Summary
Her beskriver vi en pålitelig metode for å måle mitokondrie masse og membran potensial i ex vivo kultivert blodkreft stamceller og T-celler.
Abstract
En fin balanse mellom fredfulle omgivelser, selv-fornyelse, og differensiering er nøkkelen til å bevare blodkreft stilk cellen (HSC) basseng og opprettholde livslang produksjon av alle eldre blodlegemer. I de senere årene cellulære metabolisme har dukket opp som en avgjørende regulator av HSC funksjon og skjebne. Vi har tidligere demonstrert at modulering av mitokondrie metabolisme påvirker HSC skjebne. Spesielt ved kjemisk frakobling av elektron transport kjeden var vi i stand til å opprettholde HSC funksjon i kultur forhold som normalt induserer rask differensiering. Men begrenser HSC tall ofte utelukker bruk av standard analyser for å måle HSC metabolisme og derfor forutsi deres funksjon. Her rapporterer vi en enkel flyt flowcytometri analysen som gir pålitelig måling av mitokondrie membran potensial og mitokondrie masse i knappeceller som HSCs. Vi diskuterer isolering av HSCs fra mus benmarg og måling av mitokondrie masse og membran potensial post ex vivo kultur. Som et eksempel, viser vi modulering av disse parametrene i HSCs via behandling med en metabolsk modulator. Videre utvider vi anvendelsen av denne metodikken på menneskelige perifere blod-avledet T celler og menneskelige tumor infiltrere lymfocytter (TILs), viser dramatiske forskjeller i deres mitokondrie profiler, muligens reflekterer ulike T-celle Funksjonalitet. Vi tror denne analysen kan være ansatt i screenings for å identifisere modulatorer av mitokondrie metabolisme i ulike celletyper i ulike sammenhenger.
Introduction
Blodkreft stamceller (HSCs) er en liten populasjon av celler som er bosatt i benmargen sikre blod produksjon og homeostase gjennom en organisme liv. HSCs megle denne prosessen ved å gi opphav til forfedre som i sin tur produsere uhelbredelig differensiert modne blodlegemer linjene via flere runder med celledeling og godt orkestrert differensiering trinn1. Viktigere, HSCs produsere sin energi via anaerob Glykolysen. I kontrast, mer engasjerte og aktive blodkreft forfedre slå sine metabolisme mot mitokondrie metabolisme2,3,4. Denne distinkte metabolske tilstanden antas å beskytte HSCs fra cellulære skader påført av reaktive oksygen arter (ros) produsert av aktiv mitokondrier, og dermed opprettholde sin langsiktige in vivo-funksjon5,6,7,8. Direkte måling av HSC metabolske tilstand er utfordrende og ofte lav gjennomstrømning på grunn av deres begrensede tall. Her beskriver vi en Flow flowcytometri-basert analyse for robust måling av mitokondrie membran potensial (ΔΨm) bruker tetramethylrhodamine metyl Ester (TMRM) fluorescens, og mitokondrie massen ved hjelp av en grønn fluorescerende mitokondrie flekken (Mitotracker Green) i HSCs. Vi har tidligere vist at lav ΔΨm er en bona-fide funksjonell markør av høyt renset HSCs9 og metabolske modulatorer i stand til å senke ΔΨm forbedre HSCs funksjon9,10. Her foreslår vi bruk av vår metode på HSCs mitokondrie profilering som strategi for å identifisere romanen molekyler i stand til å forbedre HSCs ' langsiktige blod rekonstituering potensial.
Som et eksempel, viser vi at denne analysen pålitelig måler senking av HSC ΔΨm upon eksponering for vitamin B3 analoge nikotinamid riboside (NR). Følgelig, i vår nylig publiserte studien viser vi at NR sterkt ameliorates blod utvinning posttransplant i både mus og humanisert mus systemer ved direkte å forbedre blodkreft stammen og stamfar funksjoner10. Kapasiteten til slike metabolske modulatorer er av stor klinisk verdi med tanke på at en 25% dødsrate er knyttet til forsinkelse i blod og uimottakelig utvinning hos posttransplanted pasienter11,12.
Videre gir vi bevis for at denne metodikken kan anvendes for karakterisering av metabolsk profil og funksjon av menneskelige T-celler. I de senere årene har utviklingen av adoptiv celle terapi (ACT) ved hjelp av autologous tumor infiltrere lymfocytter (TILs) blitt den mest effektive tilnærmingen for visse typer av avansert kreft med ekstremt ugunstig prognose (for eksempel metastatisk melanom, der > 50% av pasientene reagerer på behandling og opptil 24% av pasientene har fullstendig regresjon)13. Men TILs harboring tilstrekkelig antitumor aktivitet er vanskelig å generere14. Den omfattende spredning og stimulering som TILs gjennomgår under ex vivo ekspansjon forårsake T celle utmattelse og senescence som dramatisk svekker T celle antitumor respons15. Viktigere er TILs ' antitumoral kapasitet tett knyttet til metabolismen16,17 og tilnærminger som tar sikte på å modulere metabolisme gjennom hemming av PI3K/akt veien har produsert oppmuntrende resultater18,19. Av denne grunn, sammenligner vi ΔΨm av T-celler avledet fra perifere blod mononukleære celler (Pbmc) og pasient-avledet TILs, og viser at mindre differensiert PBMC-avledet T-celler har lavere ΔΨm og mitokondrie masse i forhold til uhelbredelig differensiert TILs.
Vi ser for oss at denne analysen kan brukes til å identifisere romanen metabolske modulatorer som forbedrer HSC og T celle funksjon via modulering av ΔΨm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter som er beskrevet i manuskriptet følger retningslinjene for institusjonen vår og ble utført i samsvar med sveitsisk lov for dyr eksperimentering (Authorization: VD3194) og for forskning som involverer menneskelige prøver (protokoll: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. blodkreft Stem Cell utvinning
- Kjøp Wild type C57BL6/J mus og holde dem i dyre huset i minst en uke for å redusere transport-assosiert stress.
- På dagen for eksperimentet, euthanize musen ved hjelp av CO2 kvelning.
- Spray musen med 70% etanol å sterilisere pelsen og kutt åpne musen på magen ved hjelp av standard kirurgiske verktøy, for eksempel disseksjon saks og tang, for å kutte femur og Tibia bein fra bakbena.
- Fjern musklene festet til femur, Tibia, og bekkenet ved hjelp av en myk papir håndkle og plassere renset bein i en 50 mL rør som inneholder PBS med 1 mM EDTA (buffer) på isen.
- Spray en mørtel og morter med 70% etanol og plassere den i en cellekultur hette. Sterilisere den med UV i 30 min. post sterilisering skyll mørtel og morter med buffer for å fjerne spor av etanol.
- Sett rene bein med noen buffer (~ 10 mL) i mørtel og forsiktig knuse dem for å få benmargen ut i suspensjon. Nå, samle cellen suspensjon og passerer det gjennom en 70 μm celle sil i en 50 mL rør for å få en enkelt celle suspensjon.
- Gjenta trinn 1,6 til alle benmargen er trukket ut og bein rester har blitt hvit.
- Plasser 50 mL røret (e) som inneholder benmargen enkelt celle fjæring på en sentrifuge. Kjør sentrifuger på 300 x g i 10 min ved 4 ° c til pellet cellene.
- I mellomtiden forbereder 10 mL 1x RBC lyseringsbuffer i autoklaveres destillert vann. Filtrer løsningen gjennom et 0,22 μm-filter.
- Samle prøve røret fra sentrifuge og Dekanter supernatanten. Pipetter 1x RBC lyseringsbuffer (tabell av materialer) på cellen pellet. Løsne pellet og utarbeide en homogen løsning ved pipettering opp og ned et par ganger. La røret til å være ved romtemperatur i 1 – 2 min for RBC lyse å forekomme. Stopp lyse Rings prosessen ved å fylle opp røret med buffer.
- Plasser røret på en sentrifuge og snurr på 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Samlerøret fra sentrifuge og Dekanter supernatanten. Resuspend pellet ved å legge 10 mL buffer og filtrere løsningen inn i en ny 50 mL rør via en 70 μm celle sil for å fjerne rusk på grunn av RBC lyse.
- Sentrifuger røret ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Samlerøret fra sentrifuge og Dekanter supernatanten. Resuspend pellets i 500 til μL av buffer.
- Fjern en 100 μL alikvot og oppbevar den i et separat 1,5 mL rør. Tilsett 50 μL av biotin avstamning-en cocktail fra Stam utstyrs settet (materialfortegnelsen) til de resterende 450 μL av celle fjæring. Ruge ved 4 ° c på en shaker i 15 minutter.
- Tilsett 15 mL buffer og sentrifuger røret ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Samlerøret fra sentrifuge og Dekanter supernatanten. Resuspend pellets i 460 til μL av buffer. Fjern en 10 μL alikvot og oppbevar den i et separat 1,5 mL rør.
- Tilsett 50 μL av streptavidin magnetiske perler fra Stam utstyrs settet (tabell av materialer), til de resterende 450 μL celle fjæring. Ruge ved 4 ° c på en shaker i 15 minutter.
- Tilsett 15 mL buffer og sentrifuger røret ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Samlerøret fra sentrifuge og Dekanter supernatanten. Resuspend pellet i 5 mL buffer og overføre løsningen til en 15 mL tube.
- Ta tuben til et automatisert celle skille (tabell med materialer). Kjør et vaskeprogram for å skylle og Prime slangen av celle skillet. Plasser prøven og de to oppsamlings rørene på rør holde ren. Utfør separasjon ved hjelp av "tømme" programmet. Samle de positive og negative fraksjonene fra det automatiserte celle skillet når kjøringen er avsluttet.
Merk: I fravær av en automatisk celle separator brukerne kan bruke manuelle magnetiske kolonner og tilsvarende magneter, per brukermanualen. Brukerne bør huske på at prosessen med manuell separasjon er tregere enn den automatiserte en. De manuelle kolonnene er også mer utsatt for tilstopping. Derfor er brukere rådes til å fortynne prøven og belastningen på kolonnen langsomt. - Forkast den positive fraksjonen. Fyll det negative brøk røret med buffer. Sentrifuger røret ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c.
- I mellomtiden klargjør antistoff blandingen i 1 mL endelig volum løsning og enkelt fargekontrollene i 200, μL av endelig volum løsning som beskrevet i tabell over materialer og tabell 1.
Merk: Hvis TMRM og den grønne fluorescerende mitokondrie flekken er å bli kombinert med stilk cellen markør farging, deretter erstatte CD150-PE med CD150-PEcy5 og Streptavidin-TX rød med Streptavidin-PAC Orange. - Samle prøve røret fra sentrifuge og Dekanter supernatanten. Resuspend pellet i 1 mL antistoff mix. Tilsett 10 μL av celler (fra trinn 1,13) i hver enkelt fargekontroll rør (unntatt avstamning). Tilsett 10 μL av celler (fra trinn 1,14) i slektslinjen enkelt farge rør.
- Ruge prøven og enkelt fargekontroll rørene ved 4 ° c på en shaker i 45 min. dekk til is bøtte med lokk eller aluminiumsfolie.
- Fyll alle rør med buffer og sentrifuge ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten og resuspend prøven i 1 mL buffer og en-fargekontroller i 200 til μL av buffer.
- Overfør prøven og enkelt fargekontrollene til 5 mL filter topp FACS-rør.
- Ta rørene til sorterings maskinen og Sorter HSC-populasjonen (gating strategi i figur 1A) i 1,5 mL rør som inneholder 400 μL av Stamcelle Utvidelses medium.
2. ex vivo kultur av blodkreft stamceller
- Samle rør som inneholder sorterte celler (se pkt. 1 for celle ekstraksjon). Sentrifuger rørene ved 300 x g i 5 min ved 4 ° c. Fjern forsiktig det meste av supernatanten uten å dislodging på pellet og la 50 – 80 μL oppå celle pellet. Dette minimerer celle tap.
- Resuspend cellen pellet i Stamcelle utvidelse medium til et endelig volum avhengig av hvor mange forhold som skal testes (telle for 100 μL per brønn/tilstand av kultur).
- Forbered et 2x kultur medium som inneholder stilk cellen ekspansjon medium, stilk cellen faktoren (200 ng/mL), FLT3 ligand (4 ng/mL) og penn-strep antibiotika (1%) (2x basal medium; Tabell med materialer).
- Ta en steril vev kultur behandlet 96 U-Bottom brønn plate (tabell over materialer) og identifisere brønnene der cellene vil bli kultivert (plate design i figur 1B).
Merk: Brukere rådes til å unngå marginale brønner, da de er mer utsatt for fordampning. - Sett 100 μL av 2x basal medium tidligere fremstilt i trinn 2,3 i disse brønnene. I NR merket brønnen Tilsett 2 μL av en 100-NR løsning (tabell av materialer). Etterfylle NR hver 24 h.
Merk: Etterfylling er spesifikk for nr. Andre metabolske modulatorer kan eller ikke trenger etterfylling. - Seed 100 μL av celler fremstilt i trinn 2,2 på toppen av brønnene som inneholder 2x basal medium. I dette eksperimentet antall HSCs seeded per brønn var mellom 800-1000 celler.
- Forbered fem ekstra brønner som inneholder 2x basal medium. I hver av disse legger 100 000 hele benmargceller (fra trinn 1,13) resuspendert i 100 μL av Stamcelle utvidelse medium som skal brukes som fargekontroller for post kultur flyt flowcytometri analyse.
Merk: Hvis brukerne ønsker å kombinere stilk cellen markører og mitokondrie markører for post kultur analyse er det anbefalt å i tillegg sortere Stam befolkningen (enten ckit + celler eller LKSCD150-celler). Seed disse sortert forfedre i farging kontroll brønner for post kultur flyt flowcytometri analyse. Forbered en brønn per enkelt farge. - Sett 200 μL av autoklaveres vann i alle omkringliggende brønner for å redusere fordampning fra brønner som inneholder celler. La platen bli uforstyrret i en inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 for varigheten av kultur perioden (72 h). Fjern platen for å etterfylle NR hver 24 h og plasser den tilbake i inkubator.
3. måling av mitokondrie masse og membran potensial
- På slutten av kultur perioden utarbeide en 100-oppløsning av TMRM (20 μM) og Mitotracker grønn (10 μM) (grønn fluorescerende beis) i Stamcelle Utvidelses medium (tabell over materialer).
- Tilsett 2 μL 100-TMRM løsning og 2 μL av 100, grønn fluorescerende beis løsning i hver av test brønnene. Tilsett 2 μL 100 TMRM i TMRM-kontrollen godt. Tilsett 2 μL 100-Mitotracker grønn fluorescerende beis i kontroll brønnen. Plasser platen tilbake i en inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 for 45 min. dekke toppen av platen med aluminiumsfolie.
Merk: En ekstra kontroll med Verapamil (ABC pumpe inhibitor) kan være forberedt hvis ABC pumpen mediert Dye utstrømming må testes. For dette, tilsett 50 μM Verapamil i en av test brønnene 1 time før farging for TMRM og grønt fluorescerende beis. - Fjern platen fra inkubator og sentrifuger den på 300 x g i 5 min. invertere platen for å fjerne supernatanten. Tilsett 200 μL av standard FACS-buffer (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), sentrifuger platen ved 300 x g i 5 min. Fjern supernatanten. Gjenta dette vaske trinnet 3x. Brukerne må sørge for at platen er alltid dekket med folie, for å gi minimal eksponering for direkte lys.
Merk: Hvis brukerne trenger å kombinere mitokondrie flekker med stilk cellen farging, vil prøven må inkubert med et antistoff blanding av alle stilk cellen markører og Single-fargekontrollene må beiset med individuelle antistoffer separat ved 4 ° c for 30-45 min.
Merk: På alle trinn brukere må holde platen dekket med aluminiumsfolie. Brukere må være oppmerksom på at dette ekstra farge trinnet og påfølgende vasketrinn kan føre til ytterligere celle tap. - Resuspend cellene i 200 μL av FACS buffer og Overfør til FACS-rør.
- Kjør prøvene på strømnings flowcytometer (se figur 1). Én farge rør som inneholder WBM inkluderer: (1) unstained; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) grønn fluorescerende beis (FITC); (5) full flekk (PE og FITC).
- Hent først kontrollene for én farge for å konfigurere maskinen. Bruk programvaren som kjører, på maskinen til å beregne kompensasjonen. Når kompensasjon er brukt, erverve HSC prøven og ta opp så mange hendelser som mulig.
Merk: Hvis Stamcelle-og mitokondrie markører kombineres, må brukerne være spesielt forsiktige med kompensasjon mellom TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) og SCA-1 (APC). Dessuten bør prøvene kjøres umiddelbart innlegg flekker. - Eksporter FACS-filene fra flowcytometer, og analyser dataene i en analyseprogramvare (tabell med materialer).
- For analysen, åpne filen på analyseprogramvaren. Ved hjelp av FSC-A og SSC-A gating identifisere cellen befolkningen. Identifiser singleter i de neste portene før du tegner inn den DAPI negative fraksjonen (aktive celler). I live celle gate lage en kontur plott i TMRM og grønne fluorescerende flekken kanal for å måle ΔΨm og masse, henholdsvis (figur 2a). Eksporter gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) av disse to kanalene i den aktive celle porten.
- TMRM lave port er satt basert på skulder populasjonen i TMRM kanalen. TMRM enkelt fargekontroll kan brukes til å identifisere denne skulder populasjonen å sette porten. Eksportere andelen av Live av celler i TMRM lave porten i kontroll og testprøver for plotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 viser vi gating strategi for isolering av blodkreft stamceller fra musen benmargen og utformingen av platen for deres ex vivo kultur. Figur 1A viser identifisering av LYMFOCYTTER brøkdel i SSC-en/FSC-et plott. Doublets ble fjernet i singlet gate etterfulgt av identifisering av levende celler ved fravær av DAPI signal. LKS-populasjonen, definert av slektslinje-Sca1+cKit+, ble identifisert. Denne populasjonen er kjent for å inneholde stilk og stamceller. HSCs form rundt 5-10% av cellene i LKS befolkningen og ble identifisert av gating for CD150+CD48- befolkning. Figur 1B representerer utformingen av 96-brønn platen for ex vivo-kultur. Sorterte HSCs ble belagt i ulike kultur forhold: i dette tilfellet, kontroll og NR supplert kultur forhold. Hele benmargceller ble også belagt som én fargekontroller som beskrevet i protokollen. Det er viktig å fylle alle omkringliggende brønner med vann for å unngå fordamping av medier fra celle-inneholdende brønner. Videre, som nevnt tidligere, ble marginale brønner unngått for cellekultur fordi de er mer utsatt for fordampning.
Figur 2 viser måling av mitokondrie membran potensial (ΔΨm) og massen i HSCs post kultur. Figur 2A viser representative tomter TMRM nivåer (over) og grønne fluorescerende mitokondrie flekken (under) i HSCs KULTIVERT i kontroll og nr supplert forhold. NR behandling viste en klar økning i TMRMlav befolkning. Figur 2B viser kvantifisering fra tre uavhengige prøver. NR behandling betydelig økt andelen av celler i TMRMlav gate og viste en betydelig SENKING av TMRM fluorescens intensitet. Mitokondrie masse (representert ved grønn-fluorescens intensitet) endret ikke på NR kosttilskudd. I tillegg kombinerte vi Stamcelle merket farging med mitokondrie farging etter kultur. Figur 2C viser gating strategi for å identifisere HSCs fra avstamning negative og LKS populasjoner etter kultur i de to kultur forhold. Den TMRM og grønne fluorescerende mitokondrie beis profil av disse gated HSCs er sett i figur 2D. Eksponering for NR viste en signifikant økning i% TMRMlave befolkning og en signifikant NEDGANG i TMRM fluorescens intensitet i gated HSCs. Den grønne fluorescerende mitokondrie flekk grønt signal forble uendret i de to forholdene.
Figur 3 viser måling av mitokondrie membran potensial (ΔΨm) og masse i forskjellige menneskelige T-celler: perifere blod mononukleære celler (PBMC) CD4+ og CD8+ T celler, samt CD4+ og CD8+ tumor infiltrere LYMFOCYTTER (TILs) etter den raske utvidelsen Protocol (rep). Figur 3A viser representative plott av TMRM nivåer (over) og grønn-fluorescerende mitokondrie beis nivåer (under) av sirkulerende (PBMC) og TUMOR-INFILTRERE (til) CD4+ og CD8+ T celler. TILs viste en klar økning i TMRM og grønt fluorescerende mitokondrie flekken signal i forhold til sirkulerende T-celler. Figur 3B viser MFI-kvantifisering av TMRM og grønt fluorescerende mitokondrie farging. TILs vist høyere TMRM og grønt fluorescerende mitokondrie farging signaler sammenlignet med PBMC-avledet T celler. Disse dataene tyder på at TILs har en fremragende metabolsk profil med økt ΔΨm og mitokondrie masse.
Figur 1: isolasjon og kultur av blodkreft stamceller. (A) gating strategi for isolering av blodkreft stamceller (HSCs) basert på celleoverflaten markører. HSCs ble identifisert som Lineage-Sca1+ cKit+ (LKS) CD150+CD48-. (B) Design av 96 brønn plate satt i kultur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: mitokondrie profiler av HSCs. (A) FACS Contour plot viser HSCs innlegg kultur i basal eller nr supplert forhold. TMRM (over) og grønne fluorescerende mitokondrie beis (Mitotracker) (under) profiler vises. (B) KVANTIFISERING av TMRM og grønt fluorescerende mitokondrie flekk signal. NR tilskudd resulterte i en nedgang i TMRM profil og samtidig opprettholde den grønne fluorescerende mitokondrie flekken signal. (C) kontur plott som viser identifisering av HSC befolkning i kontroll og nr supplert forhold post kultur. (D) Contour tomter og KVANTIFISERING av TMRM og grønt fluorescerende mitokondrie flekken signal i fenotypiske HSCs innlegget kultur. NR tilskudd reduserte TMRM signalet mens den grønne fluorescerende mitokondrie flekken signal forble uendret i HSCs. student t test * * *p < 0,001, * * p < 0,01, * p < 0,05, ikke signifikant > 0,05, feil bars = SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: mitokondrie profiler av humant pbmc og TILs: (A) FACS kontur plott som viser CD4+ og CD8+ fersk ISOLERT fra pbmc eller tumor-avledet CD4+ og CD8+ post rep (Rapid Expansion Protocol). TMRM (over) og grønne fluorescerende mitokondrie beis (Mitotracker) (under) profiler vises. (B) KVANTIFISERING av TMRM og grønt fluorescerende mitokondrie flekk signal. TILs vist lavere mitokondrie aktivitet og masse. Student t-test * * *p < 0,001, * *p < 0,01, *p < 0,05, ikke signifikant > 0,05, feil barer = SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| S.No | Antistoff navn | Arbeide fortynning |
| 1 | Streptavidin TX rød | 1/200 |
| 2 | Sca1 APC | 1/200 |
| 3 | Ckit PeCy7 | 1/100 |
| 4 | CD150 PE | 1/100 |
| 5 | CD48 PB | 1/100 |
| Skal bare brukes hvis Stamcelle-og mitokondrie markører kombineres. | ||
| 6 | Streptavidin PAC oransje | 1/200 |
| 7 | CD150 PE-Cy5 | 1/100 |
Tabell 1: antistoff fortynninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En stram regulering av HSC-funksjonen er viktig for å opprettholde stabile hematopoiesen under kroppens levetid. Som ulike andre celletyper i kroppen, en viktig komponent som bidrar til regulering av HSC-funksjonen er cellulær metabolisme. Tidligere studier fra vår Lab9 og andre2,3 har innblandet viktigheten av mitokondrier i å opprettholde en distinkt metabolske tilstand i HSCs. på grunn av det ekstremt lave antallet HSCs isolert fra murine benmarg, er det vanskelig å analysere dem via standard metabolske analyser (for eksempel oksygenforbruk med SeaHorse). Basert på vår tidligere arbeid, standardiserte vi en enkel flyt flowcytometri analysen å pålitelig måle mitokondrie masse og membran potensial (en indirekte avlesning for aktivitet) i et lavt antall celler (dvs. HSCs). Denne analysen tillater måling på levende celler uten å svekke deres levedyktighet9, noe som gjør dem tilgjengelig for eventuelle nedstrøms funksjonelle analyser (for eksempel CFUs eller benmarg Sygehus) som brukerne kan ønske å utføre. Vi forutser denne analysen blir ansatt i screening eksperimenter, slik at for en rask avlesning på mitokondrie profilen til HSCs fra ulike genetiske bakgrunner eller knockout modeller. Viktigere, vår analysen kan kombineres med CFSE flekker å ha en dobbel avlesning på HSC spredning og dens mitokondrie profil9,10, slik at analysen av metabolske skjebnen til å dele HSCs. tatt i betraktning at det er en vanskelig farging prosedyre og vi arbeider med et lavt antall celler (HSCs), er det viktig at innlegget sentrifugering brukerne alltid la 80-100 μL av oppløsning i rørene for å minimere celle tap. I tillegg, under alle innlegg flekker trinn rørene eller platene skal beskyttes mot lys, enten ved å dekke dem i folie eller arbeider i et lite lys miljø. Hvis brukerne velger å kombinere HSC flekken med mitokondrie fargestoffer de må sjekke om kompensasjonen er utført på riktig måte, spesielt mellom TMRM (PE), PeCy5, og APC.
Viktigere, en fersk publikasjon spørsmål ved bruk av mitokondrie fargestoffer i HSCs fordi de kan være utsatt for å pumpe utstrømming. Disse studiene rapporterer at de fleste primitive blodkreft avdelinger har høyere antall mitokondrier i forhold til deres begått forfedre20. I vår erfaring, bruk av musen genetiske modeller (mito eGFP mus21), mitokondrier fargestoff uavhengige farging metoder (TOM20 antistoff), QPCR analyse støtter forestillingen om at de fleste primitive blodkreft avdelinger har lavere mitokondrie innhold10. Vi tror at videre studier må utføres for å avklare dette avviket i feltet.
Parallelt viser vi at bruk av mitokondrie profilering kan utnyttes til å bestemme metabolsk egnethet av menneskelig TILs og utvikle metabolske strategier som tar sikte på å gjenopprette funksjonen av utmattet T celler. Faktisk T-celler isolert fra Pbmc vise lavere mitokondrie aktivitet (TMRM) og masse (Mitotracker Green), mens mer utmattet T-celler som TILs har høyere mitokondrie aktivitet og masse, noe som tyder på en mulig metabolsk omprogrammering oppstår under utmattelse. Følgelig har tidligere publiserte studier vist at stammen celle-lignende minne T celler (TSCM), T celler med økt utholdenhet og i stand til langsiktige tilbakekalling respons, har lavere ΔΨm og behandlinger rettet mot T celle metabolisme kan sterkt påvirke deres funksjon22,23.
Til slutt tror vi at vår tilnærming kan være et verdifullt verktøy for identifisering av romanen forbindelser som kan reparere dysfunksjonelle HSCs (f. eks aldring eller hematologiske ondartet) ved å gjenopprette deres mitokondrie fitness.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Noen elementer av dette arbeidet har blitt sendt inn som søknad P1828EP00 til det europeiske patent kontoret.
Acknowledgments
Vi takker UNIL Flow flowcytometri Core Facility for deres støtte spesielt Dr. Romain Bedel. Dette arbeidet ble støttet av Kristian Gerhard Jebsen stiftelse stipend til N. V og O.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
