Summary
여기서, 우리는 녹농균의 작은 식민지 변종을 배양하는 성장 상태를 설명한다. 우리는 또한 전통적인 우론산 카르바졸 분석및 알긴산 특이적 단일클론 항체(mAb) 기반 ELISA를 사용하여 P. aeruginosa에 의해 생성된 외다당류 알긴산의 검출 및 정량화를 위한 2개의 개별적인 방법을 기술한다.
Abstract
기회 그람 음성 세균성 병원균인 슈도모나스 녹농균은점막이라는 독특한 표현형을 초래하는 외다당류 알긴산을 과잉 생산할 수 있습니다. Alginate는 낭포성 섬유증 (CF)를 가진 환자에 있는 나쁜 예후 귀착되는 만성 폐 감염에 연결됩니다. 알긴산의 생산을 조절하는 경로를 이해하면 알긴산 형성을 대상으로 하는 새로운 치료 전략의 개발에 도움이 될 수 있습니다. 또 다른 질병 관련 표현형은 작은 콜로니 변이체(SCV)이다. SCV는 박테리아의 느린 성장 및 종종 항균제에 증가 저항과 관련. 이 논문에서, 우리는 먼저 피리미딘 생합성 돌연변이로 인해 유전적으로 정의 된 형태의 P. aeruginosa SCV를 배양하는 방법을 보여줍니다. 질소 염기, 우라실 또는 시토신의 보충은 이러한 돌연변이체에 정상적인 성장을 반환하여 환경으로부터 자유 염기를 청소하는 인양 통로의 존재를 보여줍니다. 다음으로, 우리는 세균성 알긴산의 측정을 위한 2개의 방법을 토론합니다. 첫 번째 방법은 다당류의 가수분해를 그것의 우론산 단량체에 의존하고 염색체 시약, 카르바졸로 유도하는 반면, 두 번째 방법은 시판되는 알긴산 특이적 mAb에 기초한 ELISA를 사용한다. 두 방법 모두 정량화에 대한 표준 곡선이 필요합니다. 우리는 또한 면역학적 방법이 알긴산 정량화를 위해 특이적이고 임상 구편에서 알긴산의 측정을 위해 사용될 수 있음을 보여준다.
Introduction
녹농균을 가진 만성 폐 감염은 낭포성 섬유증 (CF)를 가진 환자에 있는 이환율 그리고 사망의 중요한 원인입니다. 초기 유년기 도중, 환자는 P. aeruginosa1,2의비 점막 격리를 포함하여 다중 세균성 병원체에 의해 식민지화됩니다. 작은 식민지 변이체 (SCV)의 출현은 점막 분리뿐만 아니라 분리만성 감염에 발병을위한 마커이다. SCV 분리제는 그들의 느린 성장 속도4때문에 높게 약 저항하는3, 그(것)들을 치료 연대 및 그밖 만성 감염에 있는 가혹한 억지력을 렌더링합니다5 에 의하여 P. aeruginosa. Al Ahmar 외6에 의한 작업은 de novo 피리미딘 생합성에 의해 연결된 SCV와 점막 사이의 연관성을 보여주었다. 피리미딘 기아는, 피리미딘 생산과 관련된 유전자의 돌연변이로 인해, 비점막 기준 균주 PAO1 및 점막 유도체, PAO581 (PAO1mucA25)에서 SCV 표현형을 초래하였다.
알긴산 과잉 생산은 CF에서 만성 폐 감염에 대한 중요한 질병 마커임에도 불구하고, 알긴산과 폐 병리학의 양 사이에 직접적인 상관관계가 있는지 는 명확하지 않으며, 알긴산이 치료를 위한 예후 마커로 사용될 수 있는지는 불분명하다7. 알긴산 생산은 주로 2개의 오페론, 조절오페론(algUmucABCD)8,9 및 생합성 오페론(algD operon) 10,11에의해 조절된다. 알긴산 생산은 시그마 인자 AlgU9,12(일명 AlgT라고도 함)와 반시그마 인자 MucA13의분해에 의해 엄격하게 조절된다. 환자의 가래 표본에서 즉석에서 알긴산의 생산을 모니터링하는 능력은 새로운 치료 옵션의 개발에 도움이 될 수 있습니다.
여기서, 우리는 피리미딘 드 노보를 합성할 수 없는 돌연변이체에 의한 SCV의 존재를 검출하는 성장 조건을 기술한다. 피리미딘 뉴클레오티드의 질소 염기인 우라실 및/또는 시토신을 보충하여 인양 경로를 활성화시켜 돌연변이체의 정상적인 성장을 회복시다. 이들 특정 SCV 돌연변이체에 대한 이러한 성장 방법은 환자 샘플에서 피리미딘 돌연변이를 식별하는 스크리닝 방법으로 사용될 수 있다. 또한, 우리는 P. aeruginosa에의해 생성되고 분비되는 알긴산의 검출 및 측정을위한 두 가지 방법에 대해 논의합니다. 첫 번째는 고농도의 산을 이용하여 다당류를 분해한 다음 시료의 농도를 정량화하기 위해 색도 지표를 첨가하는 전통적인 방법14,15,16이다. 우리의 실험실에서 개발 된 두 번째 방법은 QED 바이오 사이언스가 개발 한 항 알긴산 단일 클론 항체 (mAb)를 사용하여 효소 연결 면역 흡착 분석 (ELISA)을 활용합니다. ELISA 방법은 우론산 분석법보다 더 구체적이고 민감하며 고농축 황산의 회피로 인해 보다 안전한 사용을 가능하게 합니다. Alginate를 측정하기 위하여 참을성 있는 가래 견본에 직접 이용되는 ELISA의 기능으로, 감염의 다른 기간에 폐에 존재하는 알긴산의 양을 따르는 감시 진단 공구로 개발될 수 있습니다.
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Protocol
1. SCV 성장 조건 및 인양 통로의 생리적 활성화
- SCV 감지.
- P. aeruginosa 균주 PAO1, PAO1ΔpyrD,PAO581 및 PAO581ΔpyrD를 미리 온난한 슈도모나스 격리 한천(PIA) 플레이트에 연속하고 48시간 동안 37°C에서 성장한다. 성장 판상에서 SCV 표현형을 가지는 단일 콜로니 분리(통상의 3−5 mm 콜로니 크기와 는 반대로 1−3 mm의 콜로니 크기)를 식별한다.
- 1.1.1 단계를 반복하여 SCV의 순수한 분리를 얻었다.
참고: SCV 식민지의 느린 성장 속도로 인해 성장은 최대 72 시간이 필요할 수 있습니다.
- 인양 통로의 생리적 활성화.
- 멸균 접종 루프를 사용하여 PIA 플레이트에서 SCV 콜로니를 선택하고 우라실 0.1 mM으로 보충된 미리 따뜻한 PIA에 줄무늬를 지정합니다. 24-48 시간 동안 37 °C에서 플레이트를 성장시다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 PIA 플레이트에는 오토클레이브 전에 혼합물에 추가된 글리세롤 20 mL/L이 포함되어 있습니다. 오토클레이브 후 및 혼합물 온도가 55°C 이하인 후 플레이트를 붓기 전에 액체 매체에 우라실(0.1 mM)의 11.21 mg/L을 첨가한다. 이 방법은 P. aeruginosa에있는 SCV 표현형을 일으키는 원인이 되는 피리미딘 돌연변이를 확인하는 것을 도울 것입니다. SCV 표현형이 말의 돌연변이의 결과인 경우, 정상적인 콜로니 성장 및 크기(3−5 mm)는 우라실 보충 PIA 플레이트에서 관찰될 것이다. 균주가 알긴산을 생산하는 능력을 가지고 있다면, 점막 표현형은 또한 우라실 보충시 반환됩니다.
- 멸균 접종 루프를 사용하여 PIA 플레이트에서 SCV 콜로니를 선택하고 우라실 0.1 mM으로 보충된 미리 따뜻한 PIA에 줄무늬를 지정합니다. 24-48 시간 동안 37 °C에서 플레이트를 성장시다.
2. 우론산 카르바졸 분석
- 테스트할 원하는 균주의 순수한 배양으로부터 단일 콜로니를 식별합니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여, 콜로니를 선택하고, 슈도모나스 격리 국물(PIB)의 5 mL를 포함하는 배양 시험관에 이쑤시개를 놓습니다. 24 시간 동안 37 °C에서 셰이커 인큐베이터에서 성장합니다.
참고: 다음 균주 PAO581 (PAO1mucA25),PAO581carA,PAO581carB및 PAO581pyrD는 측정을 위해 알긴산을 수확하기 위해 0.1 mMuracil으로 보충된 PIA 플레이트 또는 PIA 플레이트에서 재배되었습니다. - 미리 따뜻해진 PIA 플레이트위에 배양된 PIB 국물 150 μL(15mm x 100mm 플레이트용) 또는 450 μL의 국물(15mm x 150mm 플레이트)을 첨가합니다. 멸균 세포 스프레더를 사용하여 접시 위에 국물을 뿌린다. 24 시간 동안 37 °C에서 플레이트를 성장시다.
참고 : 한쪽으로 접시를 팁하여 파이펫을 사용하여 플레이트에서 여분의 유체(있는 경우)를 흡인합니다. 프로토콜에 사용된 PIB 및 PIA 플레이트는 알긴산 생산을 돕기 위해 세포에서 탄소 공급원으로 사용되는 글리세롤 20 mL/L을 함유하고 있습니다. - 파이펫 컨트롤러와 멸균 50 mL 파이펫을 사용하여, 재배된 잔디에 0.85% NaCl을 추가하고 셀 스프레더를 사용하여 플레이트를 폐기하여 샘플을 수집합니다. 신선한 50 mL 파이펫을 사용하여 샘플을 50 mL 수집 튜브에 흡인합니다. 샘플을 얼음 위에 섞고 놓기 위해 샘플을 높은 곳에 소용돌이치게 합니다.
참고 : 추가 된 0.85 % NaCl의 부피는 플레이트의 크기에 따라 다릅니다. 15mm x 100mm 플레이트의 경우 10−30 mL를 사용하고 15mm x 150mm 플레이트의 경우 20−50mL를 사용하십시오. - 일회용 큐벳에 시료의 1 mL을 추가하고 분광광도계를 사용하여 OD를 판독하여 시료의 600 nm (OD600)에서광학 밀도를 측정합니다. 이 단계를 2x 반복하여 각 샘플에 대한 읽기의 세 배만 얻습니다.
- 유황산/붕산 용액 3 mL를 배양 튜브에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 수집된 샘플의 350 μL을 시험관내의 산 혼합물에 천천히 넣고 와류를 짧게 낮게 첨가한다.
- 45 mL의 물에 수산화 칼륨 (KOH) 분말 10.099 g을 추가하여 붕산 염수를 준비하십시오. 혼합물에 24.74 g의 붕산 (H3BO3)을넣고 100 mL로 부피를 가져옵니다.
- 얼음이 있는 싱크대에 1L 병을 놓고 500 mL의 농축 황산으로 병을 채웁니다. 준비된 붕산재 의 15 mL을 천천히 추가하십시오. 병을 식힙니다.
- 총 25 mL에 대해 10 mL의 붕산 재고를 추가하십시오. 병이 식으면 부피를 1L로 가져옵니다.
주의 : 이 방법은 고농축 황산의 사용에 의존합니다. 적절한 개인 보호 장비는 안전과 샘플의 적절한 폐기 프로토콜을 준수해야 보장하기 위해 사용되어야한다.
참고: 양성 대조를 위해 P.aeruginosa의 알긴산 생성 균주를 통해 수확 및 정제된 D-mannuronic acid 및/또는 알려진 세균성 알긴산 샘플의 공지된 농도(예: PAO581-PAO1mucA25). 음성 대조군을 위해 0.85% NaCl 용액 및/또는 PAO1ΔalgD(박테리아가 알긴산염을 완전히 생성할 수 없게 만드는 알그D 유전자의 프레임 내 삭제)를 사용한다. 통계 분석을 돕기 위해 기술 적 반복 횟수를 늘리기 위해 각 샘플에서 여러 개의 튜브를 만들 수 있습니다. 각 샘플의 3-5 튜브를 준비합니다.
- 산/시료 혼합물에 에탄올 용액에 0.1% 카르바졸 100 μL을 추가합니다. 튜브와 소용돌이를 중간 온도로 5초 동안 뚜껑을 덮고 55°C에서 30분 동안 마른 욕조에 놓습니다.
- 배양 후 튜브와 와류를 고온으로 짧게 제거하고 5 분 동안 식힙니다.
참고 : 볼 수있는 색상은 보라색의 그늘이 될 것입니다. 색상은 1-2 시간 동안 측정을 위해 안정적으로 유지됩니다. - 깨끗한 큐벳에 혼합물의 1 mL을 추가하고 분광 광도계에서 530 nm에서 샘플의 OD를 판독하여 각 튜브의 OD530을 읽습니다. 분광광도계에 공백으로 0.85 % NaCl튜브를 사용합니다.
- D-Mannuronic 산의 알려진 농도의 직렬 희석의 OD 530을 측정하여 표준 곡선을 준비 (1,024 μg / mL, 512 μg / mL, 256 μg / mL, 128 μg / mL, 64 μg / mL, 32 μg / mL, 16g / mL, 및 8g/ mL). 2x를 반복합니다. 이러한 판독값에서 선형 방정식을 추출합니다.
참고: 표준 곡선은 한 번만 수행하면 됩니다. 추출된 선형 방정식은 이후 테스트에 사용할 수 있습니다.- 표준 곡선을 사용하여 각 시료에서 알긴산의 농도를 계산하고 선형 방정식으로부터 알긴산 농도를 OD600으로 나누어 OD600당알긴산의 총량을 얻었다.
3. 알긴산 정량에 대한 ELISA
- 2.1-2.4단계를 반복하여 알긴산 측정을 위한 샘플을 얻습니다.
참고: 사용되는 균주는 PAO1, PAO1ΔalgD및 PAO1 이pherd20T-algU를 운반했다. - 마이크로파이펫을 사용하여 수집된 시료의 50 μL을 처리되지 않은 96웰 플레이트에 첨가한다. 50 μL의 코팅 버퍼(탄산염/중탄산염 버퍼 pH 9.6)를 웰에 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
참고: 양성 대조를 위해, 알려진D-Mannuronic 산 및/또는 알려진 안정알긴산 생산 균주(예: PAO581-PAO1mucA25)의공지된 농도를 사용할 수 있다. 음성 대조군 을 위해 0.85% NaCl 용액 및/또는 PAO1ΔalgD (algD 유전자의 프레임 내 삭제는 박테리아가 어떤 알긴산질도 생성할 수 없게 한다). 통계 분석을 돕기 위해 기술 반복 횟수를 늘리기 위해 각 샘플에서 여러 개의 웰을 만들 수 있습니다. 각 샘플의 3-5 웰을 준비합니다. - 분출 병을 사용하여, 0.05 % 트웬 20 (PBS-T)와 1 x 인산 완충식염수 (PBS)로 플레이트 웰2x를 세척한 다음 플레이트를 뒤집어 서 배수하십시오.
- 마이크로파이펫을 사용하여 웰에 차단 완충액(PBS-T의 10% 탈지 우유)을 200 μL 추가합니다. 밤새 4°C에서 배양합니다.
참고: 냉장고의 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름또는 수축 랩에 플레이트를 감싸십시오. - 분출 병을 사용하여 우물을 채우고 접시를 뒤집어 배수하여 PBS-T로 플레이트 웰을 2 배 씻어.
- 마이크로파이펫을 사용하여 100 μL의 희석된 1차 항체(마우스 항-알긴산 단일클론 항체)를 웰에 넣고 37°C에서 1-2시간 동안 배양한다.
참고: 1차 항체(마우스 항-알긴산 단일클론 항체)는 항체 희석제 용액(1x PBS에서 1% 탈지 우유)에서 0.5 μg/mL(1 mg/mL 스톡의 1:2,000의 희석)의 농도로 제공되었다. - 분출 병을 사용하여 우물을 채우고 접시를 뒤집어 배수하여 PBS-T로 플레이트 웰을 3 배 씻어.
- 마이크로파이펫을 사용하여 100 μL의 희석된 이차 항체를 웰에 추가하고 1-2 시간 동안 37°C에서 배양한다.
참고: 사용된 이차 항체는 항체 희석액에서 0.25 μg/mL의 농도로 염소 항-마우스 폴리-HRP 항체(0.2,000 의 희석 0.5 mg/mL 스톡)를 관통하였다. - 분출 병을 사용하여 우물을 채우고 접시를 뒤집어 배수하여 PBS-T로 플레이트 웰을 3 배 씻어.
- 마이크로파이펫을 사용하여 TMB-ELISA 용액 100μL(재료 표)을넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
참고 : 긍정적 인 반응의 색상은 파란색의 그늘이 될 것입니다. - 마이크로파이펫을 사용하여 스톱 액 용액 100 μL (2 N 황산)을 추가하십시오.
참고: 정지 솔루션이 추가되면 색상이 파란색에서 노란색으로 바뀝니다. 반응은 중지 된 후 최대 30 분 동안 색상이 안정적입니다. - 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 OD를 읽습니다.
- D-Mannuronic 산의 알려진 농도의 직렬 희석의 OD 450을 측정하여 표준 곡선을 생성합니다(1,024 μg/mL, 512 μg/mL, 256 μg/mL, 128μg/mL, 64 μg/mL, 32 μg/mL, 16g/mL, 및 8g/mL). 2x를 반복합니다. 이러한 판독값에서 선형 방정식을 추출합니다.
참고: 표준 곡선은 한 번만 수행해야 합니다. 추출된 선형 방정식은 이후 테스트에 사용할 수 있습니다.- 표준 곡선을 사용하여 각 시료에서 알긴산의 농도를 계산하고 선형 방정식으로부터 알긴산 농도를 OD600으로 나누어 OD600당알긴산의 총량을 얻었다.
4. 알긴산 측정의 통계 분석
- 그래픽 소프트웨어 시트에서 표준 곡선에서 파생된 선형 방정식으로 열을 설정합니다. Y축 결과를 알긴산 농도 및 x축 결과를 우론산 분석및 ELISA에 대한 OD530으로 설정하고 각 샘플에서 알긴산 농도를 수득한다.
- 각 시료의 알긴산 양을 5.5 x108 CFU/mL(1 OD600)당양으로 정규화하기 위해, 위에서 얻은 각 샘플의 농도를 각각의 OD600 값으로 나눈다. 각 샘플에 대해 여러 개의 OD600을 측정한 경우 평균 OD600으로나눕니다.
- 선호하는 통계 소프트웨어(예: GraphPad 프리즘 7.02)를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
- 소프트웨어를 엽니다. 새 테이블 및 그래프에서 열을 선택하고 단방향 ANOVA 데이터 집합을 선택합니다.
- 변형을 테스트한 각 열의 이름을 지정하고 아래에 알긴산 농도를 추가합니다.
- 모든 데이터를 입력 한 후 상단 메뉴에서 분석을 클릭합니다. 그러면 분석 설정 창이 열립니다. 테스트에 적합한 매개 변수를 선택하고 여러 비교를 실행해야 하는지 여부를 나타냅니다.
참고: 분석 후 데이터 집합에는 데이터의 통계적 유의를 결정하는 데 도움이 되는 p-값이 포함됩니다. p-값이 설정된 α 값보다 낮으면 데이터가 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다(일반적으로 α 값은 p< 0.01로 설정됩니다). - 그래프 탭 에서 막대 그래프 유형을 선택합니다. 그러면 입력 데이터 시트에서 표시된 제목으로 데이터가 자동으로 차트로 표시됩니다. 관심 있는 막대 사이의 결합선 위의 * 기호를 표시하여 필요에 따라 데이터의 통계적 유의를 나타냅니다.
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Representative Results
도 1은 SCV6을초래하는 pyrD 유전자(피리미딘 생합성 경로내의 유전자)에서 프레임 내 결실 유무에 관계없이 PAO1 및 PAO581의 플레이트를 나타낸다. PAO1 SCV 돌연변이체는 우라실 보충에 반응하여 정상 성장으로 회복되었다(도1A,B). 더욱이, PAO581ΔpyrDSCV 돌연변이체는 부모 균주 PAO581이 추가적인 mucA25 돌연변이를 가지기 때문에 동일한 우라실 처리를 통해 점막으로 복귀하였다(도1C,D). 우론산 카르바졸 분석에 대한 결과는 도 26에나타내고 있다. 데이터는 PIA 및 PIA에서 성장한 피리미딘 데 노보 생합성을 조절하는 유전자의 돌연변이가 있는 PAO581 및 PAO581의 샘플을 나타내며, 우라실의 0.1 mM으로 보충되었다(그림2A). 데이터는 매체에 우라실의 존재가 돌연변이 균주를 다시 점막으로 변환하는 결과를 나타낸다(증가/복원된 알긴산 생산에 의해 볼 수 있듯이)(그림 2B). 항-알긴산 단일클론 항체 기반 ELISA에 대한 결과는 도 3에나타내고 있다. 데이터는 주요 알긴산 효소인 GDP-만노스 탈수소효소를 코딩하는 알그D 유전자의 프레임 내 결실을 가진 PAO1, PAO1, 및 주 알긴산 특이적 시그마 인자 알구를 가진 발현 플라스미드 pHERD20T를 운반하는 PAO1을 아라비노스와 함께 PIA 플레이트상에서성장시 pBADP.2. 이 데이터는 PAO1에 대해 측정된 알긴산의 비점막 수준을 나타내고, PAO1ΔalgD 대 PAO1+pHERD20T-algU에 대해 측정된 알긴산의 점막 수준을 나타낸다. 도 4는 알긴산 측정의 두 가지 방법을 함께 비교합니다. 결과는 p< 0.01을 가진 양방향 ANOVA를 사용하여 서로 비교했을 때 통계적으로 유의하지 않았다. 도 5A는 아밀로펙틴, 아밀로오스, 콜라겐 및 글리코겐을 포함하는 다른 다당류와 항알긴산mAb의 교차 반응성을 비교한다. 도 5B는 고도로 정제된 해조류 알긴산을 이용한 대조군과 함께 새로 개발된 항알지네이트 단일클론 항체 계 ELISA에 대한 우론산 카르바졸 분석법의 특이성 및 민감도의 비교를 나타낸다(표자료). 도 6은 점막 P. aeruginosa 및 점막 P. aeruginosa를포함하지 않은 환자에 대해 양성이었던 환자 가래 샘플에 대한 ELISA의 직접적인 시험을 나타낸다.
도 1: PAO1 및 PAO581에서 SCV 표현형을 초래하는 드노보 피리미딘 생합성 돌연변이의 대표적인 이미지. 이미지는 PAO1(왼쪽)및 PAO1ΔpyrD (오른쪽)PIA 플레이트(A)및 PIA 플레이트에 우라실 (B)로 보충 된 우라실(B)을48 시간 동안 37 °C에서 성장한 것을 보여줍니다. 이미지는 PAO581(왼쪽)과PAO58ΔpyrD (오른쪽)를보여줍니다 ( 오른쪽) PIA 플레이트에 우라실(C)및 PIA 플레이트가 37 °C에서보충되었습니다. 이 그림은 알 아마르 외6에의해 수행 된 작업에서 수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 우론산 카르바졸 분석법의 대표적인 그래프. (A)점막 P. aeruginosa 균주 PAO581 (PAO1mucA25)의이미지는 PIA 플레이트(왼쪽)에24 시간 동안 37 °C에서 자랐으며 우라실(오른쪽)을가진 PIA 플레이트. (B)PAO581, PAO581carA,PAO581carB및 PAO581pyrD에 대한 알지네이트 생산은 24 시간 동안 37 °C에서 우라실없이 PIA 플레이트에서 재배할 때 알긴산 표준 카르바졸 분석기를 사용하여 수집 및 측정하였다. 도시된 값은 삼중값 읽기의 평균 알긴산 ±표준 편차이다. (**** = p< 0.0001). 이 그림은 알 아마르 외6에의해 수행 된 작업에서 수정되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 항 알긴산 mAb 계 ELISA의 대표적인 그래프. 24시간 동안 37°C에서 0.1% 아라비노스를 사용하여 PIA상에서 성장한 PHERD20T-algU 발현 벡터pHERD20T-algU를 운반하는 PAO1, PAO1ΔalgD 및 PAO1에 대한 알긴산 생산은 마우스 항알지네이트 단클론 항체와 함께 항 알긴산 ELISA를 사용하여 수집 및 측정하였다. 도시된 값은 삼중값 읽기의 평균 알긴산 ±표준 편차이다. p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 우론산 분석및 항알긴산 mAb 계 ELISA로부터 얻은 결과 사이의 비교. 5개의 상이한 점막 P. aeruginosa 독점 균주에서 24시간 동안 37°C에서 제조된 알긴산 균주를 알긴산 분석및 항알지네이트 ELISA에 의해 수집 및 측정하였다. 도시된 값은 삼중값 읽기의 평균 알긴산 ±표준 편차이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 우론산 카르바졸 분석과 비교하여 항알긴산 mAb 기반 ELISA의 특이성 및 민감도. (A)ELISA는 해초 알긴산의 높은(800 μg/mL) 및 낮음(100 μg/mL) 내부 분석 제어로 실행되었다. 이 알긴산은 또한 ELISA에 대한 표준으로 사용되었다. 항알긴산 mAb와 교차반응할 수 있는 다른 다당류는 아밀로펙틴, 아밀로오스, 콜라겐 및 글리코겐(각각 500 μg/mL)이었다. (B)우론산 카르바졸 분석및 ELISA는 해조류 알긴산과 동일한 범위의 표준 농도를 사용하여 실행하였다: 50 μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.1 μg/mL, 및 0.05 μg/mL. 도시된 값은 삼중값 읽기의 평균 알긴산 ±표준 편차이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 직접 환자 샘플 테스트. 항 알긴산 ELISA는 플레이트에서 사전 성장없이 환자의 가래 샘플에서 테스트되었습니다. 점막 P. aeruginosa의 성장이 있던 3개의 CF 가래 견본은 비 점막 P. aeruginosa (Neg 1) 또는 아니 P. aeruginosa 성장 (Neg 2)를 포함하는 2개의 참을성 있는 가래 견본 을 사용했습니다. 도시된 값은 삼중값 읽기의 평균 알긴산 ±표준 편차이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
SCV와 알긴산은 모두 몇몇 만성 감염에서 연루된 중요한 질병 마커입니다. 따라서, SCV를 성장시킬 뿐만 아니라 P. aeruginosa에 의한 알긴산의 조절 및 생산을 연구하는 능력은 이러한 만성 질환에 대한 새로운 치료법의 발견에 필수적이다.
SCV 균주는 다른 P. aeruginosa 균주에 비해 느린 성장속도 4로 인해 성장하기가 악명 이어, 이는 그들의 항균 저항에 에이즈3. 우리의 일은 de novo 피리미딘 생합성에 있는 돌연변이의 결과인 P. aeruginosa SCV의 특정 양식을 식별합니다. 여기서, 우리는 뉴클레오시드 우라실이 공급될 때 이러한 SCV가 정상 성장 표현형으로 되돌리는 것에 대해 논의한다. 그러나 UMP/UTP가 배지에 추가되었을 때 결함 있는 성장이 복원되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 이 선택성에 대한 책임이 있는 포린(들)은 더 연구될 필요가 있습니다. 피리미딘 기아로 인한 스트레스를 완화시키는 데 도움을 주는 우라실을 가진 성장 매체의보충(그림 1). 유사하게, 우라실을 첨가하는 동일한 방법으로 미디어에 자유 시토신을 첨가하고, 피리미딘 기아의 완화에 도움을 주었다(데이터는 도시되지 않음). 자유 우라실 과 자유 시토신 모두 세포를 입력하고 세포에서 uridine 모노포스페이트 (UMP) 및 uridine 삼인산염 (UTP)6의 정상 수준을 반환하는 데 도움이, 이는 SCV가 정상 성장으로 다시 되돌아 방법을.
알긴산 측정을 위한 몇 가지 중요한 단계는 결과의 재현성에 도움이 될 수 있습니다. 처음에 시료는 플레이트에서 폐기된 후, 시료의 알긴산 분해를 차단하고 측정된 농도를 낮추기 위해 얼음 위에 남아 있어야 합니다. 또한 OD600 측정 전에 샘플을 철저히 혼합하여 한동안 앉아 있던 샘플에서 덩어리가 형성되어 OD 측정을 방해할 수 있으므로 최종 농도 계산을 통해 균질한 용액을 얻는 것이 중요합니다. ELISA 방법을 사용하는 경우, 결과가 표준 곡선 범위를 벗어날 수 있기 때문에 많은 양의 알긴산균을 생성하는 균주를 사용할 때 특히 성장 판의 샘플을 희석해야 할 수 있습니다. 우론산을 사용하는 경우, 카바졸을 첨가한 후 배양관을 철저히 소용돌이치며 배양 후 균질한 시료를 확보한다. 우론산 분석으로 작업할 때, 산 혼합물을 취급할 때 주의해야 하고 시료를 적절히 폐기하는 것이 중요하다.
위에서 설명한 알긴산의 산 가수분해를 요구하는 전통적인 측정 방법은 큰 잠재력을 보여주었으며 수년 동안 많은 연구자들이 활용해 왔습니다. 이 작품에서, 우리는 항 알긴산 단일 클론 항체를 사용하여 사내에서 개발 된 ELISA와 함께 전통적인 분석에 대한 절차를 보여줍니다. 이들 항체는 마우스에서 개발되었고 아직 에피토프를 식별할 수 있는 알긴산체를 인식할 수 있다. ELISA 방법의 특이성은 P. aeruginosa뿐만 아니라 해초로부터 알긴산에 대해 철저히 테스트되었습니다. 더욱이, ELISA는 시험된 세균 샘플에서 알긴산을 정량화하는 우론산 분석실험과 비교하였다(도3). 또한, 거짓 양성 결과를 초래할 수 있는 다른 다당류에 대해 시험되었다. 우리의 일은 알긴산과 다른 시험된 다당류를 구별하는 그것의 기능을 알긴산에 항체의 높은 특이성을 보여주었다(그림 5A). ELISA 프로토콜은 우론산 분석실험에 비해 민감도가 높은데(도5B)는환자 가래 샘플을 테스트할 때 우론산 분석기를 사용하여 검출되지 않은 ELISA를 사용하여 알긴산의 미량 수준을 검출할 수 있었기 때문에(도6). ELISA 방법은 환자의 가래로부터 알긴산의 생체 내 측정을 위해 적응될 수있다(도 6). 우라실 보충제뿐만 아니라 새로 개발된 ELISA를 사용하는 성장 조건은 CF에서 P. aeruginosa 병인을 더 잘 이해하는 데 강력한 도구가 될 것입니다.
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Disclosures
저자 Hongwei D. Yu는 Progenesis Technologies, LLC의 최고 과학 책임자 겸 공동 설립자입니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (NIH) 보조금 R44GM1113545 및 P20GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 mL) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
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