) ، وتسميه الببتيدات التريتيك مع واحده من 6-بلكس ايراق الكواشف وفقا لتعليماتها3,4. تسميه كل عينه 3x.
- امزج 6 عينات الببتيد التريتيك المسمية بالتساوي (ثلاثه من انسجه سرطان المبيض وثلاثه من انسجه المبيض التحكم) ، والجافة مع المكثف الفراغ.
- فرااكتينات المختلطة ايراق-المسمي الببتيدات مع الفصل اللوني في 60 الكسور (كسر واحد في 1 دقيقه) ، ثم الجمع بين كل اثنين من الكسور باعتبارها عينه المجزاه (ن = 30).
- الموضوع كل عينه من المادة المجزاه إلى lc-ms/ms التحليل علي مطياف كتله3,4 إلى جانب نظام النانو lc ضمن التدرج lc 60-min الفصل للحصول علي ms/ms البيانات.
- ابحث في بيانات MS/MS للتعرف علي البروتينات باستخدام محرك البحث (جدول المواد).
- استخدام الكثافة مراسل أيون ايراق لقياس كل بروتين وتحديد الميتوكوندريا البروتينات التي أعرب عنها بشكل مختلف (mtDEPs) مع تغيير > 1.5 أو <-1.5 اضعاف ، و p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان هناك فرق في اعداد الميتوكوندريا من انسجه سرطان المبيض والسيطرة علي انسجه المبيض. وجدت هذه الدراسة انه كان من الأسهل بكثير لاعداد الميتوكوندريا من انسجه سرطان المبيض من السيطرة علي انسجهالمبيض 3,4. وكان بعض التحسينات التي يتعين اجراؤها علي بروتوكول لاعداد الميتوكوندريا من انسجه المبيض السيطرة. أولا ، قبل تجانس الانسجه ، كان من الضروري أضافه 8 مل من 0.05 ٪ تريبسين/20 مم أدتا إلى حل الخدمات التلفزيونية أضافه إلى انسجه التحكم المفروم ، تليها الهضم لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة ، وطرد في 200 x g لمده 5 دقائق (انظر بروتوكول الخطوة 2.5). هذا تحسن اعداد الميتوكوندريا. ثانيا ، كان التدرج الكثافة المتقطعة مختلفه لاعداد الميتوكوندريا من انسجه المبيض السيطرة وانسجه سرطان المبيض (الشكل 1). لأنسجه سرطان المبيض تم اعداده من خلال أضافه 5 مل من 34 ٪ ، 8 مل من 30 ٪ ، 12 مل من 25 ٪ (التي تحتوي علي الميتوكوندريا الخام) ، 8 مل من 23 ٪ ، و 3 مل من 20 ٪ التدرج الكثافة المتوسطة من أسفل إلى اعلي في أنبوب. تم العثور علي الميتوكوندريا المنقية في الواجهة بين 25 ٪ و 30 ٪ بعد طرد (الشكل 1ا، انظر بروتوكول الخطوات 1.12 و 1.13). للسيطرة علي انسجه المبيض تم اعداده من خلال أضافه 8 مل من 38 ٪ ، 5 مل من 34 ٪ ، 8 مل من 30 ٪ ، 12 مل من 25 ٪ (التي تحتوي علي الميتوكوندريا الخام) ، 8 مل من 23 ٪ ، و 3 مل من 20 ٪ التدرج الكثافة المتوسطة من أسفل إلى اعلي في أنبوب. في هذه الحالة ، كانت الميتوكوندريا المنقية في النطاق من الواجهة بين 25 ٪ و 30 ٪ إلى الواجهة بين 34 ٪ و 38 ٪ بعد طرد (الشكل 1ب، انظر بروتوكول الخطوات 2.13 و 2.14).
البروتوكول الخاص بعينات الميتوكوندريا عاليه الجودة. عينات الميتوكوندريا عاليه الجودة هي الشرط الأساسي للبروموميات الميتوكوندريا الكمية. قيمت هذه الدراسة نوعيه الميتوكوندريا التي تم اعدادها مع التفاضلية السرعة طرد والكثافة طرد التدرج عن طريق EM (الشكل 2) ولطخه الغربية (WB ، الشكل 3). أظهرت صور EM انه في كل من سرطان المبيض والسيطرة علي انسجه المبيض كانت العضوية الرئيسية المعزولة الميتوكوندريا ، باستثناء كميه صغيره من البيروكسيسوميس. تغيرت مورفولوجية الميتوكوندريا أكثر في سرطانات المبيض من السيطرة علي انسجه المبيض (الشكل 2). أظهرت الصور WB ان المكون الرئيسي في عينات الميتوكوندريا المعدة من سرطانات المبيض والمبيضين التحكم كان الميتوكوندريا ، باستثناء كميه صغيره من البيروكسيسوميس (الشكل 3). وكانت نتائج البنك تتسق مع نتائج البحث والتحقيق. كان من المعقول بالنسبة peroxisomes تماثيل ان تكون موجودة في الميتوكوندريا المعدة ، لان الميتوكوندريا تتفاعل علي نطاق واسع مع peroxisomes3،17،18، والتي بدورها تعكس اكتمال وظيفية من الميتوكوندريا. وأظهرت هذه النتائج الجودة العالية لعينات الميتوكوندريا المعدة.
وكانت كميه البروتين المتقدريه التي أعدت مع هذا البروتوكول كافيه لمزيد من التحليل. من الضروري الحصول علي كميه كافيه من العينات المتقدريه من سرطان المبيض والسيطرة علي انسجه المبيض. جمعت هذه الدراسة عينات الميتوكوندريا أعدت من سبعه انسجه سرطان المبيض ، ومن 11 انسجه المبيض السيطرة3. تم الحصول علي ما مجموعه 2,409 ميكروغرام من عينه البروتين المتقدريه لسرطان المبيض ، و 4,440 ميكروغرام من عينه البروتين الميتوكوندريا للسيطرة علي انسجه المبيض (الجدول 1). عموما ، بالنسبة للبروتينات الكمية iTRAQ العراق ، كل عينه يحتاج علي الأقل 600 ميكروغرام البروتينات (200 ميكروغرام البروتينات في كل الوسم iTRAQ العراق ، 3 نسخ متماثلة). ولذلك ، كانت عينات البروتين الميتوكوندريا المعدة كافيه لتحليل البروتينية الكمية iTRAQ العراق.
تحقيق الحد الأقصى لعدد البروتينات الكمية الفوائد التحقيق المتعمق في الميتوكوندريا في سرطان المبيض البشري. كشفت هذه الدراسة ، وحددت ، وكميه 5,115 البروتينات في سرطانات المبيض مقارنه بالسيطرة علي انسجه المبيض ، بما في ذلك 2,565 (50.14 ٪) البروتينات اوبريجولاتيد (نسبه السرطانات إلى الضوابط > 1) و 2,550 (49.86%) البروتينات المقننة (نسبه السرطانات إلى الضوابط < 1)3 (الجدول 2). وعلاوة علي ذلك ، حددت هذه الدراسة 1,198 mtDEPs بين سرطان المبيض والمبيضين السيطرة مع > 1.5 أو <-1.5 اضعاف التغييرات (p < 0.05) ، بما في ذلك 523 (43.66 ٪) البروتينات اوبريجولاتيد و 675 (56.34%) البروتينات المقننة4 (الجدول 2). هذه البيانات هي حاليا أكبر الشخصية بروسوم الميتوكوندريا في سرطان المبيض.
الشكل 1: تم تنقيه الميتوكوندريا الخام مع طرد التدرج الكثافة المتقطعة لسرطان المبيض (ا) والتحكم في المبيض (ب) الانسجه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صوره الكترون المجهري من الميتوكوندريا المعزولة عن سرطان المبيض (ا) والتحكم في المبيض (ب) الانسجه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الصور الخاصة بالأضداد القائمة علي الأجسام المضادة التي تستند إلى الجسم العضوي من الميتوكوندريا المعزولة عن سرطان المبيض (ا) والانسجه المبيضة (ب) التحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| عينه بروتين الميتوكوندريا | الحجم (μL) | التركيز (ميكروغرام/μL) | البروتينات (ميكروغرام) |
| انسجه سرطان المبيض | 530 | 4.545 | 2,409 |
| التحكم في انسجه المبيض | 750 | 5.92 | 4,440 |
الجدول 1: كميه عينات البروتين المتقدريه المعدة.
| الفئه | عدد البروتينات الاجماليه * | عدد البروتينات التي عبر عنها بمختلف الاختلافات# |
| التنظيم الاحتياطي | 2,565 (50.14%) | 523 (43.66%) |
| التنظيم الأسفل | 2,550 (49.86%) | 675 (56.34%) |
| مجموع | 5,115 (100.0%) | 1,198 (100.0%) |
| * نسبه السرطانات إلى الضوابط هي > 1 للتنظيم الأعلى ، < 1 لأسفل التنظيم. | ||
| # نسبه السرطانات إلى الضوابط هو > 1.5 اضعاف لتنظيم القاعدة ، و <-1.5 اضعاف لأسفل التنظيم. | ||
الجدول 2: عدد البروتينات المحددة في العراق من عينات الميتوكوندريا المعدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التعديلات الميتوكوندريا هي السمة المميزة لسرطان المبيض. طرد التفاضلية السرعة في تركيبه مع التدرج الكثافة طرد بشكل فعال المعزولة وتنقيه الميتوكوندريا من سرطان المبيض البشري والسيطرة علي انسجه المبيض. وكانت عينات الميتوكوندريا المعدة ذات جوده عاليه جدا وكانت مناسبه لمزيد من التحليل الكمي للبروميات.
العينات الميتوكوندريا المعدة التي تحتوي علي كميه صغيره من بيروكسيسوميس3,17,18 والبروتينات السيتووليك19,20. هذا لا ينبغي ان يعتبر مجرد تلوث, لأنها تتفاعل بشكل مباشر أو غير مباشر أو التزام مع الميتوكوندريا للسماح الميتوكوندريا وظيفة أكثر تماما. وقد وجدت الدراسات ان الميتوكوندريا تتفاعل علي نطاق واسع مع الاكتين خلوي19,20 و peroxisomes17,18. لا مفر منه لبعض البروتينات السيتووليك والبروتينات زيادة البيروكسيسوم ان تكون موجودة في عينات الميتوكوندريا معزولة.
وكانت التقنية الرئيسية للكشف عن البروتينات وتحديدها وقياس حجمها من عينات الميتوكوندريا التي تم اعدادها هي الوسم بالعلامات-ccc-LC-MS/MS. حددت هذه الدراسة وكميه 5,115 البروتينات الميتوكوندريا3، بما في ذلك 1,198 mtdeps4،14. وتشمل اليرقات من البروتينات الميتوكوندريا الموجودة في انسجه سرطان المبيض تلك التي يمكن ان تساعد علي فهم دور الميتوكوندريا في مرض سرطان المبيض وأيضا ان يكون موردا لاكتشاف العلاج المستهدف الشخصية علي أساس الأيض الميتوكوندريا8، وحتى العثور علي المؤشرات الحيوية الفعالة علي أساس الجينوم الميتوكوندريا ، بروتيميوميكس ، والأيض من المنهجية متعددة الomics زاوية9،11،12،13. وعلاوة علي ذلك ، مع إدخال المفاهيم البروتينية والأنواع البروتينية في البروتين ، فان الاستكشاف المتعمق لأنواع البروتينات المتقدريه أو النوع البروتيني قد يؤدي مباشره إلى اكتشاف العلامات الحيوية الفعالة والموثوقه والأهداف العلاجية لسرطان المبيض10،21،22.
وعلاوة علي ذلك ، يتم ترجمه البروتوكولات الحالية في تحليل الإنسان المبيض الانسجه الميتوكوندريا البروتينية الموصوفة هنا بسهوله لدراسة الامراض البشرية الأخرى البروتينية الميتوكوندريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد حظي هذا العمل بدعم خطه المواهب في مقاطعه هونان (إلى X.Z.) ، وصندوق مستشفي شيانغيا لتقديم المواهب (إلى XZ) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81572278 و 81272798 إلى XZ) ، والمنح المقدمة من الصين "863" خطه المشروع (المنحة رقم 2014AA020610-1 إلى XZ) ، ومؤسسه هونان للعلوم الطبيعية الاقليميه في الصين (المنحة رقم 14C 7008 إلى XZ). تصورت X.Z. مفهوم المخطوطة الحالية ، وحصلت علي بيانات البروتين البروتيني الكمية لعينات الميتوكوندريا ، وكتبت ونقحت المخطوطة ، ونسقت العمل ذي الصلة ، وكانت مسؤوله عن الدعم المالي وما يقابله من العمل. H.L. اعداد عينات الميتوكوندريا. شاركت S.Q. في العمل الجزئي. شاركت الشركة في كتابه وتحرير اللغة الانجليزيه. N.L. تحليل البيانات البروتينية iTRAQ العراق. ووافق جميع المؤلفين علي المخطوطة النهائية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4--WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M.
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
