Summary
Здесь мы описываем надежный метод измерения митохондриальной массы и мембранного потенциала в ex vivo культивированных гематопоитических стволовых клетках и Т-клетках.
Abstract
Тонкий баланс покоя, самообновления и дифференциации является ключом к сохранению гематопоитической стволовых клеток (HSC) бассейн и поддерживать пожизненное производство всех зрелых клеток крови. В последние годы клеточный метаболизм стал важнейшим регулятором функции и судьбы HSC. Ранее мы продемонстрировали, что модуляция митохондриального метаболизма влияет на судьбу HSC. В частности, путем химического разъединения цепи транспортировки электронов мы смогли сохранить функцию HSC в культурных условиях, которые обычно вызывают быструю дифференциацию. Однако ограничение числа HSC часто исключает использование стандартных анализов для измерения метаболизма HSC и, следовательно, прогнозирования их функции. Здесь мы сообщаем о простом анализе цитометрии потока, который позволяет надежно измерять потенциал митохондриальной мембраны и митохондриальной массы в дефицитных клетках, таких как ГХК. Мы обсуждаем изоляцию ГХК от костного мозга мыши и измерение митохондриальной массы и мембранного потенциала после экс-виво культуры. В качестве примера мы показываем модуляцию этих параметров в ГХК с помощью лечения метаболическим модулятором. Кроме того, мы расширяем применение этой методологии на периферической крови человека полученных Т-клеток и опухоли человека проникают лимфоцитов (TILs), показывая значительные различия в их митохондриальных профилей, возможно, отражая различные Т-клетки Функциональность. Мы считаем, что этот анализ может быть использован в скринингах для выявления модуляторов митохондриального метаболизма в различных типах клеток в различных контекстах.
Introduction
Гематопоитические стволовые клетки (ГСК) представляют собой небольшую популяцию клеток, проживающих в костном мозге, обеспечивающих выработку крови и гомеостаза на протяжении всей жизни организма. HSCs посредника этот процесс, порождая прародителей, которые, в свою очередь, производят неизлечимо дифференцированных зрелых линий клеток крови через несколько раундов деления клеток и хорошо организованных шагов дифференциации1. Важно отметить, что HSCs производят свою энергию с помощью анаэробного гликолиза. В отличие от этого, более совершенные и активные гематопоитетические прародители переключают свой метаболизм в сторону митохондриального метаболизма2,3,4. Это четкое метаболическое состояние, как полагают, для защиты HSCs от клеточного повреждения, нанесенного реактивных видов кислорода (ROS), производимых активными митохондриями, тем самым сохраняя их долгосрочные функции in vivo5,6,7,8. Прямое измерение метаболического состояния HSC является сложной задачей и часто низкой пропускной всей связи из-за их ограниченного числа. Здесь мы описываем поток цитометрии на основе анализ для надежного измерения митохондриальной мембраны потенциал (зм) с использованием тетраметилходамамина метил-эфира (TMRM) флуоресценции, и митохондриальной массы с использованием зеленого флуоресцентного митохондриального пятна (MitoGreentracker) в HSCs. Ранее мы продемонстрировали, что низкий йм является добросовестным функциональным маркером высокоочищенных HSCs9 и метаболических модуляторов, способных снижать зм повышения функции HSCs9,10. Здесь мы предлагаем использовать наш метод на HSCs митохондриального профилирования в качестве стратегии для выявления новых молекул, способных улучшить долгосрочный потенциал восстановления крови HSCs.
В качестве примера мы демонстрируем, что этот асссеможно достоверно измеряет снижение HSC-m при воздействии витамина B3 аналогового никотинамида рибозида (NR). Соответственно, в нашем недавно опубликованном исследовании мы демонстрируем, что NR сильно улучшает восстановление крови посттрансплантации в мышиных и гуманизированных систем мыши путем непосредственного улучшения гематопоэтиных стволовых и прародителей функций10. Емкость таких метаболических модуляторов имеет большое клиническое значение, учитывая, что 25% смертности связано с задержкой в крови и иммунного восстановления у пациентов после трансплантации11,12.
Кроме того, мы предоставляем доказательства того, что эта методология может быть применена для характеристики метаболического профиля и функции т-клеток человека. В последние годы, развитие приемной клеточной терапии (ACT) с использованием аутологичных опухолей инфильтрации лимфоцитов (TILs) стала наиболее эффективным подходом для некоторых видов запущенного рака с крайне неблагоприятным прогнозом (например, метастатической меланомы, где йgt;50% пациентов реагируют на лечение и до 24% пациентов имеют полную регрессию)13. Тем не менее, TILs укрывательство достаточной противоопухолевой активности трудно генерировать14. Обширное пролиферация и стимуляция, что TILs проходят во время расширения ex vivo причиной истощения Т-клеток и сенесценции, которые резко ухудшают противоопухолевую реакцию Т-клеток15. Важно отметить, что противоопухолевые способности TILs тесно связаны с ихметаболизмом 16,17 и подходы, направленные на модулирование метаболизма через ингибирование PI3K/ Akt путь дали обнадеживающие результаты18,19. По этой причине мы сравниваем м-м Т-клеток, полученных из периферических моноядерных клеток крови (ПБМК) и ТЭЛ, полученных от пациента, и показываемому, что менее дифференцированные Т-клетки, полученные из PBMC, имеют более низкую и митохондриальную массу по сравнению с неизлечимо дифференцированными Тилами.
Мы предвидим, что этот асссможно использовать для определения новых метаболических модуляторов, которые улучшают функцию HSC и Т-клеток с помощью модуляции км.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, описанные в рукописи, следуют руководящим принципам нашего учреждения и проводились в соответствии со швейцарским законодательством для экспериментов на животных (Авторизация: VD3194) и для исследований с участием образцов человека (Протокол: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Гематопоиетическая извлечение стволовых клеток
- Приобретите диких мышей типа C57BL6/J и держите их в доме животных, по крайней мере, неделю, чтобы уменьшить связанный с транспортом стресс.
- В день эксперимента усыпляет мышь с помощью удушья CO2.
- Спрей мыши с 70% этанола для стерилизации меха и разрезать мышь на животе с помощью стандартных хирургических инструментов, таких как вскрытие ножницы и щипцы, чтобы сократить бедренной кости и кости голени из задних ног.
- Удалите мышцы, прикрепленные к бедренной кости, голени и тазу с помощью мягкого бумажного полотенца и поместите очищенные кости в трубку 50 мл, содержащую PBS с 1 мМ EDTA (буфер) на льду.
- Спрей раствор и пестик с 70% этанола и поместить его в капюшоне клеточной культуры. Стерилизовать его с УФ в течение 30 мин. Пост стерилизации промыть раствор и пестик с буфером, чтобы удалить следы этанола.
- Положите чистые кости с некоторым буфером (10 мл) в ступке и аккуратно раздавить их, чтобы получить костного мозга в подвеске. Теперь соберите суспензию клетки и передайте ее через 70 мкм-ситечко в трубку 50 мл, чтобы получить одноклеточное суспензию.
- Повторите шаг 1.6 до тех пор, пока не будет извлечен весь костный мозг и костяной мусор не побелел.
- Поместите трубку 50 мл(ы), содержащую суспензию клеток костного мозга, на центрифугу. Запустите центрифугу при 300 х г в течение 10 минут при 4 градусах По Цельсию, чтобы пропустить клетки.
- Между тем, подготовить 10 мл 1x РБК лисис буфера в автокклавированной дистиллированной воды. Фильтр раствора через фильтр 0,22 мкм.
- Соберите образец трубки из центрифуги и decant супернатанта. Pipette 1x РБК lysis буфера (Таблица материалов) на клетке гранулы. Выбить гранулы и подготовить однородный раствор путем pipetting вверх и вниз несколько раз. Разрешить трубку, чтобы быть при комнатной температуре в течение 1-2 мин для РБК lysis произойти. Остановите процесс лисиса, заполнив трубку буфером.
- Поместите трубку на центрифугу и вращайтесь при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию. Соберите трубку из центрифуги и декантируете супернатант. Отрежьте гранулы, добавив 10 мл буфера и отфильтруйте раствор в новую трубку 50 мл через ситечко 70 мкм для удаления мусора из-за лиза РБК.
- Центрифуга трубки на 300 х г в течение 5 мин при 4 c. Соберите трубку из центрифуги и декантируете супернатант. Приостановите гранулы в 500 л буфера.
- Снимите 100-й аликот и держите в отдельной трубке 1,5 мл. Добавьте 50 qL биотина линии деплации антитела коктейль из комплекта обогащения прародителя(Таблица материалов) в оставшиеся 450 зл клеточной подвески. Инкубировать при 4 градусах По цельсию на шейкере в течение 15 мин.
- Добавьте 15 мл буфера и центрифугию трубку при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Соберите трубку из центрифуги и декантируете супернатант. Отрежь гранулу в 460 л буфера. Снимите аликот 10 л и держите в отдельной трубке 1,5 мл.
- Добавьте 50 зЛ магнитных бусин стрептавидина из комплекта для обогащения прародителей(Таблица материалов),к оставшейся 450 суспензии клеток. Инкубировать при 4 градусах По цельсию на шейкере в течение 15 мин.
- Добавьте 15 мл буфера и центрифугию трубку при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Соберите трубку из центрифуги и декантируете супернатант. Отрежь гранулу в 5 мл буфера и перенесите раствор на трубку 15 мл.
- Возьмите трубку к автоматизированному сепаратору ячейки(Таблица материалов). Выполнить программу мытья, чтобы промыть и премьер трубки клеточного сепаратора. Поместите образец и две трубки для сбора на держатель трубки. Выполните разделение с помощью программы«Deplete». Соберите положительные и отрицательные фракции от автоматизированного сепаратора ячейки после завершения.
ПРИМЕЧАНИЕ: При отсутствии автоматического сепаратора ячейки пользователи могут использовать ручные магнитные столбцы и соответствующие магниты, в соответствии с руководством пользователя. Пользователи должны иметь в виду, что процесс ручного разделения медленнее, чем автоматизированный. Кроме того, ручные столбцы более склонны к засорению. Поэтому пользователям рекомендуется разбавлять образец и медленно загружать на столбец. - Откажитесь от положительной фракции. Заполните отрицательную фракционную трубку буфером. Центрифуга трубки на 300 х г в течение 5 мин при 4 c.
- Между тем, подготовить смесь антител в 1 мл окончательного объема решения и одноцветных элементов управления в 200 зл окончательного объема решения, как описано в таблице материалов и таблицы 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если TMRM и зеленый флуоресцентный митохондриальный пятно должны быть объединены с маркером стволовых клеток окрашивания, а затем заменить CD150-PE с CD150-PEcy5 и Streptavidin-Tx красный с Streptavidin-Pac Оранжевый. - Соберите образец трубки из центрифуги и decant супернатанта. Приостановите гранулы в 1 мл смеси антител. Добавьте 10 кЛ ячеек (от шага 1.13) в каждой из одноцветных контрольных труб (кроме линии). Добавьте 10 qL клеток (от шага 1.14) в линию одноцветной трубки.
- Инкубируйте образец и одноцветные трубки управления при 4 градусах цельсия на шейкере в течение 45 мин. Накройте ведро со льдом крышкой или алюминиевой фольгой.
- Заполните все трубки буфером и центрифугой при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию. Отбросьте супернатант и отразите образец в 1 мл буферного и одноцветного элемента управления в 200 л буфера.
- Перенесите образец и одноцветные элементы управления на 5 мл фильтра верхних труб ОКС.
- Возьмите трубки к сортировочную машину и сортируйте популяцию HSC (стратегия gating на рисунке 1A)в 1,5 мл труб, содержащих 400 л среды расширения стволовых клеток.
2. Ex Vivo Культура гематопоитических стволовых клеток
- Сбор труб, содержащих отсортированные клетки (см. раздел 1 для извлечения клеток). Центрифуга труб при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию. Аккуратно удалите большую часть супернатанта, не выбив гранулы и оставьте 50-80 Л л на верхней части клеточной гранулы. Это сводит к минимуму потерю клеток.
- Повторите пеллеты клетки в среде расширения стволовой клетки к окончательному объему, зависящему от количества условий, которые должны быть протестированы (счет на 100 Лл в скважине/состояние культуры).
- Подготовьте 2x культурную среду, содержащую среднюю линию расширения стволовых клеток, фактор стволовых клеток (200 нг/мл), лиганд FLT3 (4 нг/мл) и антибиотики пер-стрептококка (1%) (2x базальная среда; Таблица материалов).
- Возьмите стерильной культуры ткани лечение 96 U-дно хорошо пластины (Таблица материалов) и определить колодцы, где клетки будут культивированы (дизайн пластины на рисунке 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователям рекомендуется избегать маргинальных скважин, так как они более восприимчивы к испарению. - Положите 100 л 2x базального среднего ранее подготовлены в шаге 2.3 в этих скважинах. В NR отмечены хорошо добавить 2 злиц 100x NR решение(Таблица материалов). Пополнить NR каждые 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пополнение характерно для NR. Другие метаболические модуляторы могут или не могут нуждаться в пополнении. - Семя 100 л клеток, подготовленных в шаге 2.2 на верхней части скважин, содержащих 2x базальной среды. В этом эксперименте количество HSCs, посеянных на скважину, составляло от 800 до 1000 клеток.
- Подготовьте пять дополнительных скважин, содержащих 2x базальную среду. В каждом из них добавить 100000 целых клеток костного мозга (от шага 1.13) вновь в 100 зл стволовых клеток расширения среды, которые будут использоваться в качестве контроля за окрашиванием для анализа цитометрии поток после культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если пользователи хотят объединить маркеры стволовых клеток и митохондриальные маркеры для анализа посткультуры, рекомендуется дополнительно сортировать популяцию прародителей (либо клетки Ckit' или LKSCD150- клетки). Семена эти отсортированные прародители в окрашивающих контрольных скважин для анализа цитометрии посткультуры потока. Подготовка один хорошо за один цвет пятна. - Поместите 200 л автоклавированной воды во все окружающие скважины, чтобы уменьшить испарение из колодцев, содержащих клетки. Оставьте тарелку спокойной в инкубаторе при состоянии 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в течение всего периода культуры (72 ч). Снимите пластину, чтобы пополнить NR каждые 24 ч и поместите его обратно в инкубатор.
3. Измерение митохондриальной массы и мембранного потенциала
- В конце культурного периода подготовить 100x решение TMRM (20 мкм) и Mitotracker зеленый (10 мкм) (зеленый флуоресцентный пятно) в стволовых клеток расширения среды (Таблица материалов).
- Добавьте в каждую из испытательных скважин 2 л 100-x раствора TMRM и 2 Л 100-x зеленого флуоресцентного раствора. Добавьте 2 злиц 100x TMRM в управление TMRM хорошо. Добавьте 2 Зл из 100-x зеленого флуоресцентного пятна в управлении Mitotracker хорошо. Поместите пластину обратно в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение 45 мин. Обложка верхней части пластины с алюминиевой фольгой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный контроль с Verapamil (ингибитор насоса ABC) может быть подготовлен, если ABC насос опосредованной красителя efflux необходимо проверить. Для этого добавьте 50 мкм Верапамил в одном из испытательных скважин 1 ч перед окрашиванием для TMRM и зеленого флуоресцентного пятна. - Выньте пластину из инкубатора и центрифуги его на 300 х г в течение 5 мин. Перевернуть пластину, чтобы удалить супернатант. Добавьте 200 кЛ стандартного буфера FACS (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), центрифугу пластину на 300 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант. Повторите этот шаг стирки 3x. Пользователи должны убедиться, что пластина всегда покрыта фольгой, чтобы обеспечить минимальное воздействие прямого света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если пользователям необходимо объединить митохондриальные окрашивания с стволовыми клетками окрашивания, образец должен быть инкубирован с антитела смесь всех маркеров стволовых клеток и одноцветных элементов управления должны быть окрашены отдельными антителами отдельно при 4 C в течение 30-45 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: На всех шагах пользователи должны держать пластину покрытой алюминиевой фольгой. Пользователи должны отметить, что этот дополнительный шаг окрашивания и последующие шаги стирки может привести к дополнительной потере ячейки. - Повторное увеличение количества ячеек в 200 кЛ буфера FACS и передача в трубки FACS.
- Выполнить образцы на поток цитометра (см. Рисунок 1). Одноцветные трубки, содержащие WBM, включают: (1) Неокрашенные; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) зеленое флуоресцентное пятно (FITC); (5) Полное пятно (PE и FITC).
- Сначала приобретете одноцветные элементы управления для настройки машины. Используйте работая программное обеспечение на машине для расчета компенсации. Как только компенсация была применена, приобрести образец HSC и записывать как можно больше событий, как это возможно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если стволовые клетки и митохондриальные маркеры объединены, пользователи должны быть особенно осторожны с компенсацией между TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) и Sca-1 (APC). Кроме того, образцы должны быть запущены сразу же после окрашивания. - Экспорт ФАЙЛОВ FACS из цитометра и анализ данных по анализу программного обеспечения(Таблица материалов).
- Для анализа откройте файл на программном обеспечении для анализа. Использование FSC-A и SSC-A gating идентифицирует популяцию клеток. Определите синглетов в следующих воротах перед построением отрицательной фракции DAPI (живые ячейки). В живых ворот ячейки сделать контур ный участок в TMRM и зеленый флуоресцентный пятно канал для измерения мм и массы, соответственно(Рисунок 2A). Экспорт средней интенсивности флуоресценции (МФО) этих двух каналов в воротах живых ячеек.
- Низкие ворота TMRM устанавливаются на основе плечевой популяции в канале TMRM. Одноцветный контроль TMRM может быть использован для идентификации этой популяции плеч для установки ворот. Экспорт доля живых клеток в TMRM низкие ворота в вашем контроле и тест образцов для построения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 мы показываем стратегию gating для изоляции гематопоитических стволовых клеток из костного мозга мыши и макет пластины для их ex vivo культуры. На рисунке 1А показано определение фракции лимфоцитов на участке SSC-A/FSC-A. Даблты были удалены в одноразовые ворота, а затем идентификация живых клеток из-за отсутствия сигнала DAPI. Была определена популяция ЛКС, определяемая по линии - Sca1иcKit, была идентифицирована. Эта популяция, как известно, содержат стволовые и клетки-прародители. HSCs образуют около 5-10% клеток в популяции ЛКС и были определены gating для CD150иCD48- населения. Рисунок 1B представляет собой макет 96-колодской пластины для культуры ex vivo. Сортированные HSCs были покрыты в различных условиях культуры: В этом случае, контроль и NR дополняют условия культуры. Целые клетки костного мозга были также покрыты одноцветными элементами управления, как описано в протоколе. Важно заполнить все окружающие колодцы водой, чтобы избежать испарения носителей из клеточных колодцев. Кроме того, как упоминалось ранее, маргинальных скважин избегали для клеточной культуры, поскольку они более восприимчивы к испарению.
На рисунке 2 показаны измерения потенциала митохондриальной мембраны (ЗМ) и массы в пост-культуре HSCs. На рисунке 2А показаны репрезентативные участки уровней ПМРМ (см. выше) и зеленые флуоресцентные митохондриальные пятна (см. ниже) в HSCs, культивированные в контроле, и NR дополняют условия. NR лечение показало явное увеличениечисленности населения TMRM низкой. На рисунке 2B показана количественная оценка по трем независимым образцам. Лечение NR значительно увеличило долю клеток внизких воротах TMRM и показало значительное снижение интенсивности флуоресценции TMRM. Митохондриальная масса (представленная зелено-флуоресценцией интенсивность) не изменилась при NR добавок. Кроме того, мы объединили маркер стволовых клеток окрашивания с митохондриальной культуры окрашивания. На рисунке 2C показана стратегия gating для выявления HSCs от линии отрицательных и LKS популяций пост культуры в двух условиях культуры. TMRM и зеленый флуоресцентный митохондриальный профиль пятна этих закрытых HSCs видно на рисунке 2D. Воздействие NR показал значительное увеличение %TMRMнизкой численности населения и значительное снижение интенсивности флуоресценции TMRM в закрытых HSCs. Зеленый флуоресцентный митохондриальный зеленый сигнал пятна остался неизменным в двух условиях.
На рисунке 3 показаны измерения потенциала митохондриальной мембраны (КМ) и массы в различных Т-клетках человека: периферических моноядерных клетках крови (ПБМК)CD4 иCD8 и Т-клеток, а также CD4и CD8- опухоли, проникающие в лимфоциты (TILs) после быстрого протокола расширения (REP). На рисунке 3А показаны репрезентативные участки уровней TMRM (см. выше) и зелено-флуоресцентных уровней митохондриального пятна (см. ниже) циркулирующих (PBMC) и инфильтрационных опухолей (TIL) CD4 и CD8 и T-клеток. TILs показали явное увеличение TMRM и зеленый флуоресцентный сигнал пятен пятен по сравнению с циркулирующими Т-клетками. На рисунке 3B показана количественная оценка МФО ПМРМ и зеленый флуоресцентный митохондриальный окрашивание. TILs отображаются выше TMRM и зеленый флуоресцентных митохондриальных окрашивающих сигналов по сравнению с PBMC полученных Т-клеток. Эти данные свидетельствуют о том, что TILs имеют выдающийся метаболический профиль с повышенной массой и митохондриальной массой.
Рисунок 1: Изоляция и культура гематопогетических стволовых клеток. (A) Стратегия Гатинга для изоляции гематопоиетических стволовых клеток (HSCs) на основе маркеров поверхности клеток. HSCs были определены как линия- Sca1q cKit(LKS) CD150иCD48-. (B) Дизайн 96 хорошо пластины положить в культуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Митохондриальные профили HSCs. (A) FACS контурный участок, показывающий HSCs пост-культуры в базальных или NR дополненных условиях. Показаны профили TMRM (выше) и зеленого флуоресцентного митохондриального пятна (Mitotracker) (см. ниже). (B) Количественная оценка TMRM и зеленый флуоресцентный сигнал митохондриального пятна. NR добавок привело к снижению профиля TMRM при сохранении зеленого флуоресцентного митохондриального пятна сигнала. (C) Контур ные планы, показывающие идентификацию населения HSC в контроле и NR дополнены условия пост-культуры. (D) Контурные участки и количественные TMRM и зеленый флуоресцентный митохондриальный сигнал пятен в фенотипической HSCs пост-культуры. NR добавок сократили сигнал TMRM в то время как зеленый флуоресцентный митохондриальный сигнал пятен остался неизменным в HSCs. Студенческая т тест "p"p slt; 0.001, p slt; 0.01, p lt; 0.05, не значительные 0,05, бары ошибок .
Рисунок 3: Митохондриальные профили человеческих ПБМК и TILs: (A) FACS контурный сюжет, показывающий CD4и CD8, недавно изолированные от ПБМК или опухолевыхCD4 и CD8- после REP (протокол быстрого расширения). Показаны профили TMRM (выше) и зеленого флуоресцентного митохондриального пятна (Mitotracker) (см. ниже). (B) Количественная оценка TMRM и зеленый флуоресцентный сигнал митохондриального пятна. TILs отображаются ниже митохондриальной активности и массы. Студенческий t-тест ps lt; 0.001,p slt; 0.01,p qlt; 0.05, не значительной йgt; 0.05, бары ошибок sS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой цифры.
| S.No | Название антитела | Рабочий разбавление |
| 1 | Стрептавидин Tx красный | 1/200 |
| 2 | АТКSSS1 | 1/200 |
| 3 | Ckit PeCy7 | 1/100 |
| 4 | CD150 PE | 1/100 |
| 5 | CD48 PB | 1/100 |
| Использовать только в том случае, если стволовые клетки и митохондриальные маркеры вместе взятые. | ||
| 6 | Стрептавидин Пак оранжевый | 1/200 |
| 7 | CD150 PE-Cy5 | 1/100 |
Таблица 1: Разбавления антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Строгое регулирование функции HSC важно для поддержания стабильного гематопоеза в течение жизни организма. Как и различные другие типы клеток в организме, ключевым компонентом, который способствует регуляции функции HSC является клеточный метаболизм. Предыдущие исследования из нашей лаборатории9 и другие2,3 причастны важность митохондрий в поддержании четкого метаболического состояния в HSCs. Из-за крайне низкого числа HSCs изолированы от мочеиспускательного мозга, трудно анализировать их с помощью стандартных метаболических анализов (например, потребление кислорода с SeaHorse). Основываясь на нашей предыдущей работе, мы стандартизировали простой анализ цитометрии потока для надежного измерения митохондриальной массы и мембранного потенциала (косвенное считывание активности) в низком количестве клеток (т.е. ГХК). Этот анализ позволяет измерения на живых клетках без ущерба для их жизнеспособности9, что делает их доступными для любых вниз по течению функциональных анализов (таких, как CFUs или трансплантации костного мозга), что пользователи, возможно, пожелает выполнить. Мы предвидим этот анализ, используемый в скрининговых экспериментах, что позволяет быстро считывать митохондриальный профиль HSCs из различных генетических фонов или нокаут моделей. Важно отметить, что наш анализ может быть объединен с CFSE окрашивания иметь двойной считывания на HSC распространения и его митохондриальный профиль9,10, что позволяет анализ метаболических судьба деления HSCs. Учитывая, что это трудная процедура окрашивания, и мы работаем с низким количеством клеток (HSCs), важно, чтобы после центрифугирования пользователи всегда оставляют 80-100 Л раствора в трубках, чтобы свести к минимуму потерю клеток. Кроме того, во время всех пост окрашивания шаги труб или пластин должны быть защищены от света, либо покрывая их в фольге или работающих в условиях низкой освещенности. Если пользователи решили объединить HSC пятно с митохондриальными красителей они должны проверить, если компенсация выполняется правильно, особенно между TMRM (PE), PeCy5, и APC.
Важно отметить, что недавняя публикация ставит под сомнение использование митохондриальных красителей в HSCs, потому что они могут быть восприимчивы к насосу efflux. Эти исследования сообщают, что большинство примитивных гематопоитических отсеков имеют большее количество митохондрий по сравнению с их совершенные прародителя20. По нашему опыту, использование мыши генетических моделей (мито eGFP мышей21), митохондрии красителя независимых методов окрашивания (TOM20 антитела), анализ ЦПЦР поддерживает представление о том, что большинство примитивных гематопоиетических отсеков имеют более низкое содержание митохондрий10. Мы считаем, что для выяснения этого несоответствия в этой области необходимо провести дальнейшие исследования.
Параллельно мы демонстрируем, что использование митохондриального профилирования может быть использовано для определения метаболической пригодности человека TILs и разработки метаболических стратегий, направленных на восстановление функции исчерпаны Т-клеток. В самом деле, Т-клетки, изолированные от PBMCs дисплей нижней митохондриальной активности (TMRM) и массы (Mitotracker Зеленый), в то время как более исчерпаны Т-клеток, таких как TILs имеют более высокую митохондриальную активность и массу, предполагая возможное метаболическое перепрограммирование происходит во время истощения. Соответственно, предыдущие опубликованные исследования показали, что стволовые клетки, как память Т-клеток (TSCM), Т-клетки с повышенной настойчивостью и способны долгосрочной реакции отзыва, имеют более низкие м и лечения ориентации метаболизма Т-клеток может сильно влиять на их функцию22,23.
Наконец, мы считаем, что наш подход может быть ценным инструментом для выявления новых соединений, которые могут восстановить дисфункциональные ГХК (например, старение или гематологические злокачественные новообразования) путем восстановления их митохондриальной пригодности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Некоторые элементы этой работы были представлены в качестве заявки P1828EP00 в Европейское патентное ведомство.
Acknowledgments
Мы благодарим основной фонд ЦИтометрии UNIL Flow за их поддержку, особенно д-ра Ромена Беделя. Эта работа была поддержана грантом Фонда Кристиана Герхарда Джебсена N.V и O.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J.
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
