Summary
Her beskriver vi en veksttilstand for å kultur den lille kolonivarianten av Pseudomonas aeruginosa. Vi beskriver også to separate metoder for deteksjon og kvantitasjon av exopolysakkaridalgatet produsert av P. aeruginosa ved hjelp av en tradisjonell uronisk syrekarbazolanalyse og et algonalt spesifikt monoklonalt antistoff (mAb) basert ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk Gram-negativ bakteriell patogen, kan overprodusere et exopolysakkaridalgin som resulterer i en unik fenotype kalt mucoidy. Alginat er knyttet til kroniske lungeinfeksjoner som resulterer i dårlig prognose hos pasienter med cystisk fibrose (CF). Forstå banene som regulerer produksjonen av algetrekkan hjelpe i utviklingen av nye terapeutiske strategier rettet mot den algeiske formasjonen. En annen sykdomsrelatert fenotype er den lille kolonivarianten (SCV). SCV skyldes den langsomme veksten av bakterier og ofte forbundet med økt motstand mot antimikrobielle midler. I dette papiret viser vi først en metode for å kulturing en genetisk definert form av P. aeruginosa SCV på grunn av pyridin biosyntese mutasjoner. Tilskudd av nitrogenholdige baser, uracil eller cytosin, returnerer den normale veksten til disse mutantene, og viser tilstedeværelsen av en redningsvei som scavenges frie baser fra miljøet. Deretter diskuterer vi to metoder for måling av bakteriell alginat. Den første metoden er avhengig av hydrolysen av polysakkarid til sin uronic acid monomer etterfulgt av avledningmed en kromogen reagens, karbazole, mens den andre metoden bruker en ELISA basert på en kommersielt tilgjengelig, algon-spesifikk mAb. Begge metodene krever en standard kurve for kvantasjon. Vi viser også at den immunologiske metoden er spesifikk for alginatkvantifisering og kan brukes til måling av alginat i de kliniske prøvene.
Introduction
Kroniske lungeinfeksjoner med Pseudomonas aeruginosa er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet hos pasienter med cystisk fibrose (CF). I tidlig barndom koloniseres pasienter av flere bakterielle patogener, inkludert ikke-mucoid isolater av P. aeruginosa1,2. Fremveksten av den lille kolonivarianten (SCV) isolerer samt mucoid isolater er en markør for utbruddet til kroniske infeksjoner. SCV isolater er svært resistente3 på grunn av deres langsomme vekstrater4, noe som gjør dem en alvorlig avskrekkende i behandling regimenter og andre kroniske infeksjoner5 av P. aeruginosa. Arbeid av Al Ahmar et al.6 viste en sammenheng mellom SCV og mucoidy knyttet sammen av de novo pyrimidine biosyntese. Pyrimidinsult, på grunn av mutasjoner i gener involvert med pyrimidinproduksjon, resulterte i SCV fenotype i nonmucoid referansestammen PAO1 og mucoidderivatet PAO581 (PAO1mucA25).
Selv om alginat overproduksjon er en viktig sykdomsmarkør for kroniske lungeinfeksjoner i CF, er det ikke klart om det er en direkte sammenheng mellom mengden alginat og lungepatologi, og det er uklart om alginat kan brukes som prognosemarkør for behandling7. Alginatproduksjonen er hovedsakelig regulert av to operoner, en regulatorisk operon (algUmucABCD)8,9 og biosyntetisk operon (algD operon)10,11. Algiat produksjonen er tett regulert av sigma faktor AlgU9,12 (også kjent som AlgT) og nedbrytning av anti-sigma faktor MucA13. Evnen til å overvåke produksjonen av alginatin in situ fra pasientenes sputumprøver kan hjelpe til med utviklingen av nye terapeutiske alternativer.
Her beskriver vi en veksttilstand som oppdager tilstedeværelsen av SCV forårsaket av mutanter som ikke kan syntetisere pyrimidin de novo. Tilskudd av uracil og/eller cytosin, nitrogenholdig base av pyrimidinnukleotid, til mediet aktiverer bergingsveien, og gjenoppretter dermed den normale veksten i mutanter. Denne vekstmetoden for disse spesifikke SCV-mutantene kan brukes som en screeningmetode for å identifisere pyrimidinmutasjoner i pasientprøver. I tillegg diskuterer vi to metoder for deteksjon og måling av alginat produsert og utskilt av P. aeruginosa. Den første er den tradisjonelle metoden14,15,16 for å forringe polysakkarid ved hjelp av en høy konsentrasjon av syre og deretter legge til en kolormetrisk indikator for å kvantate konsentrasjonen i prøven. Den andre metoden, utviklet i vårt laboratorium, benytter enzymet-linked immunosorbent analyse (ELISA) ved hjelp av en anti-algonat monoklonalt antistoff (mAb) utviklet av QED Biosciences. ELISA-metoden viser seg å være mer spesifikk og følsom enn uronisk syreanalyse og gir sikrere bruk på grunn av unngåelse av den svært konsentrerte svovelsyre. Med elisas evne til å brukes direkte på pasientprøver for å måle alginat, kan det utvikles som et overvåkingsdiagnostisk verktøy for å følge mengden alginat tilstede i lungene i forskjellige perioder av infeksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SCV vekstforhold og fysiologisk aktivering av bergingsveien
- Påvisning av SCV.
- Streak P. aeruginosa stammer PAO1, PAO1ΔpyrD,PAO581, og PAO581ΔpyrD på prewarmed Pseudomonas isolasjon agar (PIA) plater og vokse på 37 ° C for 48 h. På vekstplaten identifiserer du en enkelt koloniisolat som har SCV-fenotypen (kolonistørrelse på 1-3 mm i motsetning til den normale 3-5 mm kolonistørrelsen).
- Gjenta trinn 1.1.1 for å oppnå en ren isolat av SCV.
MERK: Veksten kan kreve opptil 72 timer på grunn av den langsomme veksten i SCV-koloniene.
- Fysiologisk aktivering av bergingsveien.
- Bruk en steril inokulasjonssløyfe, velg SCV-kolonien fra PIA-platen og strek på en forhåndsoppvarmet PIA supplert med 0,1 mM uracil. Vokse plate ved 37 °C i 24-48 timer.
MERK: Alle PIA-plater som brukes i denne protokollen inneholder 20 ml/l glyserol som legges til blandingen før autoklaving. Etter autoklaving og etter blandingtemperaturen er under 55 °C tilsett 11,21 mg/l uracil (0,1 mM) til væskemediet før du heller plater. Denne metoden vil bidra til å identifisere pyrimidinmutasjoner som forårsaker SCV fenotype i P. aeruginosa. Hvis SCV fenotypen er et resultat av nevnte mutasjon, vil normal kolonivekst og størrelse (3-5 mm) bli observert på uracil supplerte PIA-plater. Hvis stammer hadde evnen til å produsere alginat, vil mucoid fenotypen også komme tilbake ved uracil tilskudd.
- Bruk en steril inokulasjonssløyfe, velg SCV-kolonien fra PIA-platen og strek på en forhåndsoppvarmet PIA supplert med 0,1 mM uracil. Vokse plate ved 37 °C i 24-48 timer.
2. Uronic Acid Carbazole Analyse
- Fra en ren kultur av ønsket belastning som skal testes, identifiser en enkelt koloni. Bruk en steril tannpirker, velg kolonien, og plasser tannpirken i et kulturreagensrør som inneholder 5 ml Pseudomonas isolasjonsbuljong (PIB). Vokse i en shaker inkubator ved 37 °C i 24 timer.
MERK: Følgende stammer PAO581 (PAO1mucA25),PAO581carA,PAO581carBog PAO581pyrD ble dyrket på PIA plater eller PIA plater supplert med 0,1 mM uracil å høste alginat for måling. - På en prewarmed PIA plate tilsett 150 μL kultivert PIB kjøttkraft (for 15 mm x 100 mm plater) eller 450 μL kjøttkraft (for 15 mm x 150 mm plater). Bruk en steril cellespreder, spre buljongen over platen. Kokoppen ved 37 °C i 24 timer.
MERK: Aspirer overflødig væske, om noen, fra platen ved hjelp av en pipt ved å tippe platen til den ene siden. Både PIB- og PIA-plater som brukes i protokollen inneholder 20 ml/l glyserol som skal brukes av celler som karbonkilde for å hjelpe til med alginatproduksjon. - Bruk en pipettekontroller og en steril 50 ml pipette, tilsett 0,85% NaCl til plenen dyrket og samle prøven ved å skrape platen ved hjelp av en cellespreder. Aspirer prøven ved hjelp av en frisk 50 ml pipett i et 50 ml oppsamlingsrør. Vortex prøven på høy for å blande og plassere prøvene på is.
MERK: Volumet på tilsatt 0,85% NaCl varierer avhengig av størrelsen på platen. For plater på 15 mm x 100 mm bruker du 10–30 ml og i plater på 15 mm x 150 mm, bruk 20–50 ml. - Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) av prøvene ved å legge til 1 ml av prøven til en engangscuvette og lese OD ved hjelp av et spektrotometer. Gjenta dette trinnet 2x for å få en triplicate av leser for hver prøve.
- Tilsett 3 ml svovelsyre/borratløsning i kulturrør og la sitte på is. Tilsett 350 μL av den innsamlede prøven SAKTE til syreblandingen i reagensrørene og virvelen på lav kort tid.
- Forbered borate lager ved å legge 10.099 g kaliumhydroksid (KOH) pulver til 45 ml vann. Tilsett 24,74 g borsyre (H3BO3)til blandingen og ta volumet til 100 ml.
- Legg 1 L flaske i en vask med is og fyll flaske med 500 ml konsentrert svovelsyre. Tilsett langsomt 15 ml av den tilberedte boratebestanden. La flasken avkjøles.
- Legg til ytterligere 10 ml borate lager for totalt 25 ml. Når flasken er avkjølt, ta volumet til 1 L.
FORSIKTIG: Denne metoden er avhengig av bruk av svært konsentrert svovelsyre. Riktig personlig verneutstyr bør brukes for å sikre at prøveprøvens sikkerhets- og riktig avhendingsprotokoll skal følges.
MERK: For en positiv kontroll en kjent konsentrasjon av D-mannuronic syre og/eller en kjent bakteriell alginat prøver høstet og renset gjennom alginat produsere stammer av P. aeruginosa (f.eks: PAO581-PAO1mucA25). For en negativ kontroll bruk 0,85% NaCl løsning og / eller PAO1ΔalgD (In-frame sletting av algD genet som gjør bakteriene helt ute av stand til å produsere alginat). Flere rør kan gjøres fra hver prøve for å øke antall tekniske repetisjoner for å hjelpe til med statistisk analyse. Forbered 3-5 rør av hver prøve.
- Tilsett 100 μL 0,1% karbazol i etanoloppløsning til syre/prøveblanding. Cap røret og vortex på middels innstilling for 5 s. Plasser i et tørt bad ved 55 °C i 30 min.
- Etter inkubasjon, fjern rørene og virvelen kort på høy og la avkjøles i 5 min.
MERK: Farge som skal sees ville være en nyanse av lilla. Fargen vil forbli stabil for måling i 1−2 timer. - Les OD530 i hvert rør ved å legge til 1 ml av blandingen til en ren cuvette og lese OD av prøvene ved 530 nm på et spektrotometer. Bruk røret med 0,85% NaCl som blank til spektrosometeret.
- Forbered en standardkurve ved å måle OD530 av seriefortynninger av kjente konsentrasjoner av D-Mannuronic acid (1024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml og 8 μg/ml). Gjenta 2x. Trekk ut en lineær ligning fra disse målingene.
MERK: Standardkurve må bare gjøres én gang. Den lineære ligningen ekstrahert fra den kan brukes til senere testing.- Beregn konsentrasjonen av alginaten i hver prøve ved hjelp av standardkurven og del alginatkonsentrasjonen fra lineær ligning ved OD600 for å oppnå den totale mengden alginat per OD600.
3. ELISA for alginatkitasjon
- Gjenta trinn 2.1−2.4 for å få prøver for alginatmåling.
MERK: Stammer som ble brukt var PAO1, PAO1ΔalgDog PAO1 som fraktet pHERD20T-algU. - Bruk en mikropipette tilsett 50 μL av den innsamlede prøven til en ubehandlet 96-brønnplate. Tilsett 50 μL beleggbuffer (karbonat/bikarbonatbuffer pH 9,6) til brønnene. Inkuber platen ved 37 °C i 2 timer.
MERK: For en positiv kontroll kan en kjent konsentrasjon av D-Mannuronic acid og/eller en kjent stabil alginat produserende belastning (f.eks. PAO581-PAO1mucA25) brukes. For en negativ kontroll bruk 0,85% NaCl løsning og / eller PAO1ΔalgD (in-frame sletting av algD genet gjør bakteriene helt ute av stand til å produsere noen alginat). Flere brønner kan gjøres fra hvert utvalg for å øke antall tekniske repetisjoner for å hjelpe til med statistisk analyse. Forbered 3–5 brønner av hver prøve. - Bruk en sprutflaske til å vaske platebrønnene 2x med 1x fosfatbuffersaltvann (PBS) med 0,05 % Tween 20 (PBS-T) ved å fylle brønnene, og deretter drenere dem ved å vende platen over.
- Bruk en mikropipette tilsett 200 μL blokkeringsbuffer (10 % skummet melk i PBS-T) til brønnene. Inkuber ved 4 °C over natten.
MERK: Pakk platen i parafinfilm eller krympefolie for å unngå fordampning i kjøleskapet. - Bruk en sprutflaske vaske platebrønnene 2x med PBS-T ved å fylle brønnene, og deretter drenere dem ved å snu platen over.
- Bruk en mikropipette tilsett 100 μL fortynnet primærantistoff (mus antialgonalt monoklonalt antistoff) til brønnene og inkubator ved 37 °C i 1−2 timer.
MERK: Primær antistoff (mus anti-alginat monoklonalt antistoff) ble gitt ved en konsentrasjon på 0,5 μg/ml (fortynning på 1:2000 av 1 mg/ml lager) i antistofffortynningsvæskeoppløsning (1 % skummet melk i 1x PBS). - Bruk en sprutflaske vaske platebrønnene 3x med PBS-T ved å fylle brønnene, og deretter drenere dem ved å snu platen over.
- Bruk en mikropipette tilsett 100 μL fortynnet sekundært antistoff til brønnene og inkubator ved 37 °C i 1–2 timer.
MERK: Sekundært antistoff som ble brukt var pierce geit anti-mus poly-HRP antistoff til en konsentrasjon på 0,25 μg/ml (fortynning av 1:2000 av 0,5 mg/ml lager) i antistofffortynningsvæskeoppløsning. - Bruk en sprutflaske vaske platebrønnene 3x med PBS-T ved å fylle brønnene, og deretter drenere dem ved å snu platen over.
- Bruk en mikropipette tilsett 100 μL TMB-ELISA-oppløsning (Materialtabell) og inkuber ved romtemperatur i 30 min i mørket.
MERK: Fargen på en positiv reaksjon ville være en nyanse av blått. - Bruk en mikropipette tilsett 100 μL stoppoppløsning (2 N svovelsyre).
MERK: Fargen vil bli fra blå til gul når stoppløsningen legges til. Fargen er stabil i opptil 30 minutter etter at reaksjonen er stoppet. - Ved hjelp av en plateleser, les OD på 450 nm.
- Produser en standardkurve ved å måle OD450 av seriefortynninger av kjente konsentrasjoner av D-Mannuronic acid (1024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml og 8 μg/ml). Gjenta 2x. Fra disse målingene trekke ut en lineær ligning.
MERK: Standardkurven må bare gjøres én gang. Den lineære ligningen ekstrahert fra den kan brukes til senere testing.- Beregn konsentrasjonen av alginaten i hver prøve ved hjelp av standardkurven og del alginatkonsentrasjonen fra lineær ligning ved OD600 for å oppnå den totale mengden alginat per OD600.
4. Statistisk analyse av algiatmåling
- I et grafisk programvareark angir du en kolonne med den lineære ligningen avledet fra standardkurven. Angi y-akseresultatene som alginatkonsentrasjonen og x-aksens resultater som OD530 for uronisk syreanalyse og OD450 for ELISA for å oppnå alginatkonsentrasjonene i hver prøve.
- For å normalisere mengden alginat i hver prøve til mengden per 5,5 x108 CFU/ml (1 OD600),del konsentrasjonen av hver prøve oppnådd ovenfor med sin respektive OD600-verdi. Hvis flere OD600 ble målt for hver prøve, deler du med gjennomsnittlig OD600.
- Utfør statistisk analyse ved hjelp av foretrukket statistisk programvare (f.eks. GraphPad Prism 7.02).
- Åpne programvaren. Velg Kolonne under Ny tabell og graf, og velg ettveis ANOVA-datasettet.
- Gi navn til hver kolonne med belastningen som er testet, og legg til alginatkonsentrasjonene under.
- Etter å ha lagt inn alle dataene, klikk på Analyser i toppmenyen. Dette åpner et analysesettingsvindu. Velg de riktige parameterne for testing, og angi om flere sammenligninger må kjøres.
MERK: Etter analyse inneholder datasettet en p-verdi som vil bidra til å fastslå den statistiske betydningen av dataene. Data vil bli ansett som statistisk signifikante hvis p-verdien er mindre enn den angitte α-verdien (vanligvis angis α-verdien for p < 0,01). - Velg Stolpediagram-typen under graffanen. Dette vil automatisk kartlegge dataene med den angitte tittelen fra inndataarket. Angi statistisk signifikans av dataene etter behov ved å vise * symbolet over bindelinjer mellom linjene av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser plater av PAO1 og PAO581 med eller uten in-frame sletting i pyrimidet (et gen i pyriden biosynteseveien) som resulterer i SCV6. PAO1 SCV mutant ble gjenopprettet til normal vekst som svar på uracil tilskudd (Figur 1A,B). Videre ble PAO581ΔpyrDSCV mutant returnert til mucoidy med samme uracil behandling, fordi den overordnede stammen PAO581 har en ekstra mucA25 mutasjon (Figur 1C,D). Resultatene for uronic syre karbazole analyse er vist i figur 26. Dataene representerer prøver av PAO581 og PAO581 med mutasjoner i gener som regulerer pyrimidin de novo biosyntese dyrket på PIA og PIA supplert med 0,1 mM uracil (Figur 2A). Dataene viser at tilstedeværelsen av uracil i media resulterer i konvertering av mutant belastning tilbake til mucoidy (sett av økningen / gjenopprettet alginat produksjon) (Figur 2B). Resultatene for det antialgiske monoklonale antistoffet basert ELISA er representert i figur 3. Dataene viser PAO1, PAO1 med en in-frame sletting av algD genet koding nøkkelen alginat biosyntetisk e-postgitte BNP-mannose dehydrogenase, og PAO1 bærer et uttrykk plasmid pHERD20T med den viktigste alginat-spesifikke sigma faktor algU når dyrket på PIA plater med arabinose for induksjon pBAD arrangør i pHERD20T. Disse dataene viser de ikke-mucoid nivåene av alginat målt for PAO1, og PAO1ΔalgD versus mucoid nivåer av alginat målt for PAO1 +pHERD20T-algU. Figur 4 sammenligner de to metodene for alginatmålinger sammen. Resultatene var ikke statistisk signifikante sammenlignet med hverandre ved hjelp av en toveis ANOVA med p < 0,01. Figur 5A sammenligner kryssreaktiviteten til antialginatmAb mot andre polysakkarider, inkludert amylopectin, amylose, kollagen og glykogen. Figur 5B viser sammenligningen i spesifisitet og følsomhet for uronisk syrekarbazolinanalyse til den nyutviklede antialgemede monoklonale antistoffbaserte ELISA med kontrollen ved hjelp av den svært rensede tangalgin (Materialtabell). Figur 6 viser direkte testing av ELISA på pasientsputumprøver som var positive for mukoid P. aeruginosa og pasienter som ikke inneholdt mukoid P. aeruginosa.
Figur 1: Representative bilder av de novo pyrimidinbiosyntesemutasjoner som resulterer i SCV fenotype i PAO1 og PAO581. Bildet viser PAO1 (venstre) og PAO1ΔpyrD (høyre) på PIA plater (A) og PIA plater supplert med uracil (B) dyrket ved 37 °C i 48 h. Bildet viser PAO581 (venstre) og PAO581ΔpyrD (høyre) på PIA plater (C) og PIA plater supplert med uracil (D) dyrket ved 37 °C for 48 h. Dette tallet har blitt endret fra arbeid gjort av Al Ahmar et al.6. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representativ graf av uronisk syre karbazole analyse. (A) Bildet av mucoid P. aeruginosa stamme PAO581 (PAO1mucA25) dyrket ved 37 °C i 24 timer på PIA plater (venstre) og PIA plater med uracil (høyre). (B) Alginate produksjon for PAO581, PAO581carA,PAO581carB,og PAO581pyrD når dyrket på PIA plater med og uten uracil ved 37 °C for 24 h. Alginate ble samlet inn og målt ved hjelp av standard karbazole analyse. Verdier som vises er gjennomsnittlige alginat ± standardavvik for triplicate leser. (**** = p < 0,0001). Dette tallet har blitt endret fra arbeid gjort av Al Ahmar et al.6. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representativ graf av antialginat mAb-basert ELISA. Algat produksjon for PAO1, PAO1ΔalgD og PAO1 bærer uttrykket vektor pHERD20T-algU dyrket på PIA med 0,1% arabinose ved 37 ° C for 24 h. Alginate ble samlet inn og målt ved hjelp av anti-alginat ELISA med musen anti-algetreken monoklonalt antistoff. Verdier som vises er gjennomsnittlige alginat ± standardavvik for triplicate leser. p < 0.0001. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Sammenligning mellom resultatene fra uronisk syreanalyse og antialginatmAb-basert ELISA. Algiat produksjon fra fem forskjellige mucoid P. aeruginosa proprietære stammer dyrket på PIA plater ved 37 ° C for 24 h. Alginate ble samlet og målt ved uronic acid analyse og anti-alginat ELISA. Verdier som vises er gjennomsnittlige alginat ± standardavvik for triplicate leser. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Spesifisitet og følsomhet for antialginatmAbbasert ELISA sammenlignet med den uroniske syrekarbazoliske analysen. (A) ELISA ble kjørt med høy (800 μg/ml) og lav (100 μg/ml) interne analysekontroller av tangalginatet. Dette algkunt ble også brukt som standard for ELISA. Andre polysakkarider testet som kan krysse reagerer med antialginat mAb var amylopectin, amylose, kollagen og glykogen (500 μg/ml hver). (B) Uronic acid carbazole analyse og ELISA ble kjørt med samme utvalg av standard konsentrasjoner med tang alginat: 50 μg/ml, 5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,1 μg/ml og 0,05 μg/ml. Verdier som vises er gjennomsnittlige alginat ± standardavvik for triplicate leser. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Test av direkte pasientprøve. Antialginat ELISA ble testet på pasientenes sputumprøver uten tidligere vekst på plater. Tre CF sputum prøver som hadde vekst av mucoid P. aeruginosa ble brukt samt to pasient sputum prøver som inneholdt enten ikke-mucoid P. aeruginosa (Neg 1) eller ingen P. aeruginosa vekst (Neg 2). Verdier som vises er gjennomsnittlige alginat ± standardavvik for triplicate leser. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Både SCV og alginat er viktige sykdomsmarkører involvert i flere kroniske infeksjoner. Derfor er evnen til å vokse SCV samt studere regulering og produksjon av alginat av P. aeruginosa integrert i oppdagelsen av nye behandlinger for disse kroniske sykdommene.
SCV stammer er notorisk vanskelig å vokse på grunn av deres langsomme vekstrate4 sammenlignet med andre P. aeruginosa stammer, som hjelpemidler i deres antimikrobielle motstand3. Vårt arbeid identifiserer en bestemt form for P. aeruginosa SCV som er et resultat av mutasjoner i de novo pyrimidin biosyntese. Her diskuterer vi en veksttilstand for at en slik SCV skal gå tilbake til en normal vekstfenotype når nukleosiduracil leveres. Men da UMP/UTP ble lagt til mediet, ble den defekte veksten ikke gjenopprettet (data vises ikke). Porin(s) ansvarlig for denne selektiviteten må studeres videre. Tilskudd av vekstmediene med uracil hjulpet til å lindre stresset forårsaket av pyrimidinsult (figur 1). På samme måte, tillegg av gratis cytosin til media i samme metode for tillegg av uracil, hjulpet i lindring av pyrimid sult (data ikke vist). Både gratis uracil og gratis cytosin i media kommer inn i cellene og bidrar til å returnere de normale nivåene av uridinmonofosfat (UMP) og uridintrifosfat (UTP)6 i cellen, som er hvordan SCV isolerer tilbake til normal vekst.
Flere kritiske tiltak for de algiske målingene finnes som kan bidra til reproduserbarhet av resultatene. I utgangspunktet må prøvene, etter å ha blitt skrapt fra platene, forbli på is for å bidra til å blokkere nedbrytningen av alginat i prøven og resultere i lavere målte konsentrasjoner. I tillegg, før OD600 målinger, er det viktig å grundig blande prøven for å oppnå en homogen løsning som klumper dannes i prøver som har sittet en stund, og som kan forstyrre OD-målingen og dermed med de endelige konsentrasjonsberegningene. Ved bruk av ELISA-metoden kan det hende at prøver fra vekstplater må fortynnes, spesielt når du bruker stammer som produserer en stor mengde alginater siden resultatene kan være utenfor standard kurveområde. Ved bruk av uronisk syre, grundig vortex kulturrørene etter tilsetning av karbazole og etter inkubasjonen for å sikre en homogen prøve. Når du arbeider med uronisk syreanalyse, er det viktig å være forsiktig når du håndterer syreblandingen og å kvitte prøvene på riktig måte.
Den tradisjonelle målemetoden som krever syrehydrolyser av alginat beskrevet ovenfor, har vist stort potensial og har blitt benyttet av mange forskere i flere år. I dette arbeidet viser vi prosedyren for den tradisjonelle analysen sammen med en in-house utviklet ELISA ved hjelp av et anti-algonert monoklonalt antistoff. Disse antistoffene ble utviklet hos mus og kan gjenkjenne alginat er ennå ikke identifisert epitop. Spesifisiteten til ELISA-metoden ble grundig testet mot alginat fra P. aeruginosa samt fra tang. Videre var ELISA sammenlignbar med uronisk syreanalyse i kvantifiserende alginat i bakterielle prøver testet (Figur 3). I tillegg ble det testet mot andre polysakkarider som kan resultere i falske positive resultater. Vårt arbeid viste en høy spesifisitet av antistoffet til alginat og dens evne til å skille mellom alginat og de andre testede polysakkarider (Figur 5A). ELISA-protokollen har høyere følsomhet sammenlignet med uronisk syreanalyse (figur 5B) siden vi var i stand til å oppdage spornivåer av alginat ved hjelp av ELISA som ikke ble oppdaget ved hjelp av uronisk syreanalyse ved testing av pasientsputumprøver (figur 6). ELISA-metoden kan tilpasses for in vivo-måling av alginat fra pasientens sputum (figur 6). Både vekstforholdene ved hjelp av uracil tilskudd samt den nyutviklede ELISA ville være kraftige verktøy i bedre forståelse P. aeruginosa patogenese i CF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren Hongwei D. Yu er Chief Science Officer og medgrunnlegger av Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) gir R44GM113545 og P20GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 mL) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C.
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
