Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Beredning av Mitokona från äggstocks cancer vävnader och kontrollera äggstocksvävnad för kvantitativ proteomik analys

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60435
Automatic Translation
1,2,3,4, 5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

Summary

Denna artikel presenterar ett protokoll av differential-Speed centrifugering i kombination med densitet gradient centrifugering att separera mitokonskerna från mänskliga äggstockscancer vävnader och kontrollera äggstocksvävnad för kvantitativ proteomik analys, resulterar i en hög kvalitet mitokondriellt prov och hög genomströmning och hög reproducerbarhet Kvantitativ proteomik analys av en mänsklig äggstockscancer mitokondriell Proteome.

Abstract

Äggstockscancer är en vanlig gynekologisk cancer med hög dödlighet men oklar molekylär mekanism. De flesta äggstockscancer diagnostiseras i det avancerade stadiet, vilket allvarligt hämmar terapi. Mitokondriella förändringar är ett kännetecken för mänskliga äggstockscancer, och mitokondrier är centra för energimetabolism, cellsignalering, och oxidativ stress. Djupgående insikter i förändringar av mitokondriella proteomen i äggstockscancer jämfört med kontroll äggstocksvävnad kommer att gynna djupgående förståelse av de molekylära mekanismerna för äggstockscancer, och upptäckten av effektiva och pålitliga biomarkörer och terapeutiska mål. En effektiv mitokondriell förberedelse metod tillsammans med en isobarisk tagg för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ) kvantitativa proteomik presenteras här för att analysera Human äggstockscancer och kontrollera mitokondriella proteomes, inklusive differential hastighets centrifugering, densitetsgradientcentrifugering, kvalitetsbedömning av mitokondriella prover, proteinnedbrytning med trypsin, iTRAQ-märkning, stark katjonbytarfraktionering (SCX), vätskekromatografi (LC), tandemmasspektrometri (MS/ Databas analys och kvantitativ analys av mitokondriella proteiner. Många proteiner har framgångsrikt identifierats för att maximera täckningen av den mänskliga äggstockscancer mitokondriell proteomet och för att uppnå differentially uttryckt mitokondriell protein profil i mänskliga äggstockscancer.

Introduction

Äggstockscancer är en vanlig gynekologisk cancer med hög dödlighet men oklar molekylär mekanism1,2. De flesta av äggstockscancer diagnostiseras i det avancerade stadiet, som allvarligt hämmar terapi. Mitokondriella förändringar är ett kännetecken för mänskliga äggstockscancer, och mitokondrier är centra för energimetabolism, cellsignalering, och oxidativ stress3,4,5,6,7. Djupgående insikter i förändringar av mitokondriella proteomen i äggstockscancer jämfört med kontroll äggstocksvävnad kommer att gynna djupgående förståelse av de molekylära mekanismerna för äggstockscancer, och upptäckten av effektiva och pålitliga biomarkörer och terapeutiska mål. Mitokondriell metabolism har föreslagits och erkänts som ett mål för cancerbehandling, och antimitokondriell terapi kan i slutändan vara mycket fördelaktigt för att förhindra upprepning och metastaser av cancer8. Individuell metabolisk profilering är också redan praktiseras som ett användbart verktyg för cancer stratifiering och prediktiva strategier9,10.

Det långsiktiga målet med denna forskning är att utveckla och använda en kvantitativ mitokondriell proteomik metod för att studera äggstockscancer för klargörande av mitokondriella proteomförändringar mellan äggstockscancer och kontroll av äggstocks vävnader, och deras molekylära nätverksförändringar från en systematisk multi-omics vinkel11,12, vilket kommer att resultera i upptäckten av mitokonkaniriktade molekylära biomarkörer13 för förtydligande av de molekylära mekanismerna för äggstockscancer, och individanpassad behandling av äggstockscancer patienter. Isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering (itraq) märkning3,4 är en effektiv metod för att kvantifiera mitokondriella protein förändringar. Beredning av högkvalitativa mitokondriella prover från mänsklig äggstockscancer och kontroll äggstocksvävnad är förutsättningen för itraq kvantitativ analys av mitokondriella proteom3. Mitokondriell beredning tillsammans med itraq Kvantitativ proteomik har framgångsrikt använts i långsiktiga forskningsprogram om den humana ovarialcancermitokondrieproteomen, inklusive inrättandet av mitokondriella proteomet referenskartor3, analysen av Differentiellt uttryckt mitokondriella profiler4,14 och post-translationella modifieringar, inklusive fosforylering, som redan har resulterat i upptäckten av viktiga signalering väg nätverk förändringar i mänskliga äggstockscancer5, inklusive förändringar i energimetabolism4, lipid metabolism, och mitophagy Pathway-system3.

Tidigare studier har funnit att differential-Speed centrifugering i kombination med densitet gradient centrifugering är en effektiv metod för att isolera och rena mitokonskerna från mänsklig äggstockscancer och kontrollera äggstocks vävnader3,4,5,14. Itraq-märkningen tillsammans med Strong cation Exchange (SCX)-vätskekromatografi (LC)-tandem mass spektrometri (MS/MS) är den viktigaste tekniken för att upptäcka, identifiera och kvantifiera proteinerna från de preparerade mitokondriella proverna.

Här beskrivs detaljerade protokoll för mitokondriell beredning tillsammans med iTRAQ Kvantitativ proteomik. Dessa har framgångsrikt använts i analysen av mänskliga äggstockscancer vävnad mitokondriella proteomes. Protokollen omfattar beredning av prover, differential hastighet centrifugering, densitet gradient centrifugering, kvalitetsbedömning av mitokondriella prover, proteinnedbrytning med trypsin, iTRAQ märkning, SCX fraktionering, LC, MS/MS, databas sökning, och kvantitativ analys av mitokondriella proteiner. Dessutom, detta protokoll översätter lätt att analysera andra mänskliga vävnad mitokondriella proteomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Äggstocksvävnad prover inklusive äggstockscancer vävnader (n = 7) och normal kontroll äggstocksvävnad (n = 11) användes för detta protokoll. Det nuvarande protokollet3,4,5 är godkänt av xiangya Hospital Medical etik Committee i Central South University, Kina.

1. beredning av mitokona från mänskliga äggstockscancer vävnader

  1. Bered 250 mL av den mitokondriella isoleringsbufferten genom att blanda 210 mM mannitol, 70 mM sackaros, 100 mM kaliumklorid (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diamintetraättiksyra (EDTA), 0,1 mM etylenglykol bis (2-aminoetyleter) tetraättiksyra (EGTA), 1 mM fenylmetanesulfonylfluorid (PMSF) proteashämmare, 2 mM natrium orthovanadate (V), och 0,2% bovint serum albumin (BSA), pH 7,4.
  2. Placera ~ 1,5 g av äggstockscancer vävnader i en ren glas skålen.
  3. Tillsätt 2 mL av den förkylda mitokondriella isoleringsbufferten för att lätt tvätta blodet från vävnadsytan 3x.
  4. Använd ren oftalmisk sax för att helt färs vävnaden i ca 1 mm3 stycken, och överföra de malda vävnaderna till en 50 ml centrifug röret.
  5. Tillsätt 13,5 mL mitokondriell isolerings buffert som innehåller 0,2 mg/mL nagarse, och Använd sedan en elektrisk homogenisator för att homogenisera (Använd skala 2, 10 s 6x, intervall 10 s) de malda vävnaderna (2 min, 4 ° c).
  6. Tillsätt ytterligare 3 mL mitokondriell isoleringsbuffert i vävnadens homogena och blanda dem väl genom pipettering.
  7. Centrifugera den beredda vävnadens homogena (1 300 x g, 10 min, 4 ° c). Avlägsna den råa nukleära fraktionen (dvs. pelleten) och behåll supernatanten.
  8. Recentrifuge supernatanten (10 000 x g, 10 min, 4 ° c). Ta bort mikrosomerna (dvs supernatanten) och behåll pelleten.
  9. Tillsätt 2 mL mitokondriell isoleringsbuffert och Omsuspendera pelleten väl genom lätt pipettering.
  10. Centrifugera pellets upphängningen (7 000 x g, 10 min, 4 ° c). Kassera supernatanten och behåll den råa mitokonsken (dvs. pelleten).
  11. Tillsätt 12 mL 25% densitet gradient medium (dvs., Nycodenz) att Omsuspendera den extraherade rå mitokonen.
  12. Gör en diskontinuerlig densitet gradient genom att fylla ett rör från botten till toppen med 5 mL av 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (som innehåller den råa mitokonsken från steg 1,11), 8 mL 23%, och 3 mL 20% densitet gradient medium, och centrifugera den (52 000 x g, 90 min, 4 ° c).
  13. Använd en lång och trubbig spruta för att samla in den renade mitokonkapen vid gränssnittet mellan 25% och 30% i densitetsgradienten i ett rent rör.
  14. Tillsätt mitokondriell isoleringsbuffert i den insamlade mitokondrier att späda ut den till en trefaldig volym. Centrifugera (15 000 x g, 20 min, 4 ° c) och Kassera supernatanten.
  15. Tillsätt 2 mL mitokondriell isoleringsbuffert för att Omsuspendera pelleten och centrifugera (15 000 x g, 20 min, 4 ° c). Kassera supernatanten och behåll pelleten.
  16. Samla in den slutliga pelleten (dvs. den renade mitokonden) och förvara den vid-20 ° c.
    Notera: kombinera alla renade mitokona från äggstockscancer vävnad som mitokonsameprovet för kvantitativ proteomik analys.

2. beredning av mitokona från mänsklig kontroll äggstocks vävnader

  1. Bered 250 mL av den mitokondriella isoleringsbufferten enligt beskrivningen i steg 1,1.
  2. Placera ~ 1,5 g av den normala kontrollen äggstocks vävnader i en ren glas skålen.
  3. Tillsätt 2 mL förkyld mitokondriell isoleringsbuffert för att lätt tvätta blodet från vävnadsytan 3x.
  4. Använd ren oftalmisk sax för att helt färs vävnaden i ca 1 mm3 stycken, och överföra de malda vävnaderna till en 50 ml centrifug röret.
  5. Tillsätt 8 mL 0,05% trypsin/20 mM EDTA i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till de malda kontroll vävnaderna, och smälta (30 min, rumstemperatur), som hjälper till att lysera vävnader och celler och frigöra mitokonskernas. Centrifugera sedan (200 x g, 5 min). Kassera supernatanten och behåll vävnaderna och cellerna.
  6. Tillsätt 13,5 mL mitokondriell isolerings buffert som innehåller 0,2 mg/mL nagarse, och Använd sedan en elektrisk homogenisator för att homogenisera (Använd skala 2, 10 s 6x, intervall 10 s) de malda vävnaderna (2 min, 4 ° c).
  7. Tillsätt ytterligare 3 mL mitokondriell isoleringsbuffert i vävnadens homogena och blanda dem väl genom pipettering.
  8. Centrifugera den beredda vävnadens homogena (1 300 x g, 10 min, 4 ° c). Avlägsna den råa nukleära fraktionen (dvs. pelleten) och behåll supernatanten.
  9. Recentrifuge supernatanten (10 000 x g, 10 min, 4 ° c). Ta bort mikrosomerna (dvs supernatanten) och behåll pelleten.
  10. Tillsätt 2 mL mitokondriell isoleringsbuffert för att Omsuspendera pelleten väl genom lätt pipettering.
  11. Centrifugera pellets upphängningen (7 000 x g, 10 min, 4 ° c). Kassera supernatanten och behåll den råa mitokonsken (dvs. pelleten).
  12. Tillsätt 12 mL 25% densitet gradient medium för att Omsuspendera den extraherade rå mitokonan.
  13. Gör en diskontinuerlig densitet lutning genom att fylla ett rör från botten till toppen med 8 mL av 38%, 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (innehållande den råa mitokonden från steg 2,12), 8 mL 23% och 3 mL 20% densitet gradientmedium, och centrifugera det (52 000 x g, 90 min, 4 ° c).
  14. Använd en lång och trubbig spruta för att samla in den renade mitokonkapen i intervallet från gränssnittet mellan 25% och 30% till gränssnittet mellan 34% och 38% i en ren slang.
  15. Tillsätt mitokondriell isoleringsbuffert i den insamlade mitokondrier att späda ut den till en trefaldig volym. Centrifugera (15 000 x g, 20 min, 4 ° c) och Kassera supernatanten.
  16. Tillsätt 2 mL mitokondriell isoleringsbuffert för att Omsuspendera pelleten och centrifugera den (15 000 x g, 20 min, 4 ° c). Kassera supernatanten och behåll pelleten.
  17. Samla in den slutliga pelleten (dvs. den renade mitokonden) och förvara den vid-20 ° c.
    Notera: kombinera alla renade mitokondrierna från kontroll äggstockarna vävnad som mitokondriella prover för kvantitativ proteomik analys.

3. verifiering av kvaliteten på mitokondriella prover av renad vävnad

  1. Ta ett rör av renade mitokondriella prover (dvs, pellets från äggstockarna cancer vävnader från steg 1,16 och kontroll äggstockarna vävnader från steg 2,17) för verifiering med elektronmikroskopi (EM).
    Obs: det detaljerade protokollet beskrevs tidigare15,16.
  2. Bered den mitokondriella proteinextraktionsbufferten genom att blanda 8 M urea, 2 M tiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM ditiothreitol (DTT) och 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl) dimetylammonio) -1-propanesulfonat (käkar). Justera pH till 8,52.
  3. Ta ett rör av renade mitokondriella prover (dvs., pellets från äggstockarna cancer vävnader i steg 1,16 och kontroll ovariella vävnader i steg 2,17) och tillsätt mitokondriell proteinextraktion buffert (mitokondriella prover till protein utvinning buffert, 1:5) till Omsuspendera pelleten. Frys proverna i flytande kväve 3x och förvara i rumstemperatur i 2 timmar.
  4. Centrifugera vid 12 000 x g, 30 min, 4 ° c, samla supernatanten (dvs. det extraherade mitokondriella proteinet provet), och mät proteinhalten med en och Acid (BCA) protein assay kit.
  5. Bered 50 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) genom att blanda 9,08 g av Tris och 40 mL ddH2o, justera pH till 8,8 med HCl och lägga till DDH2o till en slutlig volym på 50 ml. Förvaras vid 4 ° c.
  6. Bered 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 6,8) genom att blanda 6,06 g Tris och 40 mL ddH2o, justera pH till 6,8 med HCl och lägga till DDH2o till en slutlig volym på 50 ml. Förvaras vid 4 ° c.
  7. Bered 100 mL 30% akrylamidbis-lösning genom att blanda 29 g akrylamid, 1 g BIS-akrylamid och 80 mL ddH2o och lägga till DDH2o till en slutlig volym på 100 ml. Förvara den i en brun flaska vid 4 ° c.
  8. Förbered 1 000 mL av 10X Tris-Glycine elektrofores buffert genom att blanda 29 g glycin, 58 g av Tris, 3,7 g natriumdodecylsulfat (SDS), och 800 mL ddH2o, och sedan lägga DDH2o till en slutlig volym av 1 000 ml.
  9. Bered 10 mL lastbuffert genom att blanda 2 mL glycerin, 0,02 g bromofenolblått, 0,4 g SDS, 2 mL Tris-HCl pH 6,8 och 7 mL ddH2o, och Lägg sedan till DDH2o till en slutlig volym på 10 ml.
  10. Bered 10 mL 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) som löser gel genom att blanda 4 mL ddH2O, 3,3 ml 30% akrylamid-BIS-lösning, 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml 10% SDS, 0,1 ml 10% ammoniumpersulfat och 0,004 ml tetrametylethylendiamamin (TEMED). Häll SDS-PAGE lösa gel lösning i plattan mellan glasplattorna till nivån på botten av kammen. Tillsätt 2 mL isopropylalkohol på ovansidan. Låt verka i 30 minuter.
  11. Ta bort isopropylalkoholen och tvätta ovansidan med ddH2O 3x. Häll 5% koncentration gel lösning som innehåller 4,1 mL ddH2O, 1,0 ml 30% acylamide-BIS lösning, 0,75 ml av 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 ml 10% SDS, 0,06 ml av 10% ammoniumpersulfat, och 0,006 ml TEMED. Sätt omedelbart in kammen i koncentrations gellösningen, låt verka i 30 min, och ta sedan ut kammen.
  12. Bered 1x Tris-glycinelektrofores buffert genom att späda 100 mL av 10X Tris-Glycine elektrofores buffert med 900 mL ddH2O och häll i den elektroforetiska tanken.
  13. Blanda 30 μg mitokondriella proteiner från äggstockscancer och kontrollera äggstocks vävnader från steg 3,4 med lastbuffert för att nå en slutlig volym på 20 μL. Koka blandningen i 5 min, sedan separera den med 10% SDS-PAGE lösa gel med en konstant spänning på 100 V. När bromfenolblått når botten, stoppa elektrofores.
  14. Bered 1,5 L elektrofores överföringsbuffert genom att blanda 150 mL av 10X Tris-Glycine elektrofores buffert, 1 050 mL ddH2O och 300 ml metanol.
  15. Blötlägg PVDF-membranet i 100% metanol i 10 minuter och i elektroforetisk överföringskortbuffert i minst 5 min. Blötlägg fem ark filtrerpapper i 1x elecrophoretic överföringbuffert i minst 5 min.
  16. Ta ut den SDS-PAGE gel som innehåller proteinerna, och Blötlägg den i elektroforetisk överföringbuffert för 10 min.
  17. Gör en överföring kassett genom att placera en våt svamp på den vita plattan, tre ark våt filterpapper, PVDF membran, SDS-PAGE gel med proteinerna, två ark våt filterpapper, och den våta svampen från botten till toppen. Undvik bubblor.
  18. Placera överförings kassetten i den elektroforetiska tanken, häll i den elektroforetiska överföringbufferten och överför sedan för 2 h under en konstant 200 mA-ström.
  19. Bered 10X Tris-buffrad saltlösning (TBS) genom att blanda 12,114 g Tris, 29,22 g NaCl och lägga till ddH2O till en slutlig volym på 500 ml. Bered 2 L 1x TBST genom att blanda 200 mL 10X msk, 2 mL Tween-20 och 1 798 mL ddH2O. Bered 100 ml blockerande lösning genom att blanda 100 ml tbst och 5 g BSA.
  20. Efter överföring, ta ut PVDF membranet, tvätta lätt i TBST för 5 min, sedan blockera den i blockerande lösning för 1 h vid rumstemperatur.
  21. Inkubera PVDF-membranet (4 ° c över natten) med olika primära antikroppar som är specifika för olika subcellulära organeller, inklusive Lamin B (cellkärna; get anti-human antikropp 1:1 000 blockerande lösning), flotillin-1 (cytomembrane; kanin anti-human antikropp 1:500 blockerande lösning), COX4I1 (mitokonom; kanin anti-human 1:1000 blockerande lösning), GM130 (Golgi apparat; mus anti-human antikropp 1:1000 blockerande lösning), katalas (peroxisome; kanin anti-human antikropp 1:1000 blockering lösning) och cathepsin B (lysosome; kanin anti-human antikropp 1:1000 blockerande lösning). Tvätta lätt i TBST i 5 min 3x.
  22. Inkubera PVDF-membranet för 1 h vid rumstemperatur med motsvarande sekundära antikroppar (kanin anti-get, get anti-kanin, eller get anti-Mouse). Tvätta lätt i TBST i 5 min 3x. Visualisera den med elektrokemiluminescens (ECL).

4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS-analys

Anmärkning: i de detaljerade procedurerna för avsnitt 4 hänvisas till iTRAQ-instruktionerna (tabell över material).

  1. Lägg till SDT-buffert (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7,6, och 100 mM DTT) till de renade mitokondriella proverna (dvs. pellets från äggstockscancer vävnader från steg 1,16 och kontroll äggstockarna vävnader från steg 2,17). Vortexblanda provet tills det inte finns någon synlig fällate.
    Anmärkning: det mitokondriella provet till SDT-buffertkvoten bör vara 1:5.
  2. Koka det SDT-behandlade provet i 5 min, kyl ner provet på is och centrifugera sedan (2 000 x g, 2 min).
  3. Samla supernatanten som extraherade mitokondriella proteinprover och mäta proteinhalten med en BCA protein assay kit.
  4. Ta SDT-extraherade mitokondriella proteiner (200 μg av varje prov) för reduktion, alkylering, matsmältning med trypsin, avsaltning, och lyofilisering3,4. Gör tre replikat för varje prov.
  5. Behandla de tryptiska peptiderna (100 μg av varje prov) från steg 4,4 med 100 mm tetraetylammoniumbromid (pH 8,5) och märk de tryptiska peptiderna med en av de 6-Plex itraq-reagenser som anges i anvisningarna3,4. Märk varje prov 3x.
  6. Blanda lika 6 märkta tryptic peptid prover (tre från äggstockscancer vävnader och tre från kontroll äggstocks vävnader), och torka med en vakuum koncentrator.
  7. Fraktionera de blandade iTRAQ-märkta peptiderna med SCX-kromatografi till 60 fraktioner (en fraktion per 1 min) och kombinera sedan varannan fraktion som ett SCX-fraktionerat prov (n = 30).
  8. Ämne varje SCX-fraktionerat prov till LC-MS/MS-analys på en masspektrometer3,4 tillsammans med ett nano LC-system inom en 60-min LC separation gradient för att få MS/MS data.
  9. Sök efter MS/MS-data för att identifiera proteiner med sökmotorn (tabell över material).
  10. Använd iTRAQ reporter-Ion intensiteter för att kvantifiera varje protein och bestämma mitokondriella differentially uttryckt proteiner (mtDEPs) med en förändring av > 1.5 eller <-1,5 faldigt, och p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det fanns en skillnad i beredningen av mitokonden från äggstockscancer vävnader och kontrollera äggstocks vävnader. Denna studie fann att det var mycket lättare att förbereda mitokonen från äggstockscancer vävnader än från kontroll äggstocks vävnader3,4. Vissa förbättringar måste göras till protokollet för beredning av mitokona från kontroll äggstocks vävnader. Först, före vävnad homogenisering, var det nödvändigt att lägga till 8 mL 0,05% trypsin/20 mM EDTA i PBS lösning läggas till den malet kontroll vävnader, följt av matsmältningen för 30 min vid rumstemperatur, och centrifugering på 200 x g för 5 min (se protokoll steg 2,5). Detta förbättrade beredningen av mitokonen. För det andra var den diskontinuerliga densitetsgradienten annorlunda för beredning av mitokonskerna från kontroll av äggstocks vävnader och äggstockscancer vävnader (figur 1). För äggstockscancer vävnader det var beredd genom att tillsätta 5 mL av 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (som innehåller den råa mitokonskerna), 8 mL 23%, och 3 mL 20% densitet gradient medium från botten till toppen i ett rör. Den renade mitokonanen hittades vid gränssnittet mellan 25% och 30% efter centrifugering (figur 1A, se protokoll steg 1,12 och 1,13). För kontroll av äggstocks vävnader det var beredd genom att tillsätta 8 mL av 38%, 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (som innehåller den råa mitokonskerna), 8 mL 23%, och 3 mL 20% densitet gradient medium från botten till toppen i ett rör. I detta fall var den renade mitokonanen i intervallet från gränssnittet mellan 25% och 30% till gränssnittet mellan 34% och 38% efter centrifugering (figur 1B, se protokoll steg 2,13 och 2,14).

Protokollet obatined hög kvalitet mitokondriella prover. Mitokondriella prover av hög kvalitet är förutsättningen för kvantitativ mitokondriell proteomik. Denna studie utvärderade kvaliteten på mitokonskensom var beredda med differential-Speed centrifugering och densitet gradient centrifugering via EM (figur 2) och Western blot (WB, figur 3). EM-bilder visade att i både äggstockscancer och kontroll äggstocks vävnader de viktigaste organeller isolerade var mitokonen, med undantag för en liten mängd av peroxisomes. Morfologin av mitokonbenerna förändrats mer i äggstockscancer än kontroll äggstocksvävnad (figur 2). WB bilder visade att den viktigaste komponenten i förberedda mitokondriella prover från äggstockscancer och kontroll äggstockarna var Mitochondria, med undantag för en liten mängd peroxisomes (figur 3). WB resultaten överensstämde med EM-resultaten. Det var rimligt för peroxisomes att ingå i förberedda mitokona, eftersom mitokonsamen interagerar mycket med peroxisomes3,17,18, vilket i sin tur återspeglar den funktionella fullständigheten av mitokonsamen. Dessa resultat visade den höga kvaliteten på de förberedda mitokondriella proverna.

Mängden mitokondriellt protein som förberetts med detta protokoll var adekvat för vidare analys. Det är nödvändigt att få en tillräcklig mängd av mitokondriella prover från äggstockscancer och kontroll äggstocksvävnad. Denna studie kombinerade mitokondriella prover som utarbetats av sju äggstockscancer vävnader, och från 11 kontroll äggstocks vävnader3. Sammanlagt 2 409 μg mitokondriellt protein prov erhölls för äggstockscancer, och 4 440 μg mitokondriellt protein prov för kontroll av äggstocksvävnad (tabell 1). Generellt, för iTRAQ Kvantitativ proteomik, varje prov behöver minst 600 μg proteiner (200 μg proteiner per varje iTRAQ märkning, 3 replikat). Därför var de förberedda mitokondriella proteinhalten tillräckliga för iTRAQ-kvantitativ

Uppnåendet av det maximala antalet kvantifierade proteiner gynnar den fördjupade utredningen av mitokona i human äggstockscancer. Denna studie identifierade, identifierade, och kvantifierade 5 115 proteiner i äggstockscancer jämfört med kontroll äggstocksvävnad, inklusive 2 565 (50,14%) upregulerade proteiner (förhållandet mellan cancer och kontroller > 1) och 2 550 (49,86%) nedreglerade proteiner (förhållandet mellan cancer och kontroller < 1)3 (tabell 2). Vidare, denna studie bestäms 1 198 mtDEPs mellan äggstockscancer och kontroll äggstockar med > 1.5 eller <-1,5 Fold förändringar (p < 0,05), inklusive 523 (43,66%) upregulerade proteiner och 675 (56,34%) nerreglerade proteiner4 (tabell 2). Dessa data är för närvarande den största mitokondriella proteonomprofilen i äggstockscancer.

Figure 1
Figur 1: den råa Mitokonskerna renades med diskontinuerlig densitet gradientcentrifugering för äggstockscancer (a) och kontroll äggstockarna (B) vävnader. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: elektronmikrograf bild av mitokonen isolerad från äggstockscancer (a) och kontrollera ovariella (B) vävnader. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: organell-specifika antikroppsbaserade västerländska blot-bilder av mitokonskerna isolerade från äggstockscancer (a) och kontroll av ovariella (B) vävnader. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mitokondriellt protein prov Volym (μL) Koncentration (μg/μL) Proteiner (μg)
Äggstockscancer vävnad 530 4,545 2 409
Kontrollera äggstocksvävnad 750 5,92 4 440

Tabell 1: mängden preparerade mitokondriella proteinprover.

Kategori Antalet proteiner som totalt * Antalet differentially uttryckta proteiner#
Up-förordning 2 565 (50,14%) 523 (43,66%)
Down-förordning 2 550 (49,86%) 675 (56,34%)
Totala 5 115 (100,0%) 1 198 (100,0%)
* Förhållandet mellan cancer och kontroller är > 1 för upp-reglering, < 1 för Down-förordning.
# Förhållandet mellan cancer och kontroller är > 1,5 gånger för upp-reglering, och <-1,5 vika för Down-förordning.

Tabell 2: antalet iTRAQ-identifierade proteiner från preparerade mitokondriella prover.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mitokondriella förändringar är ett kännetecken för äggstockscancer. Beredning av högkvalitativa mitokondrieprover från Human äggstockscancer och kontroll vävnader för storskalig Kvantitativ proteomik gynnar den djupgående förståelsen av mitokondriell funktion i ovarialcancerpatogenes och mitokondriella molekylära nätverksförändringar, och hjälper till att klargöra dess molekylära mekanism för efterföljande upptäckt av mål terapi och effektiva biomarkörer baserade på mitokondrier4,5,8. Den differential-Speed centrifugering i kombination med densitet gradient centrifugering effektivt isolerade och renade mitokonskerna från mänsklig äggstockscancer och kontroll äggstocksvävnad. De förberedda mitokondriella proverna var av mycket hög kvalitet och lämpade för ytterligare Kvantitativ proteomik analys.

De förberedda mitokondriella proverna innehöll en liten mängd av peroxisomes3,17,18 och cytosoliska proteiner19,20. Detta bör inte helt enkelt anses kontaminering, eftersom de direkt eller indirekt interagerar eller följa mitokonsamen att låta mitokonsamefunktion mer fullständigt. Studier har funnit att mitokonsamernas interaktion i stor utsträckning med aktin cytoskelettet19,20 och peroxisomes17,18. Det är oundvikligt för vissa cytosoliska proteiner och peroxisomproteiner att ingå i isolerade mitokondriella prover.

Den viktigaste tekniken för att upptäcka, identifiera och kvantifiera proteiner från de förberedda mitokondriella proverna var iTRAQ-märkning-SCX-LC-MS/MS. Denna studie identifierade och kvantifierade 5 115 mitokondriella proteiner3, inklusive 1 198 mtdeps4,14. Den largenumber av mitokondriella proteiner som finns i äggstockarna cancer vävnader omfattar de som kan bidra till att förstå den roll som mitokondrier i äggstockscancer patogenes och även vara en resurs för upptäckten av personlig mål terapi baserat på mitokondriell metabolism8, och även hitta effektiva biomarkörer baserade på mitokondriell genomik, proteomik och metabolomik från en systematisk multi-omics vinkel9,11,12,13. Dessutom, med införandet av proteoform och protein arter begrepp i proteomen, djupgående utforskning av mitokondriella proteoforms eller protein arter kan direkt leda till upptäckten av effektiva och pålitliga biomarkörer och terapeutiska mål för äggstockscancer10,21,22.

Vidare, de nuvarande protokollen i analys av mänskliga äggstockscancer vävnad mitokondriella proteom beskrivs här är lätt översättas för att studera andra mänskliga sjukdomar mitokondriella proteom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Hunan Provincial Hundred Talent plan (till X.Z.), den Xiangya sjukhus medel för Talent inledning (till XZ), National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr 81572278 och 81272798 till XZ), bidrag från Kina "863" plan Projektet (Grant nr. 2014AA020610-1 till XZ), och Hunan Provincial Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 14JJ7008 till XZ). X.Z. tänkte sig konceptet för föreliggande manuskript, erhöll iTRAQ kvantitativa proteomikdata från mitokonsamproverna, skrev och reviderade manuskriptet, samordnade det relevanta arbetet och ansvarade för det ekonomiska stödet och motsvarande Arbete. H.L. förberett mitokonsamprover. S.Q. deltog i partiellt arbete. X. H. Z medverkade skriftligen och redigerade engelska språket. N.L. analyserade data från iTRAQ proteomik. Alla författare godkände det slutgiltiga manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA protein assay kit Vazyme E112 BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).
Bovine serum albumin (BSA) Solarbio A8020-5G Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98%
Centrifuge XiangYi TDZ4--WS
CHAPS Sigma C9426-5G BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)
Diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma 798681-100G Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98%
DTT Sigma 10197777001 1,4-Dithiothreitol
Easy nLC Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) Sigma E0396-10G BioXtra, ≥97 .0%
Homogenizer SilentShake HYQ-3110
iTRAQ reagent kit Applied Biosystems Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A
Low-temperature super-speed centrifuger Eppendorf 5424R
Mannitol Macklin M813424-100G Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.
MASCOT search engine Matrix Science, London, UK; version 2.2
Nagarse Solarbio P9090
N-hydroxysuccinimide (SDT) Sigma 56480-25G Purum, ≥97.0% (T)
Nycodenz Alere/Axis-Shield 1002424-1
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor Solarbio P0100-1ML PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.
Potassium chloride Macklin P816354-25G Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.
Proteome Discover 1.4 Matrix Science, London, UK
PVDF membrane Millipore 05317 It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
SCX column Sigma 58997 It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco).
Sodium orthovanadate (V) Macklin S817660-25G Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.
Sucrose Macklin S824459-500G Vetec reagent grade, 99%
Thiourea Sigma 62-56-6 ACS reagent, ≥99.0%
Tris base Sigma 10708976001 TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C.
Trypsin (cell culture use) Gibco 25200-056 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.
Urea Sigma U5378-100G powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
  2. Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
  3. Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
  4. Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
  5. Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
  6. Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
  7. Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
  8. Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
  9. Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
  10. Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
  11. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
  12. Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
  13. Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
  14. Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
  15. McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
  16. Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
  17. Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
  18. Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
  19. Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
  20. Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
  21. Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
  22. Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).

Tags

Cancer forskning äggstockscancer mitokondrier differential-Speed centrifugering densitet gradient centrifugering isobaric tagg för relativ och absolut kvantifiering (itraq) märkning stark katjonbytare (SCX) vätskekromatografi (LC) tandem masspektrometri (MS/MS) mitokondriell proteomet
Beredning av Mitokona från äggstocks cancer vävnader och kontrollera äggstocksvävnad för kvantitativ proteomik analys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan,… More

Zhan, X., Li, H., Qian, S., Zhan, X., Li, N. Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis. J. Vis. Exp. (153), e60435, doi:10.3791/60435 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter