Summary
Dit artikel presenteert een protocol van differentiële-snelheid centrifugeren in combinatie met dichtheidsgradiënt centrifugeren te scheiden mitochondriën van menselijke ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve proteomica analyse, resulterend in een hoge kwaliteit mitochondriale monster en hoge doorvoer en hoge reproduceerbaarheid kwantitatieve proteomica analyse van een menselijke ovariële kanker mitochondriale proteome.
Abstract
Ovariële kanker is een veelvoorkomende gynaecologische kanker met een hoge sterfte maar onduidelijk moleculair mechanisme. De meeste ovariële kankers worden gediagnosticeerd in de vergevorderd stadium, die ernstig belemmert therapie. Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van menselijke ovariële kankers, en mitochondriën zijn de centra van energiemetabolisme, cel signalering, en oxidatieve stress. Diepgaand inzicht in de veranderingen van het mitochondriale Proteoom in ovariële kankers in vergelijking met controle ovariumweefsel zal profiteren van diepgaand begrip van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, en de ontdekking van effectieve en betrouwbare biomarkers en therapeutische doelen. Een effectieve mitochondriale bereidingsmethode in combinatie met een isobarische tag voor relatieve en absolute kwantificering (itraq) kwantitatieve proteomica worden hier gepresenteerd om menselijke ovariële kanker te analyseren en mitochondriale proteomes te beheersen, inclusief differentieel toerental centrifugeren, dichtheidsgradiënt centrifugeren, kwaliteitsbeoordeling van mitochondriale monsters, eiwit vertering met trypsine, itraq-labeling, sterke kationen uitwisselings fractionering (SCx), vloeistofchromatografie (LC), tandem massaspectrometrie (MS/ MS), database-analyse en kwantitatieve analyse van mitochondriale eiwitten. Veel eiwitten zijn met succes geïdentificeerd om te maximaliseren van de dekking van de menselijke ovariële kanker mitochondriale Proteoom en het bereiken van de differentiaal uitgedrukt mitochondriale eiwit profiel in menselijke ovariële kankers.
Introduction
Ovariële kanker is een veel voorkomende gynaecologische kanker met hoge sterfte maar onduidelijk moleculair mechanisme1,2. De meeste van ovariële kankers worden gediagnosticeerd in de gevorderde fase, die ernstig belemmert therapie. Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van menselijke ovariële kankers, en mitochondriën zijn de centra van energiemetabolisme, cel signalering, en oxidatieve stress3,4,5,6,7. Diepgaand inzicht in de veranderingen van het mitochondriale Proteoom in ovariële kankers in vergelijking met controle ovariumweefsel zal profiteren van diepgaand begrip van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, en de ontdekking van effectieve en betrouwbare biomarkers en therapeutische doelen. Mitochondriale metabolisme is voorgesteld en erkend als een doelwit voor kankertherapie, en antimitochondrial therapie zou uiteindelijk zeer gunstig zijn voor het voorkomen van de herhaling en metastase van kanker8. Individuele metabole profilering wordt ook al beoefend als een nuttig instrument voor kanker stratificatie en voorspellende strategieën9,10.
Het langetermijndoel van dit onderzoek is het ontwikkelen en gebruiken van een kwantitatieve mitochondriale proteomica-methode om ovariële kanker te bestuderen voor verduidelijking van mitochondriale Proteoom veranderingen tussen eierstokkanker en controle van ovariële weefsels, en hun moleculaire netwerk wijzigingen van een systematische multi-omics hoek11,12, die zal resulteren in de ontdekking van mitochondriën gerichte moleculaire biomarkers13 voor verduidelijking van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, voorspelling en gepersonaliseerde behandeling van ovariële kankerpatiënten. Isobaric-Tags voor relatieve en absolute kwantificering (itraq)-labeling3,4 zijn een effectieve methode om de mitochondriale eiwit veranderingen te kwantificeren. Voorbereiding van hoogwaardige mitochondriale monsters van menselijke ovariële kanker en controle ovariële weefsels zijn de voorwaarde voor iTRAQ kwantitatieve analyse van mitochondriale proteomes3. Mitochondriale voorbereiding in combinatie met itraq kwantitatieve proteomica is met succes gebruikt in langetermijnonderzoek Programma's over de menselijke ovariële kanker mitochondriale Proteoom, met inbegrip van de oprichting van mitochondriale Proteoom referentiekaarten3, de analyse van differentiaal uitgedrukt mitochondriale profielen4,14 en post-translationele modificaties, met inbegrip van fosforylering, die al heeft geresulteerd in de ontdekking van belangrijke signalering traject netwerkveranderingen in menselijke ovariumkanker5, met inbegrip van veranderingen in het energiemetabolisme4, lipide metabolisme, en mitophagy pathway-systemen3.
Eerdere studies hebben geconstateerd dat het differentieel toerental centrifugeren in combinatie met dichtheidsgradiënt centrifugeren een effectieve methode is om mitochondriën te isoleren en te zuiveren van menselijke ovariële kanker en controle van ovariële weefsels3,4,5,14. De iTRAQ labeling in combinatie met sterke kation Exchange (SCX)-vloeistofchromatografie (LC)-tandem massaspectrometrie (MS/MS) is de belangrijkste techniek om te detecteren, identificeren en kwantificeren van de eiwitten uit de voorbereide mitochondriale monsters.
Hier worden gedetailleerde protocollen voor mitochondriale voorbereiding in combinatie met iTRAQ kwantitatieve proteomica beschreven. Deze zijn met succes gebruikt in de analyse van menselijke ovariële kanker weefsel mitochondriale proteomes. De protocollen omvatten de bereiding van monsters, differentiële-snelheid centrifugeren, dichtheidsgradiënt centrifugeren, kwaliteitsbeoordeling van mitochondriale monsters, eiwit vertering met trypsine, iTRAQ-labeling, SCX-fractionering, LC, MS/MS, database zoeken en kwantitatieve analyse van mitochondriale eiwitten. Bovendien vertaalt dit Protocol zich gemakkelijk om andere menselijke weefsel mitochondriale proteomes te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor dit protocol werden eierstokweefsel monsters met inbegrip van eierstokkanker weefsels (n = 7) en normale controle ovariële weefsels (n = 11) gebruikt. Het huidige protocol3,4,5 is goedgekeurd door het xiangya ziekenhuis medisch ethisch comité van Central South University, China.
1. bereiding van mitochondriën van menselijke ovariële kanker weefsels
- Bereid 250 mL van de mitochondriale isolatie buffer door het mengen van 210 mM mannitol, 70 mM sucrose, 100 mM kaliumchloride (KCl), 50 mM tris-HCl, 1 mM diamine tetraazijnzuur (EDTA), 0,1 mM ethyleenglycol bis (2-aminoethyl ether) tetraazijnzuur (EGTA), 1 mM fenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) proteaseremmer, 2 mM natrium orthovanadaat (V) en 0,2% boviene serumalbumine (BSA), pH 7,4.
- Plaats ~ 1,5 g ovariële kanker weefsels in een schone glazen schaal.
- Voeg 2 mL van de voorgekoelde mitochondriale isolatie buffer toe om het bloed licht uit het weefseloppervlak 3x te wassen.
- Gebruik een schone oftalmische schaar om het weefsel volledig in ongeveer 1 mm3 stuks te maken en breng de fijngehakte weefsels over in een centrifugebuis van 50 ml.
- Voeg 13,5 mL mitochondriale isolatie buffer met 0,2 mg/mL nagarse toe en gebruik vervolgens een elektrische homogenisator om te homogeniseren (gebruik schaal 2, 10 s 6x, interval 10 s) de fijngehakte weefsels (2 min, 4 °C).
- Voeg nog eens 3 mL mitochondriale isolatie buffer in het weefsel homogeniteert en meng ze goed door pipetteren.
- Centrifugeer het bereide weefsel homogenaat (1.300 x g, 10 min, 4 °c). Verwijder de ruwe nucleaire fractie (d.w.z. de pellet) en houd het supernatant.
- Recentrifuge het supernatant (10.000 x g, 10 min, 4 °c). Verwijder de microsomen (d.w.z. de supernatant) en houd de pellet.
- Voeg 2 mL mitochondriale isolatie buffer toe en breng de pellet goed door met lichte Pipetteer.
- Centrifugeer de pellet suspensie (7.000 x g, 10 min, 4 °c). Gooi het supernatant weg en houd de ruwe mitochondriën (d.w.z. de pellet).
- Voeg 12 mL 25% dichtheidsgradiënt medium (d.w.z. Nycodenz) toe om de geëxtraheerde ruwe mitochondriën te hervatten.
- Maak een discontinue dichtheidsgradiënt door een buisje van onder naar boven te vullen met 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (met de ruwe mitochondriën uit stap 1,11), 8 mL 23% en 3 mL 20% dichtheidsgradiënt medium, en Centrifugeer het (52.000 x g, 90 min, 4 °c).
- Gebruik een lange en stompe spuit om de gezuiverde mitochondriën op de interface tussen het 25% en 30% dichtheidsgradiënt medium in een schone buis te verzamelen.
- Voeg mitochondriale isolatie buffer in de verzamelde mitochondriën te verdunnen naar een drie-voudige volume. Centrifugeer (15.000 x g, 20 min, 4 °c) en gooi het supernatant weg.
- Voeg 2 mL mitochondriale isolatie buffer toe om de pellet te hervatten en centrifugeer (15.000 x g, 20 min, 4 °c). Gooi het supernatant weg en houd de pellet.
- Verzamel de laatste pellet (d.w.z. de gezuiverde mitochondriën) en bewaar deze bij-20 °C.
Opmerking: Combineer alle gezuiverde mitochondriën van het ovariële kanker weefsel als de mitochondriën monster voor kwantitatieve proteomica analyse.
2. bereiding van mitochondriën van menselijke controle ovariële weefsels
- Bereid 250 mL van de mitochondriale isolatie buffer zoals beschreven in stap 1,1.
- Plaats ~ 1,5 g van de normale controle ovarium weefsels in een schone glazen schaal.
- Voeg 2 mL pre-gekoelde mitochondriale isolatie buffer toe om het bloed licht uit het weefseloppervlak 3x te wassen.
- Gebruik een schone oftalmische schaar om het weefsel volledig in ongeveer 1 mm3 stuks te maken en breng de fijngehakte weefsels over in een centrifugebuis van 50 ml.
- Voeg toe 8 mL van 0,05% trypsine/20 mM EDTA in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de fijngehakte controle weefsels, en Digest (30 min, kamertemperatuur), die helpt om de weefsels en cellen lyse en vrijlating mitochondriën. Vervolgens Centrifugeer (200 x g, 5 min). Gooi het supernatant weg en bewaar de weefsels en cellen.
- Voeg 13,5 mL mitochondriale isolatie buffer met 0,2 mg/mL nagarse toe en gebruik vervolgens een elektrische homogenisator om te homogeniseren (gebruik schaal 2, 10 s 6x, interval 10 s) de fijngehakte weefsels (2 min, 4 °C).
- Voeg nog eens 3 mL mitochondriale isolatie buffer in het weefsel homogeniteert en meng ze goed door pipetteren.
- Centrifugeer het bereide weefsel homogenaat (1.300 x g, 10 min, 4 °c). Verwijder de ruwe nucleaire fractie (d.w.z. de pellet) en houd het supernatant.
- Recentrifuge het supernatant (10.000 x g, 10 min, 4 °c). Verwijder de microsomen (d.w.z. de supernatant) en houd de pellet.
- Voeg 2 mL mitochondriale isolatie buffer toe om de pellet goed te hervatten door lichte Pipetteer mogelijkheden.
- Centrifugeer de pellet suspensie (7.000 x g, 10 min, 4 °c). Gooi het supernatant weg en houd de ruwe mitochondriën (d.w.z. de pellet).
- Voeg 12 mL 25% dichtheidsgradiënt medium toe om de geëxtraheerde ruwe mitochondriën te hervatten.
- Maak een discontinu dichtheidsgradiënt door een buis van onder naar boven te vullen met 8 mL 38%, 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (met de ruwe mitochondriën uit stap 2,12), 8 mL 23% en 3 mL 20% dichtheidsgradiënt medium, en Centrifugeer het (52.000 x g, 90 min, 4 °c).
- Gebruik een lange en stompe spuit om de gezuiverde mitochondriën in het bereik van de interface tussen 25% en 30% te verzamelen tot de interface tussen 34% en 38% in een schone buis.
- Voeg mitochondriale isolatie buffer in de verzamelde mitochondriën te verdunnen naar een drie-voudige volume. Centrifugeer (15.000 x g, 20 min, 4 °c) en gooi het supernatant weg.
- Voeg 2 mL mitochondriale isolatie buffer toe om de pellet te hervatten en Centrifugeer het (15.000 x g, 20 min, 4 °c). Gooi het supernatant weg en houd de pellet.
- Verzamel de laatste pellet (d.w.z. de gezuiverde mitochondriën) en bewaar deze bij-20 °C.
Opmerking: Combineer alle gezuiverde mitochondriën van het controle ovariumweefsel als de mitochondriale monsters voor kwantitatieve proteomica analyse.
3. verificatie van de kwaliteit van de mitochondriale monsters van gezuiverde weefsels
- Neem een buis van gezuiverde mitochondriale monsters (d.w.z. de pellets uit de eierstokkanker weefsels uit stap 1,16 en de controle ovariële weefsels uit stap 2,17) voor verificatie met elektronenmicroscopie (EM).
Opmerking: het gedetailleerde protocol is eerder15,16beschreven. - Bereid de mitochondriale EiwitExtractie buffer door het mengen van 8 M ureum, 2 M thiourea, 40 mm tris, 1 mm EDTA, 130 mm dithiotreïtol (DTT), en 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio) -1-propanesulfonaat (chaps). Stel de pH in op 8,52.
- Neem een buis van gezuiverde mitochondriale monsters (d.w.z. de pellets uit de eierstokkanker weefsels in stap 1,16 en de controle ovariële weefsels in stap 2,17) en voeg mitochondriale EiwitExtractie buffer (mitochondriale monsters aan EiwitExtractie buffer, 1:5) aan respendeer de pellet. Vries de monsters in vloeibare stikstof 3x en bewaar deze bij kamertemperatuur 2 uur.
- Centrifugeer bij 12.000 x g, 30 min, 4 °c, verzamel het supernatant (d.w.z. het geëxtraheerde mitochondriale eiwit monster) en meet het eiwitgehalte met een bicinchonininezuur (BCA) eiwit assay kit.
- Bereid 50 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) voor door 9,08 g tris en 40 mL ddH2o te mengen, de pH op 8,8 aan te passen met behulp van HCl en DDH2o toe te voegen aan een eindvolume van 50 ml. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid 50 mL van 1 M Tris-HCl (pH 6,8) door 6,06 g tris en 40 mL ddH2o te mengen, de pH op 6,8 aan te passen met behulp van HCl en DDH2o toe te voegen aan een eindvolume van 50 ml. Bewaren bij 4 °C.
- Bereid 100 mL van 30% acrylamide-bis-oplossing door het mengen van 29 g acrylamide, 1 g bis-acrylamide en 80 mL ddH2o en DDH2o toe te voegen aan een eindvolume van 100 ml. Bewaar het in een bruine fles bij 4 °C.
- Bereid 1.000 mL van 10x tris-Glycine elektroforese buffer door het mengen van 29 g Glycine, 58 g Tris, 3,7 g natriumdodecylsulfaat (SDS), en 800 mL ddH2o, en vervolgens DDH2o toe te voegen aan een eindvolume van 1.000 ml.
- Bereid 10 ml van de laad buffer door 2 ml glycerine, 0,02 g Broom fenol Blue, 0,4 g SDS, 2 ml tris-HCl pH 6,8 en 7 ml DDH2o te mengen en vervolgens DDH2o toe te voegen aan een eindvolume van 10 ml.
- Bereid 10 mL van 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegel elektroforese (SDS-PAGE) voor het oplossen van gel door 4 mL ddH2O te mengen, 3,3 ml 30% acrylamide-bis oplossing, 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml 10% SDS, 0,1 ml 10% ammonium persulfaat en 0,004 ml tetramethylethyleendiamine (TEMED). Giet de SDS-PAGE het oplossen van de geloplossing in de plaat tussen de glazen platen naar het niveau van de bodem van de kam. Voeg 2 mL isopropylalcohol toe aan de bovenkant. Laat 30 minuten staan.
- Verwijder de isopropylalcohol en was de bovenkant met ddH2O 3x. Giet de 5% concentratie gel oplossing met 4,1 mL ddH2O, 1,0 ml 30% acylamide-bis oplossing, 0,75 ml 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 ml 10% SDS, 0,06 ml 10% ammonium persulfaat en 0,006 ml TEMED. Plaats de kam onmiddellijk in de concentratie-gel-oplossing, laat 30 minuten staan en haal de kam eruit.
- Bereid de 1x tris-Glycine elektroforese buffer door verdunt 100 mL van 10x tris-Glycine elektroforese buffer met 900 mL ddH2O en giet in de elektrofortische tank.
- Meng 30 μg van de mitochondriale eiwitten uit de ovariële kanker en bedien de ovariële weefsels van stap 3,4 met de laad buffer om een eindvolume van 20 μL te bereiken. Kook het mengsel gedurende 5 minuten en scheid het vervolgens met de 10% SDS-PAGE oplossing gel met een constante spanning van 100 V. Wanneer de bromfenol blauw de bodem bereikt, stop de elektroforese.
- Bereid 1,5 L elektroforetisch overdrachts buffer door het mengen van 150 mL 10x tris-Glycine elektroforese buffer, 1.050 mL ddH2O en 300 ml methanol.
- Dompel het PVDF-membraan gedurende 10 min in 100% methanol en breng gedurende ten minste 5 minuten in de elektrofortische overdrachts buffer vijf vellen filtreerpapier in 1x elecrofioretische overdrachts buffer gedurende ten minste 5 min.
- Haal de SDS-PAGE gel met de eiwitten eruit en week deze in de elektrofortische overdrachts buffer gedurende 10 minuten.
- Maak een transfer cassette door een natte spons op de witte plaat te plaatsen, drie vellen NAT filterpapier, het PVDF-membraan, de SDS-PAGE gel met de eiwitten, twee vellen NAT filterpapier en de natte spons van onder naar boven. Vermijd eventuele bubbels.
- Plaats de transfer cassette in de elektrofortische tank, giet in de elektroforetisch overdrachts buffer en breng deze vervolgens over 2 h onder een constante 200 mA-stroom.
- Bereid 10x tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) voor, door 12,114 g Tris, 29,22 g NaCl te mengen en ddH2O toe te voegen aan een eindvolume van 500 ml. Bereid 2 L 1x TBST voor door het mengen van 200 mL 10x TBS, 2 mL tween-20 en 1.798 mL ddH2O. bereid 100 ml van de blokkerende oplossing door 100 ml TBST en 5 g BSA te mengen.
- Na de overdracht, neem het PVDF-membraan, was lichtjes in TBST gedurende 5 minuten, en Blokkeer het in blokkerende oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incuberen het PVDF-membraan (4 °C 's nachts) met verschillende primaire antilichamen die specifiek zijn voor verschillende subcellulaire organellen, waaronder Lamin B (celkern; geit anti-humaan antilichaam 1:1.000 blokkerende oplossing), flotillin-1 (cytomembrane; konijn anti-mens antilichaam 1:500 blokkerende oplossing), COX4I1 (mitochondrion; konijn anti-humane 1:1000 blokkerende oplossing), GM130 (Golgi-apparaat; muis anti-humaan antilichaam 1:1000-blokkerende oplossing), katalase (Peroxisome; konijn anti-humaan antilichaam 1:1000 blokkering oplossing), en door B (lysosome; konijn anti-humaan antilichaam 1:1000 blokkerende oplossing). Lichtjes wassen in TBST voor 5 min 3x.
- Inbroed het PVDF-membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met de corresponderende secundaire antilichamen (konijn-anti-geit, geit-anti-konijn of geit-anti-muis). Lichtjes wassen in TBST voor 5 min 3x. Visualiseer het met electrochemiluminescentie (ECL).
4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS-analyse
Opmerking: de gedetailleerde procedures voor sectie 4 verwijzen naar de iTRAQ-instructies (tabel met materialen).
- Voeg SDT-buffer (4% SDS, 100 mM tris-HCl pH 7,6 en 100 mM DTT) toe aan de gezuiverde mitochondriale monsters (d.w.z. de pellets uit de eierstokkanker weefsels uit stap 1,16 en de controle ovariële weefsels uit stap 2,17). Vortex het monster totdat er geen zichtbaar precipitaat is.
Opmerking: het mitochondriale monster tot SDT-buffer verhouding moet 1:5 zijn. - Kook het SDT-behandelde monster gedurende 5 minuten, koel het monster af op ijs en centrifugeer vervolgens (2.000 x g, 2 min).
- Verzamel de supernatant als de geëxtraheerde mitochondriale eiwit monsters en meet het eiwitgehalte met een BCA eiwit assay kit.
- Neem SDT-geëxtraheerde mitochondriale eiwitten (200 μg van elk monster) voor reductie, alkylatie, spijsvertering met trypsine, ontzilting en lyofilisatie3,4. Voer drie replicaties uit voor elk voorbeeld.
- Behandel de tryptische peptiden (100 μg van elk monster) uit stap 4,4 met 100 mm tetraethylammoniumbromide oplossing (pH 8,5) en label de tryptische peptiden met een van de 6-Plex itraq-reagentia volgens de instructies3,4. Label elk voorbeeld 3x.
- Meng even 6 gelabelde tryptische peptide monsters (drie van eierstokkanker weefsels en drie van de controle ovariële weefsels) en droog met een vacuümconcentrator.
- Fractioneren de gemengde iTRAQ-gelabelde peptiden met SCX-chromatografie in 60 fracties (één fractie per 1 min), dan combineren elke twee fracties als een SCX-fractioneerd monster (n = 30).
- Onderwerp elke SCx-fractionated monster aan LC-MS/MS analyse op een massaspectrometer3,4 in combinatie met een nano LC-systeem binnen een 60-min LC scheiding gradiënt om MS/MS-gegevens te verkrijgen.
- Doorzoek de MS/MS-gegevens om eiwitten te identificeren met de zoekmachine (tabel met materialen).
- Gebruik de iTRAQ reporter-Ion-intensiteiten om elk eiwit te kwantificeren en bepaal mitochondriale differentiaal uitgedrukte eiwitten (mtDEPs) met een verandering van > 1.5 of <-1,5 fold, en p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er was een verschil in de voorbereiding van de mitochondriën van ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels. Deze studie vond dat het veel gemakkelijker was om mitochondriën te bereiden van eierstokkanker weefsels dan van controle ovariële weefsels3,4. Enkele verbeteringen moesten worden aangebracht in het protocol voor de bereiding van mitochondriën van controle ovariële weefsels. Ten eerste moest voorafgaand aan de weefselhomogenisatie 8 mL van 0,05% trypsine/20 mM EDTA in de PBS-oplossing worden toegevoegd die aan de weefsels van het fijngehakte besturings weefsel werd aangevuld, gevolgd door een spijsvertering gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeren bij 200 x g gedurende 5 minuten (zie protocol stap 2,5). Dit verbeterde de voorbereiding van de mitochondriën. Ten tweede was de discontinue dichtheidsgradiënt verschillend voor de bereiding van mitochondriën van controle ovariële weefsels en eierstokkanker weefsels (Figuur 1). Voor eierstokkanker weefsels het werd bereid door toevoeging van 5 mL van 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (met de ruwe mitochondriën), 8 mL 23%, en 3 mL 20% dichtheidsgradiënt medium van onder naar boven in een buis. De gezuiverde mitochondriën werden gevonden op het raakvlak tussen 25% en 30% na centrifugeren (Figuur 1A, zie protocol stappen 1,12 en 1,13). Voor controle ovariële weefsels werd bereid door toevoeging van 8 mL 38%, 5 mL 34%, 8 mL 30%, 12 mL 25% (met de ruwe mitochondriën), 8 mL 23%, en 3 mL 20% dichtheidsgradiënt medium van onder naar boven in een buis. In dit geval, de gezuiverde mitochondriën waren in het bereik van de interface tussen 25% en 30% aan de interface tussen 34% en 38% na centrifugeren (Figuur 1B, zie protocol stappen 2,13 en 2,14).
Het protocol obatined hoge kwaliteit mitochondriale monsters. Hoge kwaliteit mitochondriale monsters zijn de voorwaarde voor kwantitatieve mitochondriale Proteomics. Deze studie evalueerde de kwaliteit van de mitochondriën die werden bereid met differentiële-snelheid-centrifugeren en dichtheid gradiënt centrifugeren via EM (Figuur 2) en Western Blot (WB, Figuur 3). EM beelden toonden aan dat in zowel ovariële kankers en controle ovarium weefsels de belangrijkste organellen geïsoleerd waren mitochondriën, behalve een kleine hoeveelheid peroxisomes. De morfologie van de mitochondriën veranderde meer in ovariële kankers dan controle ovariumweefsel (Figuur 2). WB-beelden toonden aan dat de belangrijkste component in voorbereide mitochondriale monsters van ovariële kankers en controle-eierstokken mitochondriën was, behalve een kleine hoeveelheid peroxisomes (Figuur 3). De resultaten van de WB waren consistent met de EM-resultaten. Het was redelijk voor peroxisomes te worden opgenomen in de bereide mitochondriën, omdat mitochondriën interactie uitvoerig met peroxisomes3,17,18, die op zijn beurt weerspiegelen de functionele volledigheid van de mitochondriën. Deze resultaten toonden de hoge kwaliteit van de voorbereide mitochondriale monsters.
De hoeveelheid mitochondriale eiwit bereid met dit protocol was voldoende voor verdere analyse. Het is noodzakelijk om te verkrijgen van een voldoende hoeveelheid mitochondriale monsters van ovariële kanker en controle ovariële weefsels. Deze studie combineerde de mitochondriale monsters bereid uit zeven ovariële kanker weefsels, en uit 11 controle ovarium weefsels3. Een totaal van 2.409 μg van mitochondriale eiwit monster werd verkregen voor ovariële kankers, en 4.440 μg van mitochondriale eiwit monster voor controle ovariumweefsel (tabel 1). Over het algemeen heeft elk monster voor iTRAQ kwantitatieve proteomica minstens 600 μg eiwitten (200 μg eiwitten per elke iTRAQ-labeling, 3 replicaten) nodig. Daarom waren de voorbereide mitochondriale eiwit monsters voldoende voor itraq kwantitatieve proteomica-analyse.
De verwezenlijking van het maximum aantal gekwantificeerde eiwitten profiteert van het grondige onderzoek van mitochondriën in menselijke ovariële kanker. Deze studie ontdekte, geïdentificeerde en gekwantificeerde 5.115 eiwitten in eierstokkanker in vergelijking met controle ovariumweefsel, met inbegrip van 2.565 (50,14%) upregulated eiwitten (verhouding van kankers tot controles > 1) en 2.550 (49,86%) gedowngereguleerde eiwitten (verhouding van kankers tot besturingselementen < 1)3 (tabel 2). Verder, deze studie bepaald 1.198 mtDEPs tussen ovariële kankers en controle eierstokken met > 1.5 of <-1,5 fold veranderingen (p < 0,05), met inbegrip van 523 (43,66%) upregulated eiwitten en 675 (56,34%) gedowngereguleerde eiwitten4 (tabel 2). Deze gegevens zijn momenteel het grootste mitochondriale Proteoom profiel bij eierstokkanker.
Figuur 1: de ruwe mitochondriën werden gezuiverd met discontinue dichtheid gradiënt centrifugeren voor eierstokkanker (A) en controle van ovariële (B) weefsels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: elektron microscoop afbeelding van mitochondriën geïsoleerd van eierstokkanker (A) en controle ovariële (B) weefsels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Organellespecifieke op antilichamen gebaseerde Western Blot beelden van mitochondriën geïsoleerd van eierstokkanker (A) en controle ovariële (B) weefsels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Mitochondriaal eiwit monster | Volume (μL) | Concentratie (μg/μL) | Eiwitten (μg) |
| Ovariële kanker weefsel | 530 | 4,545 | 2.409 |
| Controle ovariumweefsel | 750 | 5,92 | 4.440 |
Tabel 1: de hoeveelheid bereide mitochondriale eiwit monsters.
| Categorie | Het aantal totale eiwitten * | Het aantal differentiaal uitgedrukt eiwitten# |
| Up-regulatie | 2.565 (50,14%) | 523 (43,66%) |
| Down-regulatie | 2.550 (49,86%) | 675 (56,34%) |
| Totale | 5.115 (100,0%) | 1.198 (100,0%) |
| * De verhouding tussen kankers en controles is > 1 voor up-Regulation, < 1 voor down-regulatie. | ||
| # Verhouding van kankers tot controles > 1.5 vouwen voor up-regulatie, en <-1,5 fold voor down-regulatie. | ||
Tabel 2: het aantal met iTRAQ geïdentificeerde eiwitten uit geprepareerde mitochondriale monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van ovariële kanker. Voorbereiding van hoogwaardige mitochondriale monsters van menselijke ovariële kanker en controle weefsels voor grootschalige kwantitatieve proteomica profiteren van de diepgaande kennis van de mitochondriale functie in ovariële kanker pathogenese en mitochondriale moleculaire netwerkveranderingen, en helpen verduidelijken het moleculaire mechanisme voor latere ontdekking van de doelgroep therapie en effectieve biomarkers op basis van mitochondriën4,5,8. De differentiële snelheid centrifugeren in combinatie met dichtheidsgradiënt centrifugeren effectief geïsoleerd en gezuiverde mitochondriën van menselijke ovariële kanker en controle ovariële weefsels. De voorbereide mitochondriale monsters waren van zeer hoge kwaliteit en waren geschikt voor verdere kwantitatieve proteomica-analyse.
De voorbereide mitochondriale monsters bevatte een kleine hoeveelheid peroxisomes3,17,18 en cytosolische eiwitten19,20. Dit moet niet alleen worden beschouwd als besmetting, omdat ze direct of indirect interactie of zich houden aan mitochondriën om mitochondriën te laten functioneren meer volledig. Studies hebben geconstateerd dat mitochondriën communiceren uitgebreid met de actine cytoskelet19,20 en peroxisomes17,18. Het is onvermijdelijk voor sommige cytosolische eiwitten en peroxisomale eiwitten worden opgenomen in geïsoleerde mitochondriale monsters.
De belangrijkste techniek voor het opsporen, identificeren en kwantificeren van eiwitten uit de voorbereide mitochondriale monsters was iTRAQ labeling-SCX-LC-MS/MS. Deze studie geïdentificeerd en gekwantificeerd 5.115 mitochondriale eiwitten3, met inbegrip van 1.198 mtdeps4,14. De een van mitochondriale eiwitten gevonden in de eierstokkanker weefsels omvat degenen die kunnen helpen om te begrijpen van de rol van mitochondriën in ovariële kanker pathogenese en ook een bron voor de ontdekking van gepersonaliseerde doel therapie op basis van mitochondriale metabolisme8, en zelfs het vinden van effectieve biomarkers op basis van mitochondriale genomica, proteomics en metabolomica uit een systematische multi-omics hoek9,11,12,13. Bovendien kan, met de introductie van proteoforme en eiwit soorten concepten in het proteome, een grondige verkenning van mitochondriale proteoforms of eiwit soorten direct leiden tot de ontdekking van effectieve en betrouwbare biomarkers en therapeutische doelen voor eierstokkanker10,21,22.
Bovendien, de huidige protocollen in de analyse van menselijke ovariële kanker weefsel mitochondriale proteomes beschreven hier zijn gemakkelijk vertaald om te studeren andere menselijke ziekte mitochondriale proteomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het Hunan Provincial Hundred talent plan (to X.Z.), de Xiangya Hospital funds for talent Introduction (to XZ), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 en 81272798 tot XZ), de subsidies uit China "863" plan Project (Grant No. 2014AA020610-1 tot en met XZ), en de Hunan Provincial Natural Science Foundation van China (Grant No. 14JJ7008 tot XZ). X.Z. bedacht het concept voor het huidige manuscript, verkreeg de itraq kwantitatieve proteomica gegevens van mitochondriën samples, schreef en reviseerde het manuscript, coördineerde het relevante werk en was verantwoordelijk voor de financiële steun en de bijbehorende Werk. H.L. bereide mitochondriën monsters. S.Q. deelgenomen aan gedeeltelijk werk. X. H. Z nam deel aan schriftelijke en bewerkte Engelse taal. N.L. analyseerden de itraq proteomica-gegevens. Alle auteurs keurden het eind manuscript goed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4--WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
References
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
