Summary

Pseudomonas aeruginosa Küçük Koloni Varyant Kültürü ve Aljinat Quantitation

Published: February 22, 2020
doi:

Summary

Burada, pseudomonas aeruginosaküçük koloni varyantı kültüre bir büyüme durumu açıklar. Ayrıca p. aeruginosa tarafından üretilen eksopolisakkarit aljinatının saptanması ve nicelliği için geleneksel üronik asit karbazol testi ve aljinatspesifik monoklonal antikor (mAb) bazlı ELISA kullanılarak iki ayrı yöntem tanımlanmıştır.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa, fırsatçı gram-negatif bakteriyel patojen, mucoidy denilen benzersiz bir fenotip sonuçlanan bir eksopolisakkarit aljinat aşırı üretebilir. Aljinat kistik fibrozis (CF) olan hastalarda kötü prognoz ile sonuçlanan kronik akciğer enfeksiyonları ile bağlantılıdır. Aljinat üretimini düzenleyen yolların anlaşılması, aljinat oluşumunu hedefleyen yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Hastalığa bağlı bir diğer fenotip ise küçük koloni varyantıdır (SCV). SCV bakterilerin yavaş büyüme nedeniyle ve genellikle antimikrobiyallere karşı artan direnç ile ilişkilidir. Bu yazıda ilk olarak pimimidin biyosentez mutasyonlarına bağlı olarak genetik olarak tanımlanmış p. aeruginosa SCV formunu niçin bir yöntem gösterdik. Azotlu bazların takviyesi, urasil veya sitozin, bu mutantlar için normal büyüme döner, çevreden serbest üsleri temizler bir kurtarma yolu varlığını gösteren. Daha sonra, bakteriyel aljinat ölçümü için iki yöntem tartışmak. İlk yöntem, polisakkaritin hidrolizine, üronik asit monomerine dayanır ve ardından kromojenik reaktif, karbazol ile türevleştirme yapılır, ikinci yöntem ise ticari olarak kullanılabilir, aljinat özgü mAb’ye dayalı bir ELISA kullanır. Her iki yöntem de nicellik için standart bir eğri gerektirir. Ayrıca immünolojik yöntemin aljinat ölçümü için spesifik olduğunu ve klinik örneklerde aljinat ölçümü için kullanılabileceğini de göstermektedir.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa ile kronik akciğer enfeksiyonları kistik fibrozis (CF) olan hastalarda morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir. Erken çocukluk döneminde, hastalar P. aeruginosanonmucoid izole dahil olmak üzere birden fazla bakteriyel patojenler tarafından kolonize edilir1,2. Küçük koloni varyantının (SCV) ortaya çıkması izole yanı sıra mukoid izole kronik enfeksiyonlara başlangıç için bir belirteçtir. SCV izole son derece ilaca dirençli3 yavaş büyüme oranlarınedeniyle 4, hangi onları tedavi alayları ve diğer kronik enfeksiyonlar da ciddi bir caydırıcı hale getirir5 P. aeruginosatarafından . Al Ahmar ve ark.6’nın çalışmaları, de novo pirimidin biyosentezi ile bağlantılı SCV ve mucoidy arasında bir bağlantı olduğunu gösterdi. Pirimidin açlık, pirimidin üretimi ile ilgili genlerde mutasyonlar nedeniyle, nonmucoid referans zorlanma PAO1 ve mukoid türevi SCV fenotip sonuçlandı, PAO581 (PAO1mucA25).

Aljinat overproduction CF kronik akciğer enfeksiyonları için önemli bir hastalık belirteci olmasına rağmen, aljinat ve akciğer patolojisi miktarı arasında doğrudan bir korelasyon olup olmadığı açık değildir, ve aljinat tedavi için bir prognoz belirteci olarak kullanılabilir olup olmadığı belirsizdir7. Aljinat üretimi esas olarak iki operon, düzenleyici operon(algUmucABCD)8,9 ve biyosentetik operon(algD operon)10,11tarafından düzenlenir. Aljinat üretimi sıkıca sigma faktörü AlgU9tarafından düzenlenir9 ,12 (ayrıca AlgT olarak da bilinir) ve anti-sigma faktörü MucA13bozulması . Hastaların balgam örneklerinden aljinat in in in üretimini izleyebilme yeteneği yeni tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Burada, pirimidin de novo sentezleyemeyen mutantların neden olduğu SCV varlığını tespit eden bir büyüme durumunu tanımlıyoruz. Urasil ve/veya sitozin takviyesi, pirimidin nükleotitinin azotlu tabanı, kurtarma yolunu aktive eder, böylece mutantlarda normal büyümeyi geri sağlar. Bu spesifik SCV mutantları için bu büyüme yöntemi, hasta örneklerinde pirimidin mutasyonlarını belirlemek için bir tarama yöntemi olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, p. aeruginosatarafından üretilen ve salgılanan aljinat tespiti ve ölçümü için iki yöntem tartışmak. İlk geleneksel yöntem14,15,16 asit yüksek konsantrasyon kullanarak polisakkarit aşağılayıcı ve daha sonra örnek konsantrasyonu quantitate için bir kolorimetrik gösterge ekleyerek. Laboratuvarımızda geliştirilen ikinci yöntem, QED Biosciences tarafından geliştirilen anti-aljinat monoklonal antikor (mAb) kullanarak Enzime Bağlı İmmünosorbent Assay (ELISA) kullanılmaktadır. ELISA yöntemi üronik asit tizinden daha spesifik ve hassas olduğunu kanıtlar ve yüksek konsantrasyonlu sülfürik asitten kaçınma nedeniyle daha güvenli kullanım sağlar. ELISA’nın aljinat ölçmek için doğrudan hasta balgam örneklerinde kullanılabilme özelliği ile, enfeksiyonun farklı dönemlerinde akciğerlerde bulunan aljinat miktarını takip etmek için bir izleme tanı aracı olarak geliştirilebilir.

Protocol

1. SCV Büyüme Koşulları ve Kurtarma Yolu Fizyolojik Aktivasyonu SCV tespiti. P. aeruginosa suşları PAO1, PAO1ΔpyrD, PAO581 ve PAO581ΔpyrD önceden ısıtılmış Pseudomonas izolasyon agar (PIA) plakaları üzerinde çizgi ve 48 saat için 37 °C’de büyür. Büyüme plakası üzerinde SCV fenotip (normal 3−5 mm koloni boyutu aksine 1−3 mm koloni boyutu) olan tek bir koloni izole tanımlayın. SCV’nin saf bir yalıtımını elde etmek için adı…

Representative Results

Şekil 1 PID geninde (pirimidin biyosentez yolunda ki bir gen) çerçeve içi deletion olan veya olmayan PAO1 ve PAO581 plakalarını gösterir ve bu plakalar SCV6ile sonuçlanır. PAO1 SCV mutanturasil takviyesi yanıt olarak normal büyüme geri yüklendi (Şekil 1A,B). Ayrıca, PAO581ΔpyrDSCV mutant aynı urasil tedavi ile mucoidy döndü, ebeveyn suşu PAO581 ek bir …

Discussion

Hem SCV hem de aljinat çeşitli kronik enfeksiyonlarda bulunan önemli hastalık belirteçleridir. Bu nedenle, SCV büyümek ve P. aeruginosa tarafından aljinat düzenleme ve üretim çalışma yeteneği bu kronik hastalıklar için yeni tedavilerin keşfi ayrılmaz bir parçasıdır.

SCV suşları diğer P. aeruginosa suşları ile karşılaştırıldığında onların yavaş büyüme hızı4 nedeniyle büyümek için kötü üne sahiptir, onların …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir R44GM113545 ve P20GM103434 hibe.

Materials

1-Step Ultra TMB-ELISA Thermo Scientific 34028 via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-4 Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry Bath Labnet NC0205808 via Fisher Scientific
Assay Plates 96-well CoStar 2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2 Scientific Industries G560
Boric Acid Research Products International Corp. 10043-35-3
Cabinet Incubator VWR 1540
Carbazole Sigma C-5132
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma C3041
Centrifuge Tubes (50 ml) Fisher Scientific 05-539-13 via Fisher Scientific
Culture Test Tubes Fisher Scientific 14-956-6D via Fisher Scientific
Cuvette Polystyrene (1.5 ml) Fisher Scientific 14955127 via Fisher Scientific
Cytosine Acros Organics 71-30-7
Diposable Inoculation Loops Fisher Scientific 22-363-597
D-Mannuronic Acid Sodium Sigma Aldrich SMB00280
FMC Alginate FMC 2133
Glycerol Fisher Scientific BP906-5 For Molecular Biology
Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody QED Biosciences N/A Lot # :15725/15726
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) Sigma P3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody Thermo Scientific 32230 via Fisher Scientific
Potassium Hydroxide Fisher Scientific 1310-58-3 via Fisher Scientific
Prism 7 GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA) Difco 292710 via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolation Broth (PIB) Alpha Biosciences P16-115 via Fisher Scientific
Round Toothpicks Diamond Any brand
Seaweed alginate (Protanal CR 8133) FMC Corporation
Skim Milk Difco 232100 via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer BioRad 170-2525 or preferred vendor
Sodium Chloride (NaCl) Sigma S-5886
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader Molecular Devices i3x or preferred vendor
Sterile Petri Dish 100mm x 15mm Fisher Scientific FB0875713 via Fisher Scientific
Sulfuric Acid Fisher Scientific A298-212 Technical Grade
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) R&D Systems DY994
Tween 20 Sigma P2287
Uracil Acros Organics 66-22-8

References

  1. Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
  2. Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
  3. Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
  4. Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
  5. Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
  6. Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
  7. Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
  8. Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
  9. Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
  10. Rehm, B. H. A., Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. , 55-71 (2009).
  11. Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
  12. Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
  13. Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
  14. Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
  15. Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
  16. Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).

Play Video

Cite This Article
Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate. J. Vis. Exp. (156), e60466, doi:10.3791/60466 (2020).

View Video