Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Undersøgelse af virkningerne af tumor-Udskillede paracrine Ligands på makrofag aktivering ved hjælp af co-kultur med permeable membran støtter
Chapters
Summary November 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en metode ved hjælp af gennemtrængelig membran understøtninger til at lette studiet af ikke-kontakt paracrine signalering anvendes af tumorceller til at undertrykke immunresponset. Systemet er modtagelig for at studere rollen som tumor-udskillede faktorer i dæmpning makrofag aktivering.
Transcript
Denne Transwell co-kultur metode bruges til at studere parakrine signalering bruges af tumorceller til at undertrykke immunrespons. Denne metode kan bruges til at opdage nye hemmelige ligander, samt den mekanistiske grundlag for deres immun undertrykkende virkninger. Vi har tidligere brugt denne metode til at vise, hvordan tumor-udskilles faktorer kan dæmpe makrofag pro-inflammatorisk gen transskription.
Vi mener, at dette værktøj har vidtrækkende konsekvenser i studiet af tumor-afledt immun undertrykkelse. En af de vigtigste fordele ved denne teknik er, at det kan bruges til at studere parakrine signalering mellem tumorceller og immunceller uden potentielt confounding variabel af celle-til-celle kontakt. Denne platform er også modtagelig for en række molekylære biologiske teknikker til downstream analyse.
Efter høst peritoneal makrofager, plade dem direkte ind i de øverste kamre i en 0,4 mikrometer polyester membran indsætte co-kultur seks-godt plade. Derefter tilsættes suppleret DMEM til brønden, således at det øverste kammer indeholder en milliliter og det nederste kammer indeholder 1,5 milliliter. Inkuberes i tre dage ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.
Første, kultur kommercielt tilgængelige tumorceller i deres respektive medium, efter ATCC anbefalede væv kultur metoder. Vask derefter de klæbende tumorceller én gang med PBS. Tilføj 0,05% trypsin i EDTA og inkubere ved 37 grader Celsius, indtil cellerne løsne.
Derefter re-suspendere cellerne i medier, der indeholder FBS. Brug et hæmocytometer eller celletæller til at kvantgøre det samlede antal celler og centrifuge ved 220 gange G i fem minutter for at pelletere. Under centrifugering, aspirere mediet fra de øvre og nedre kamre i makrofaget indeholder permeable membran støtte plader og erstatte med frisk medium.
For de nederste kamre, hvor tumorceller vil blive belagt, fyldes med en milliliter medium i stedet for 1,5 milliliter til at forlade tilstrækkelig volumen til celletilsætning. Når centrifugering er færdig, aspirere mediet fra de pelleterede tumorceller og re-suspendere cellerne i suppleret DMEM i en koncentration på 300, 000 celler pr. milliliter. Tilsæt 0,5 milliliter af denne celle suspension til det nederste kammer af de ønskede brønde.
At fremkalde makrofag proinflammatoriske genekspression, behandles singly eller co-kultiverede makrofager ved at tilsætte interferon gamma ved en koncentration på 100 nanogram pr. milliliter og LPS i en koncentration på 50 nanogram pr. milliliter. Varier varigheden af behandlingstider i kulturen efter behov. Makrofag aktivering sker inden for to timer, og nogle tumor-medieret undertrykkelse sker ved otte timer.
Co-kultur i 24 timer giver robust og konsekvent tumor-afledt undertrykkelse. Som en negativ kontrol, kultur makrofager singly og lad ubehandlet. Som en positiv kontrol behandles enkeltkulturerede makrofager med interferongamma og LPS i de samme koncentrationer, der anvendes til prøverne.
Når den ønskede inkubationstid er gået, isoleres cellelysatet eller tilstandskulturmedium som ønsket afhængigt af testbehovene. For at isolere cellen lysatet til kvantitativ polymerase kædereaktion analyse, aspirere mediet fra begge kamre i brønden og vask én gang med to milliliter PBS. Anvend RNA lysis buffer på det øverste kammer, der indeholder makrofagerne.
Derefter skrabes membranen forsigtigt for at frigive cellen lysate og overføre den til et opsamlingsrør til videre behandling i henhold til RNA-isolationskitproducentens protokol. Den co-kultur metode, der er beskrevet her indebærer kultur makrofager og tumorceller uden fysisk kontakt. Peritoneal makrofager dyrket i mangel af tumorceller anvendes som negative og positive kontroller.
Peritoneal makrofag co-dyrket i overværelse af B16F10 tumorceller, men uden at aktivere stimuli ikke øge udtryk for pro-inflammatoriske associerede gener. Dette indebærer, at tumor-udskilles ligander er enten ikke tilstrækkelige til at fremkalde pro-inflammatoriske genekspression af sig selv, eller hvis der er immun aktivering af tumor sekreter, parakrine ligands er tilstrækkelige til at undertrykke det til sit oprindelige niveau. Denne co-kultur metode illustrerer, at når makrofager polariseret af interferon gamma og LPS er dyrket i nærvær af tumorceller, undertrykkelse af inflammation-associerede genekspression blev reduceret med så meget som 60% En sammenlignelig niveau af makrofag pro-inflammatorisk genundertrykkelse er observeret, når murine makrofag celle linje J774 er erstattet af peritoneal makrofager.
Tidligere arbejde har identificeret protein S som en tumor-udskilles faktor, der kan hæmme makrofag aktivering, så den gennemtrængelige membran støtte co-kultur model bruges sammen med en lysA at analysere koncentrationen af protein S i konditionerede medier efter 24 timer. I betinget medier fra interferongamma og LPS-behandlede B16F10 melanomceller udtrykkes protein S i en koncentration på ca. 475 nanogram pr. milliliter. Peritoneale makrofager behandlet under de samme betingelser udtrykt protein S på ca 61 nanogram per milliliter.
Interessant, når co-kulturperler, koncentrationen af protein S i interferon gamma og LPS-behandlede godt var ca 86 nanogram per milliliter. Dette tyder på, at enten makrofager indtage tumor-udskilles protein S eller at mængden af protein S udskilles af B16F10 celler er væsentligt faldet, når i nærvær af makrofager. Disse resultater fremhæver dybtgående ændringer af makrofag aktivering og parakrine signalering, når makrofager er co-kulturperler med tumorceller.
Transwells co-culture-metode kan besvare en række spørgsmål vedrørende parakritiske signalering. Western blot analyse kunne udføres for at bestemme, hvordan tumor-udskilles proteiner ændre forskellige signalering veje i makrofager.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
