Summary
Detta protokoll är för opartisk detektion av vävnads-associerade bakterier i patientbiopsier av 16S rRNA in situ hybridisering och konfokal mikroskopi.
Abstract
Visualisering av samspelet mellan bakterier med värd slemhinnor ytor och vävnader kan ge värdefull insikt i mekanismerna för patogenes. Medan visualisering av bakteriella patogener i djurmodeller av infektion kan förlita sig på bakteriestammar konstruerade för att uttrycka fluorescerande proteiner som GFP, visualisering av bakterier i slemhinnan i biopsier eller vävnad som erhållits från mänskliga patienter kräver en opartisk metod. Här beskriver vi en effektiv metod för detektion av vävnads-associerade bakterier i human biopsi sektioner. Denna metod utnyttjar fluorescerande in situ hybridisering (fisk) med en fluorescerande märkt Universal oligonukleotide sond för 16s rRNA till etikett vävnads-associerade bakterier inom urinblåsan biopsi sektioner förvärvade från patienter som lider av återkommande urinvägsinfektion. Genom användning av en universell 16S rRNA sond, bakterier kan upptäckas utan tidigare kunskap om arter, släkten, eller biokemiska egenskaper, såsom lipopolysackarid (LPS), som skulle krävas för detektion genom immunofluorescensexperiment. Vi beskriver ett komplett protokoll för 16S rRNA fisk från biopsi fixering till avbildning av konfokalmikroskopi. Detta protokoll kan anpassas för användning i nästan alla typer av vävnad och utgör ett kraftfullt verktyg för opartisk visualisering av kliniskt relevanta bakteriella-värd interaktioner i patientens vävnad. Med hjälp av arter eller släkspecifika sonder kan detta protokoll dessutom anpassas för detektion av specifika bakteriella patogener inom patient vävnad.
Introduction
Urinvägarna, bestående av urinröret, urinblåsan, urinvägarna och njurarna utsätts ständigt för bakterier som utgör urinvägarna mikrobiomet samt invaderande uropatogener, som uropatogena E. coli (upec), från mag-tarmkanalen 1,2. Ett skikt av hydrerat slem bestående av glykosaminoglykaner och en ogenomtränglig plack av glykosylerat uroplakin proteiner uttrycks på ytan av de ytliga cellerna bildar en barriär som rutinmässigt skyddar blåsan epitel från invasion av anhängare bakterier3,4. Under urinvägsinfektion (uti), dessa hinder störs eller förstörs, underlätta fastsättning till och invasion av urinblåsan epitel av uropatogena bakterier5,6. Arbete i murina modeller har visat att många uropatogena bakterier inklusive UPEC, Klebsiella pneumoniae, och Enterococcus faecalis kan bilda replikativa intracellulära samhällen (IBCs) inom cytoplasman i ytliga celler och quiescent intracellulära reservoarer (qirs) inom övergångs epitelceller7,8,9. Även om UPEC har identifierats inom Shed epitelceller från Human UTI patienter, interaktionen mellan uropatogener med urinblåsan slemhinnan hos människor hade inte tidigare visualiserats10.
Vi anpassade en gemensam teknik, fluorescens i situ hybridisering (fisk), att upptäcka bakterier i slemhinnan i urinblåsan biopsier erhållits från postmenopausala patienter som genomgår cystoskopi med elektrofulguration av uretrit (Ceft) för den avancerade hantering av återkommande antibiotika refraktära UTI11. Med hjälp av en universell sond för 16S rRNA, vi kunde objektivt upptäcka bakteriearter i samband med urinblåsan slemhinnan av återkommande UVI patienter och bestämma deras position inom urinblåsan väggen12. Universal 16s rRNA nukleotid PROBE har tidigare utformats för att rikta en bevarad region av bakterien 16s rRNA13, vilket motsvarar positionerna 388-355 i E. coli 16s rRNA. 16s rRNA och rusning sond sekvenser har tidigare validerats och publicerats för användning i mus mag-tarmkanalen14,15. Avsonens sekvenser och egenskaper beskrivs i tabell 1. Det är viktigt att använda två sekventiella avsnitt i detta protokoll, en för 16s rRNA sonden och en för rusning sonden, för att kunna skilja mellan sann och bakgrunds signal som urinblåsan epitel, kollagen och elastin uppvisar autofluorescence16 . I detta protokoll, 16s rRNA och rusning sonder utformades med fluorescerande Alexa fluor 488 etiketter på både 3 ' och 5 ' Termini via N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester kopplingar för att öka fluorescerande signal.
Även om detta protokoll har utvecklats för användning på human urinblåsan biopsi sektioner, det kan lätt anpassas för användning på paraffin-inbäddade sektioner från någon vävnad där bakterier tros vistas. Till skillnad från immunohistokemiska experiment som riktar sig mot specifika antigener (t. ex. lipopolysackarid) på bakteriens yta, kräver denna metod inga förkunskaper om antigener som uttrycks av de vävnadsassocierade bakterierna10,17 . Användning av Universal 16S rRNA sond möjliggör opartisk detektion av alla bakteriearter i provet men tillåter inte bestämning av deras identitet. För att bestämma identifiera identifierade bakterier, arter eller släkte-specifika 16S eller 23S rRNA sonder måste användas. Detta protokoll kommer inte heller att upptäcka svamp patogener, såsom Candida albicans, i samband med värd vävnad. För detektion av svamppatogener, 28S eller 18S rRNA sonder måste användas18.
Protocol
Studieprotokollet godkändes av och följde riktlinjerna från de institutionella Biosäkerhets-och kemikalie säkerhets kommittéerna i UT Dallas och UT Southwestern Medical Center. Användningen av biopsier från försökspersoner i detta protokoll godkändes av och följde riktlinjerna från de institutionella gransknings nämnderna i UT Dallas och UT Southwestern Medical Center. Alla personer som arbetar med biopsi insamling och bearbetning har aktuella mänskliga ämnes skydd (HSP) och HIPPA utbildning.
1. vävnads beredning för fixering och paraffin inbäddning
Anmärkning: Biopsier togs från samtyckande kvinnor som genomgår cystoskopi med Electro-fulguration av uretrit för avancerad hantering av återkommande urinvägsinfektion (Ruti). rUTI definieras som 3 UTIs under en 12-månadersperiod. Biopsi insamling utfördes i operationssalen medan patienten var under anestesi efter att ha fått informerat samtycke per UTSW IRB protokoll STU 082010-016. Alla prover var kodade och avidentifierade före experimenterande.
- Få en kall-kopp (~ 1 mm3) biopsi från urinblåsan trigone med urologiska pinpett via flexibla cystoskop och placera omedelbart i en steril 2 ml cryovial innehållande 1,5 ml 4% v/v PARAFORMALDEHYD (PFA) beredd i 1x steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
Anmärkning: 4% PFA i 1x PBS kan göras i förväg och förvaras vid-20 ° c tills det behövs. - Fix biopsi för 6 h vid rumstemperatur eller för 16-24 h vid 4 ° c.
Anmärkning: Bindningstiden ska beräknas baserat på vävnads provets storlek och överfixering bör undvikas. Det rekommenderas inte att använda glutaraldehyd som en fixativ som det introducerar autofluorescence. - I en steriliserad huva eller biosäkerhetsskåp, ta bort fixativ genom pipettering och Ersätt med 1,5 mL steril 1x PBS. Förvara proverna vid 4 ° c över natten eller omedelbart utföra vävnads bearbetning och paraffin inbädda19.
- Använd en steriliserad mikrotom till sektions vävnads block med en tjocklek på 5 μm och följ delar av paraffin vävnad till laddade glas Mikroskop diabilder. Minst två bilder per biopsi kommer att krävas för 16S rRNA FISH Protocol.
Anmärkning: Biopsi vävnaden bör korsa sektionellt ordnade i förhållande till det skärande planet för att säkerställa visualisering av uroteliala skikt i alla sektioner. Det bör också noteras att snittjockleken bör optimeras för bakteriell upptäckt av samhället. Tunnare sektioner eller provtagning av flera serie avsnitt kan krävas vid infektioner där vävnads hemvist bakterier är ytterst knappa (t. ex. < 1 vävnad bosatt bakterie per 1 000 däggdjursceller).
2. Fluorescence in situ hybridisering med Universal 16S rRNA sonder
Anmärkning: Två bilder per biopsi krävs. En bild behövs för Universal 16S rRNA sond och en bild för en kontroll sond med en förvrängd sekvens. Detta är viktigt för att skilja sann signal från bakgrunds signalen under mikroskopi eftersom blåsan epitel är Auto-fluorescerande i flera kanaler. Förutom den rusning sonden, blockering med 0,1% Sudan Black B före montering kan minska bakgrunden autofluorescence inneboende i vävnaden20.
- Beredning av reagenser och draghuv
- Rengör en tom draghuv (eller lämpligt monterad biosäkerhetsskåp) med 70% etanol.
- Bered hybridiseringsbufferten bestående av 0,9 M natriumklorid (NaCl), 20 mM Tris-HCl (pH 7,2), 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS) i 10 mL sterilt filtrerat vatten.
Anmärkning: Sterilt filtrerat vatten kan beredas genom att man passerar autoklav destillerat vatten genom ett filter på 0,22 μM. Hybridiserings bufferten kan förvaras i rumstemperatur, men SDS kan fällas ut från lösning. Om SDS fälls, värm lösningen i ett vattenbad i 50 ° c före användning. - Bered minst 100 mL vardera av 95% och 90% etanol i sterilt filtrerat vatten i tvättade, autoklaverade flaskor.
- Lös upp fluorescerande lyofiliserade prober i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) och 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), som bereds i filtersteriliserat nukleasfritt vatten till en slutlig koncentration på 100 μM. Bered en utspädning på 1 μM i TE-bufferten för användning i detta protokoll. Förvara både 100 μM koncentrerat lager och 1 μM lager beredd sonder vid-20 ° c skyddas från ljus.
Anmärkning: Lös inte fluorescerande märkta prober i vatten. Buffring krävs för att förhindra hydrolys av NHS Ester Bond konjugering av fluorophore till nukleotidsonden. - Rengör fem Coplin burkar med 70% etanol, låt torka, etikett enligt följande: xylener I, xylener II, 95% EtOH, 90% EtOH, DDH2O, och fyll med 100 ml av lämplig lösning. Detta kommer att bidra till att undvika förvirring i senare steg.
- Vävnad de-paraffinisering och rehydrering
- I huven, placera två bilder per biopsi i en vertikal bild rack.
- Placera ett vertikalt glid rack i xylener i Coplin burk (innehållande 100 ml xylener) i 10 min.
- Ta bort glid stället från xylener i och torka av undersidan på en pappershandduk för att avlägsna överflödiga xylener. Placera i xylener II Coplin burken i 10 min.
Anmärkning: Arbeta aldrig med xylener utanför en certifierad draghuv. - Rehydrera deparaffinized vävnad sektioner i successiva etanol tvättar (95% och 90%) för 10 min vardera i respektive märkta Coplin burkar.
Anmärkning: Under detta skede, varm hybridisering buffert till 50-56 ° c i ett vattenbad - Ta bort bild stället från 90% etanol tvätt, blot botten på pappershanddukar för att ta bort överflödig etanol, och placera i ddH2o Coplin burk som innehåller 100 ml filtersteriliserad DDH2o för 10 min.
- I väntan på ddH2O tvätta, späd sonderna till 10 nm i hybridisering buffert för att skapa färgningslösningen. Bered 150 μL Färgnings lösning per bild.
Anmärkning: Skydda Färgnings lösning från ljus genom att Linda rören i aluminiumfolie och lagra i en låda. När du arbetar med fluorescerande märkta prober på bänkskiva, Överväg att stänga av overhead ljus när det går. Sonder som späds i hybridiserings buffert bör inte återanvändas.
- Hybridisering och motfärgning
- Förbered en befuktnings kammare för varje sond genom att placera blöt, skrynklig Kimwipe och sterilt vatten till reservoaren av en P1000 Tip låda. Placera Tip Holder-kassetten på-Top-det är där bilderna kommer att sitta.
Anmärkning: Det är viktigt att använda en fuktande kammare för att förhindra biopsi sektioner från uttorkning under hybridisering. Det bör noteras att kommersiellt tillgängliga befuktare kammare är utformade för att upprätthålla en stabil, fuktig atmosfär. Men den teknik som beskrivs här kontrollerar tillräckligt fuktighet vid betydligt mindre kostnad. - Ta bort bilderna från bild stället och placera dem på en ny pappershandduk (vävnads sidan uppåt). Använd en Kimwipe för att torka av bilden. Var noga med att bara försiktigt badda nära (inte på) biopsi avsnitt att veke bort vatten. Med hjälp av en hydrofoba penna, rita en kant runt biopsi sektionen och placera bilden vävnad sida upp i befuktning kammaren.
Anmärkning: Arbeta snabbt så att vävnaderna inte torkar ut före hybridisering. - Placera befuktning kammaren i en inkubator inställd på 50 ° c. Pipettera över 50-150 μL av infärgnings lösningen direkt ovanpå vävnaden så att rektangeln som är tillverkad av den hydrofoba gränsen runt vävnaden fylls. Var noga med att inte lägga för mycket lösning som att översvämma den hydrofoba gränsen. Stäng boxen försiktigt.
- Inkubera över natten (~ 16 h) vid 50 ° c i mörker. Om inkubatorn har ett fönster, täck den med aluminiumfolie för att skapa en mörk miljö.
Anmärkning: För tillförlitlig signal krävs en hybridiseringstemperatur under fisk sondens smälttemperatur. 50 ° c är den optimala temperaturen för Universal 16S rRNA sond, men kanske inte optimalt för andra sonder. - Följande morgon, Förbered minst 500 mL tvättbuffert som består av 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) i ddH2O och filtersterilisera i en steril flaska med ett vakuum Flask topp filter. Värm till 50-56 ° c i ett vattenbad.
- Ta bort glasen från de fuktande kamrarna och dra försiktigt bort eventuell kvarvarande hybridiseringslösning med Kimwipe. Placera bilderna i ett vertikalt färg rack.
- Placera infärgnings stället i en ogenomskinlig Coplinburk innehållande 100 mL förvärmda tvättbuffert i 10 min. Om Coplinburkar inte är ogenomskinliga (t. ex. glas), placera dem i mörkret under inkubering steg-kanske under en låda eller i en låda.
- Upprepa TVÄTTNINGSSTEGET två gånger med ny tvättbuffert i nya Coplin-burkar.
- Under tvätt stegen, Förbered motfläcken genom att späda en 100 μg/mL stamlösning av Hoechst 33342 1:1000 i tvättbuffert. Till samma rör, tillsätt Alexa-555 vetegroddar kall (WGA) till en slutlig koncentration av 5μg/ml och Alexa-555 phalloidin till en slutlig koncentration av 33 nm. Förvara i mörker tills den är klar för användning.
Anmärkning: Hoechst, Alexa-555 WGA, och Alexa-555 Phalloidin etikett DNA, mucin/uroplakins, och Actin, respectively och Maj bli läggat upp lång-tid i mörker per fabrikanten ' instruktionerna. Fluorescerande etiketter som används för sonder och motfläckar kan anpassas för de filteruppsättningar som finns tillgängliga för det Mikroskop som ska användas. - Ta bort bilderna från den sista tvätten och försiktigt veke bort överflödig tvättbuffert med en Kimwipe. Placera bilderna vävnad sida upp på en pappershandduk och tillsätt 50-150 μL av Counter-Stain direkt ovanpå vävnaden så att den hydrofoba gränsen är fylld, men inte överfyllda. Täck upp till fyra bilder med en kryobox-topp och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Placera sidorna tillbaka i infärgning rack och tvätta två gånger mer i Coplin burkar med färsk tvättbuffert, för 10 min vardera.
- Torka noggrant av bilderna efter den sista tvätten och placera vävnads Sidan upp på en pappershandduk under en kryobox-topp. Pressa en droppe monteringsmaterial direkt ovanpå vävnaden. Försiktigt placera en lämpligt storlek täckslip (beror på biopsi storlek) ovanpå. Tryck försiktigt ut alla bubblor som de kommer att störa Imaging och låta locket-gled glider att bota över natten i mörkret.
- Nästa dag, täta kanterna på täckglas till bilden med ett ljust skikt av klart nagellack. Låt torka i 10 min i mörkret och förvara sedan i mörkret vid 4 ° c för konfokalmikroskopi.
- Förbered en befuktnings kammare för varje sond genom att placera blöt, skrynklig Kimwipe och sterilt vatten till reservoaren av en P1000 Tip låda. Placera Tip Holder-kassetten på-Top-det är där bilderna kommer att sitta.
3. visualisering av 16S rRNA fisk av konfokalmikroskopi
Anmärkning: För detta protokoll uppnås bästa resultat med ett laserscannerkonfokalmikroskop med 63x och 100x mål. Rätt filteruppsättningar för visualisering av Hoechst, Alexa-488, och Alexa-555 fluorescens krävs. Standard fluorescerande mikroskopi kan dock användas om ett konfokal Mikroskop inte är tillgängligt. Detta protokoll är för ett laserskanning konfokala Mikroskop.
- Slå på det konfokala mikroskopet och den datorprogramvara som associeras med mikroskopet per tillverkarens instruktioner.
- Ladda bilden och visualisera med 10X mål i den blå (DAPI/Hoechst) kanal. Fokusera noga tills kärnor är synliga.
- När fokuserade, ändra målet till hög förstoring (63x eller 100x). Tillsätt olja ovanpå locket slip. Fokusera med det nya målet, att se till att objektivlinsen kommer i kontakt med olja samtidigt som fokus.
Anmärkning: Använd endast finfokusering vid hög förstoring (63x eller 100x). Olja bör endast användas för ett olje mål. - Snabbt bedöma varje bild genom ögat-bit i den gröna (eGFP/Alexa-488) kanal för att avgöra vilka diabilder är fisk positiva och som är fisk negativ.
Anmärkning: Det är bäst om denna första bedömning/scoring görs förblindad av en separat individ för att minska experimentell bias. - För att avbilda de färgade biopsier, börja med en fisk positiv bild och växla till datorn visualiserings läge. Välj kanalerna 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Ställ in hål med den längsta våglängd kanal, i detta fall 555. Hitta rätt fokalplan för visualisering av märkta bakterier i 488-kanalen. Utan att ändra fokalplanet, Ställ in förstärkning, lasereffekt och offset för varje kanal så att signalen inte är mättad, och bakgrunden är inte överrättad. Hämta bilden i alla tre kanalerna.
Anmärkning: Använd samma inställningar för 488-kanalen för att avbilda varje bild i ett experiment. Lasereffekten kan kräva justering i kanalerna 405 och 555 om det optimala fokalplanet för bakteriell visualisering ändras mellan fält. - Upprepa på ytterligare fält tills du förvärvar bilder av hela epitelial ytan.
Anmärkning: Du kan behöva ändra fokalplanet något för att visualisera märkta bakterier i olika områden, men aldrig ändra förstärkning, lasereffekt, eller offset för 488 kanal mellan fält. Om man arbetar på ett konfokalmikroskop kan det vara informativt att fånga en Z-stack så att den tredimensionella lokaliseringen av bakterierna i vävnaden kan analyseras. - Bearbeta bilder och kvantifiera märkta bakterier inom eller i samband med vävnaden med ImageJ eller liknande programvara. Minimal bearbetning av bilderna rekommenderas (t. ex. uppdelning/sammanslagning av kanaler och konvertering till bildfiler), även om bakgrundskorrigering kan utföras vid behov. Alla korrigeringar eller andra ändringar bör förbli konsekventa mellan bilderna.
Representative Results
Protokollet har optimerats för opartisk detektion av bakterier i samband med urinblåsan slemhinnan i paraffin-inbäddade urinblåsan biopsi sektioner. Figur 1 visar representativa konfokalmikrografer från ett experiment som använder detta protokoll på delar av urinblåsan biopsier som erhållits från kvinnor med återkommande urinvägsinfektion. Två seriella sektioner hybridiserades med antingen Universal 16s rRNA (övre paneler) eller rusning (nedre paneler) sonder. Bilder från samma region av vävnaden togs och bakterier (grön) är klart synlig i vävnaden hybridiseras med 16s rRNA sonder och inte med rusning sonden. Figur 2 representerar ett falskt positivt resultat. Signal som motsvarar autofluorescent kollagen eller elastin upptäcks i 405 och 488 kanaler i både 16s rRNA och rusning sond-hybridiserade biopsi avsnitt belyser vikten av att alltid använda en rusning sond kontroll.
| Sond | Sekvens | Tm | Fluorophore | Koppling |
| Universal 16S rRNA | 5 '-GCTGCCTCCC GTAGGAGT-3 ' |
54,9 | Alexa-488 (5 ' och 3 ') | NHS Ester |
| Rusning | 5 '-ACTCCTACGG GAGGCAGC-3 ' |
Na | Alexa-488 (5 ' och 3 ') | NHS Ester |
Tabell 1: fisk sond sekvenser och egenskaper. TM indikerar smälttemperatur och NHS är en förkortning för N-hydroxysuccinimide.
Figur 1: representativa konfokala mikrografer av fisk av Universal 16s rRNA och rusning sond i en mänsklig urinblåsan biopsi. Actin och mucin är märkta i rött, cellulära kärnor är märkta i blått, och bakterier i grönt. Vävnads-associerade bakterier upptäcks endast med 16SrRNA sonden och inte Scramble. Bilder tagna med 63x förstoring. Skalstapel = 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa konfokalmikrografer av falskt positiva gröna autofluorescence i en human urinblåsa biopsi. Actin och mucin är märkta i rött, cellulära kärnor är märkta i blått, och bakterier och autofluorescent komponenter i den extracellulära matrisen (t. ex. kollagen och elastin) är gröna. Grön fluorescens observeras med både 16s rRNA och rusning sonder indikerar ett falskt positivt resultat. Bilder tas vid 63x förstoring. Skalstapel = 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för detektion av vävnads-associerade bakterier i human urinblåsan biopsier av 16S rRNA FlSH. Detta protokoll kan lätt anpassas för biopsier tagna från andra vävnader, såsom mag-tarmkanalen eller huden, och kan utvidgas till vävnader som skördats från en mängd olika däggdjurs modell organismer. Det protokoll som beskrivs här kan också anpassas till användningen av multipla fixeringsmedel (t. ex. Formalin, etanol, methacarn) och vävnads beredningstekniker (t. ex. paraffin eller harts inbäddade och kryopreserverade vävnader). Den dubbel-märkt Universal 16S rRNA sond möjliggör opartisk detektion av alla bakteriearter som finns inom vävnad och kan ge värdefull insikt i hur patogener och bakterieflora rumsligt interagerar med slemhinnor ytor i sjukdom och friska Stater. Med hjälp av resurser som probeBase, PhylOPDb eller PROBE_DESIGN verktyget för ARB programpaket för urval eller utformning av arter eller släkten-specifika 16S eller 23S rRNA sonder, detta protokoll kan anpassas för detektion av specifika bakteriearter eller släkten inom vävnaden15,21,22. En viktig framtida riktning för denna metod är multiplexering med hjälp av art-eller släkspecifika sonder märkta med olika, diskreta fluoroforer för utvärdering av mikrobiell mångfald i urinblåsan slemhinnan.
Den primära begränsningen av denna metod för användning på mänskliga exemplar är tillgången på biopsier vävnad. Institutionellt granskningsnämnd godkännande och informerat samtycke från patienten krävs för att erhålla biopsier och direkt samarbete med den kliniker som utför ingreppet är nödvändigt för optimal provinsamling och tillgång till patientens metadata. CEFT-förfarandet i sig förstör blåsan epitel så vi kunde motivera biopsi av dessa områden innan förfarandet. En draghuv eller ett lämpligt monterat biosäkerhetsskåp krävs för detta protokoll på grund av användning av giftiga xylener i avparaffinering steg och behovet av att upprätthålla en steril miljö under hela förfarandet. Ett fluorescerande Mikroskop, helst konfokala, med en 63x eller en 100x mål och lämpliga filteruppsättningar för visualisering av Hoechst, Alexa-555, och Alexa-488 krävs för detta protokoll. De representativa resultat som skildras i figur 1 avbildades med hjälp av ett konfokalmikroskop med laserskanning. Liknande laserscanning Mikroskop bör producera jämförbara bilder. Detta protokoll begränsas av dess förmåga att endast upptäcka vävnads-associerade bakterier och inte, till exempel, svampar. Sonder specifika svampen 18S eller 28S rRNA måste användas för att identifiera svamppatogener inom vävnad18.
Kritiska steg till detta protokoll inkluderar att upprätthålla en steril miljö under hela förfarandet och se till att vävnaden inte torkar ut mellan hybridisering och färgning steg. Om vävnaden torkar ut under ingreppet, kan signalen dämpas eller vävnaden kan falla av i bilden under ett tvättsteg. Det är också viktigt att alltid använda två seriella sektioner för detta protokoll-en för 16s rRNA sond och en för rusning sonden. Utan denna kontroll kan det vara mycket svårt att urskilja falska positiva identifieringar och de data som erhålls kanske inte är användbara eller informativa. Om detta protokoll anpassas för användning med en annan sond än den universella 16S rRNA-sonden, måste försiktighet iakttas för att välja en lämplig hybridiseringstemperatur, cirka 5 ° c lägre än sondens beräknade smälttemperatur. För att bibehålla signalintensiteten får vävnaden inte utsättas för ljus under långa tidsperioder efter det att sonden har tillsatts och får inte överexponeras under mikroskopi. Slutligen, under mikroskopi samma inställningar för den kanal som motsvarar fluorophore konjugerat till fisk sonden måste hållas konsekvent mellan den experimentella (16S rRNA sond) och kontroll (Scramble sond) diabilder. Visualisera den rumsliga relationen mellan bakterier inom slemhinnor ytor av patient-härledda vävnader är avgörande för att förstå och bygga kliniskt relevanta hypoteser om värd-patogenen interaktioner underliggande infektionssjukdom.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi skulle vilja tacka Kim Orth och Marcela de Souza Santos för protokoll råd och Amanda Arute för teknisk support. Detta arbete stöddes delvis av Cecil H. och Ida Green Chair i systembiologi Science som innehas av K.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
| Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
| Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
| Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
| Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
| Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
| Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
| Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
| Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
| 0.22 μm syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |
References
- Abraham, S. N., Miao, Y. The nature of immune responses to urinary tract infections. Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).
- Wolfe, A. J., et al. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).
- Grist, M., Chakraborty, J. Identification of a mucin layer in the urinary bladder. Urology. 44 (1), 26-33 (1994).
- Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. Uroplakins in urothelial biology, function, and disease. Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).
- Ingersoll, M. A., Albert, M. L. From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa. Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).
- Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).
- Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria. Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).
- Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), (2013).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women. Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).
- De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. , (2019).
- Amann, R. I., et al. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).
- Vaishnava, S., et al. The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine. Science. 334 (6053), 255-258 (2011).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
- Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures. Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Ludwig, W., et al. ARB: a software environment for sequence data. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).
- Jaziri, F., et al. PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification. Database (Oxford). , (2014).
