Summary
Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het meten van de mitochondriale massa en membraan potentieel in ex vivo gekweekte hematopoietische stamcellen en T-cellen.
Abstract
Een fijne balans van quiescentie, zelf vernieuwing en differentiatie is de sleutel om de hematopoietische stamcel (HSC) pool te behouden en levenslange productie van alle volwassen bloedcellen te handhaven. In de afgelopen jaren is cellulaire metabolisme ontstaan als een cruciale regulator van HSC functie en het lot. We hebben eerder aangetoond dat modulatie van mitochondriale metabolisme invloed heeft op HSC Fate. Met name door chemisch ontkoppelen van de elektronentransport keten konden we de HSC-functie behouden in cultuuromstandigheden die normaliter een snelle differentiatie veroorzaken. Het beperken van HSC-nummers verzet zich echter vaak tegen het gebruik van Standaardtesten om het HSC-metabolisme te meten en daarom hun functie te voorspellen. Hier rapporteren we een eenvoudige Flowcytometrie assay die betrouwbare meting van het mitochondriale membraan potentieel en mitochondriale massa in schaarse cellen zoals HSCs mogelijk maakt. We bespreken de isolatie van HSCs van muis beenmerg en meting van de mitochondriale massa en membraan potentiële post ex vivo cultuur. Als voorbeeld tonen we de modulatie van deze parameters in HSCs via behandeling met een metabole modulator. Bovendien verlengen we de toepassing van deze methodologie op menselijk perifeer bloed-afgeleide T-cellen en humane tumor infiltrerende lymfocyten (TILs), met dramatische verschillen in hun mitochondriale profielen, mogelijk weerspiegelen verschillende T-cel Functionaliteit. Wij geloven dat deze assay kan worden gebruikt in screenings om modulatoren van mitochondriale metabolisme in verschillende celtypen in verschillende contexten te identificeren.
Introduction
Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn een kleine populatie van cellen die zich in het beenmerg bevinden en zorgen voor bloed productie en homeostase gedurende de levensduur van een organisme. HSCs bemiddel dit proces door de aanleiding te geven tot voor ouders die op hun beurt terminaal gedifferentieerde rijwaarden van volwassen bloedcellen produceren via verschillende ronden celdeling en goed georkestreerde differentiatie stappen1. Belangrijker, HSCs produceren hun energie via anaerobe glycolyse. In tegenstelling, meer geëngageerde en actieve hematopoietische voor ouders schakelen hun metabolisme naar mitochondriale metabolisme2,3,4. Deze verschillende metabole toestand wordt verondersteld om de hscs beschermen tegen cellulaire schade toegebracht door reactieve zuurstof soorten (Ros) geproduceerd door actieve mitochondriën, waardoor hun lange termijn in vivo functie5,6,7,8. Directe meting van de metabole toestand van HSC is uitdagend en vaak een lage doorvoer vanwege hun beperkte aantallen. Hier beschrijven we een flow cytometrie-gebaseerde assay voor robuuste meting van het Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) met behulp van tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) fluorescentie en mitochondriale massa met behulp van een groene fluorescerende mitochondriale vlek (Mitotracker Green) in HSCs. We hebben eerder aangetoond dat low ΔΨm een bona fide functionele marker is van zeer gezuiverde hscs9 en metabole modulatoren die in staat zijn om ΔΨm Verbeter hscs functie9,10te verlagen. Hier stellen we voor om gebruik te maken van onze methode op HSCs mitochondriale profilering als strategie om nieuwe moleculen te identificeren die in staat zijn om het Long-term bloed reconstitutie potentieel van de HSCs te verbeteren.
Als voorbeeld tonen we aan dat deze assay de verlaging van HSC ΔΨm op betrouwbare wijze meet bij blootstelling aan vitamine B3 analoge Nicotinamide riboside (NR). Dienovereenkomstig, in onze onlangs gepubliceerde studie laten we zien dat NR sterk verbetert bloed herstel posttransplantatie in zowel muis en gehumaniseerd muis systemen door direct te verbeteren hematopoietische stam en voorlopercellen functies10. De capaciteit van dergelijke metabole modulatoren is van grote klinische waarde gezien het feit dat een 25% sterftecijfer is gekoppeld aan vertraging in bloed en immuun herstel bij postgetransplanteerde patiënten11,12.
Bovendien leveren wij bewijs dat deze methodologie kan worden toegepast voor de karakterisering van het metabolische profiel en de functie van menselijke T-cellen. In de afgelopen jaren is de ontwikkeling van adoptie celtherapie (ACT) met behulp van autologe tumor infiltrerende lymfocyten (TILs) de meest effectieve aanpak geworden voor bepaalde vormen van gevorderde kanker met extreem ongunstige prognose (bijv. gemetastaseerd melanoom, waarbij > 50% van de patiënten op de behandeling reageert en tot 24% van de patiënten volledige regressie heeft)13. Echter, TILs harkotteren voldoende antitumorale activiteit zijn moeilijk te genereren14. De uitgebreide proliferatie en stimulatie die TILs ondergaan tijdens de ex-vivo-expansie veroorzaken T-cel uitputting en senescentie die de antitumorale respons van de T-cel drastisch aantasten15. Belangrijk is dat de antitumorele capaciteit van de tils nauw verbonden is met hun metabolisme16,17 en benaderingen die gericht zijn op het moduleren van metabolisme door de remming van het PI3K/Akt-traject, positieve resultaten hebben opgeleverd18,19. Om deze reden vergelijken we de ΔΨm van T-cellen die zijn afgeleid van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en TILs die afkomstig zijn van de patiënt, en laten zien dat minder gedifferentieerde PBMC-afgeleide T-cellen een lagere ΔΨm en mitochondriale massa hebben in vergelijking met terminaal gedifferentieerde TILs.
We stellen voor dat deze test kan worden gebruikt om nieuwe metabole modulatoren te identificeren die de functie HSC en T Cell verbeteren via de modulatie van ΔΨm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in het manuscript beschreven experimenten volgen de richtlijnen van onze instelling en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Zwitserse wetgeving inzake dierproeven (vergunning: VD3194) en voor onderzoek waarbij menselijke monsters worden betrokken (Protocol: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. hematopoietische stamcel extractie
- Koop wild type C57BL6/J muizen en bewaar ze gedurende ten minste een week in het dieren huis om transport-gerelateerde stress te verminderen.
- Op de dag van het experiment, euthanaseren de muis met CO2 asphyxiation.
- Spuit de muis met 70% ethanol om de vacht te steriliseren en snijd Open de muis op de buik met behulp van standaard chirurgische instrumenten, zoals dissectie schaar en Tang, om het dijbeen en de Tibia botten van de achterpoten te snijden.
- Verwijder de spieren die aan het dijbeen, de tibia en het bekken zijn bevestigd met een zachte papieren handdoek en plaats de gereinigde botten in een buis van 50 mL met PBS met 1 mM EDTA (buffer) op ijs.
- Spray een vijzel en stamper met 70% ethanol en plaats deze in een celcultuurkap. Steriliseer het met UV voor 30 min. na sterilisatie spoel de mortel en stamper met buffer om sporen van ethanol te verwijderen.
- Plaats de schone botten met een buffer (~ 10 mL) in de mortel en plet ze zachtjes om het beenmerg in suspensie te krijgen. Verzamel nu de celsuspensie en geef deze door een celzeef van 70 μm in een buis van 50 mL om een enkelvoudige celsuspensie te krijgen.
- Herhaal stap 1,6 totdat al het beenmerg is geëxtraheerd en het botpuin wit is geworden.
- Plaats de Tube (s) van 50 mL met de suspensie voor één cel in het beenmerg op een centrifuge. Voer de centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c om de cellen te pellet.
- Bereid ondertussen 10 mL 1x RBC lysisbuffer in geautoclaveerd gedistilleerd water. Filtreer de oplossing door een filter van 0,22 μm.
- Verzamel de monsterbuis van de centrifuge en decaner het supernatant. Pipetteer de 1x RBC lysisbuffer (tabel met materialen) op de celpellet. Ontdoe de pellet en bereid een homogene oplossing voor door een paar keer op en neer te pipetteren. Laat de buis gedurende 1 – 2 minuten op kamertemperatuur komen voor de RBC lysis. Stop het lysisproces door de buis met de buffer in te vullen.
- Plaats de buis op een centrifuge en spin bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Vang de buis van de centrifuge en decaner het supernatant. Respendeer de pellet door 10 mL buffer toe te voegen en de oplossing te filteren in een nieuwe 50 mL Tube via een 70 μm celzeef om het vuil te verwijderen als gevolg van RBC lysis.
- Centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Vang de buis van de centrifuge en decaner het supernatant. Respendeer de pellet in 500 μL buffer.
- Verwijder een aliquot van 100 μL en bewaar in een aparte buis van 1,5 mL. Voeg 50 μl Biotine Lineage depletie antilichaam cocktail toe uit de voorlopercellen verrijkings Kit (tabel met materialen) tot de resterende 450 μL celsuspensie. Incuberen bij 4 °C op een shaker gedurende 15 minuten.
- Voeg 15 mL buffer toe en centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Vang de buis van de centrifuge en decaner het supernatant. Respendeer de pellet in 460 μL buffer. Verwijder een aliquot van 10 μL en bewaar in een aparte tube van 1,5 mL.
- Voeg 50 μl streptavidine magnetische parels toe uit de voorlopercellen verrijkings Kit (tabel met materialen), tot de resterende 450 μL celsuspensie. Incuberen bij 4 °C op een shaker gedurende 15 minuten.
- Voeg 15 mL buffer toe en centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Vang de buis van de centrifuge en decaner het supernatant. Rebreng de pellet in 5 mL buffer en breng de oplossing over naar een buis van 15 mL.
- Neem de buis naar een geautomatiseerde cel separator (tabel van de materialen). Voer een reinigingsprogramma uit om de slang van de celseparator te spoelen en te primeren. Plaats het monster en de twee Verzamel buisjes op de buis houder. Voer scheiding uit met het programma 'afbreken'. Verzamel de positieve en negatieve fracties van de automatische celseparator zodra de uitvoering is beëindigd.
Opmerking: Bij afwezigheid van een automatische celseparator kunnen de gebruikers handmatige magnetische kolommen en bijbehorende magneten gebruiken, per de gebruikershandleiding. De gebruikers moeten in gedachten houden dat het proces van handmatige scheiding is langzamer dan de geautomatiseerde. Ook de handmatige kolommen zijn meer vatbaar voor verstopping. Daarom wordt gebruikers geadviseerd om het monster en de belasting op de kolom langzaam te verdunnen. - Gooi de positieve fractie weg. Vul de negatieve breuk buis met buffer. Centrifugeer de buis bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
- Bereid intussen de antilichaammix in 1 mL oplossing voor het eindvolume en de éénkleurige bediening in 200 μL van de eindvolume oplossing zoals beschreven in de tabel met materialen en tabel 1.
Opmerking: Als de TMRM en de groene fluorescerende mitochondriale vlek moeten worden gecombineerd met stamcel marker kleuring, vervang dan CD150-PE met CD150-PEcy5 en Streptavidin-TX rood met Streptavidin-Pac oranje. - Verzamel de monsterbuis van de centrifuge en decaner het supernatant. Respendeer de pellet in 1 mL antilichaammix. Voeg 10 μL cellen (uit stap 1,13) toe aan elk van de besturings buizen met één kleur (behalve de Lineage). Voeg 10 μL cellen toe (van stap 1,14) in de Lineage enkele kleur buis.
- Incuberen de monster-en éénkleurige controle buizen bij 4 °C op een shaker voor 45 min. Bedek de ijsemmer met een deksel of aluminiumfolie.
- Vul alle buisjes met buffer en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en regeer het monster in 1 mL buffer-en eenkleurige besturingselementen in 200 μL buffer.
- Breng het monster en de enkele kleurregelaars over naar 5 mL filter top FACS tubes.
- Neem de buizen naar de sorteermachine en sorteer de HSC populatie (gating strategie in Figuur 1A) in 1,5 mL buisjes met 400 μL stamcel expansie medium.
2. ex vivo cultuur van hematopoietische stamcellen
- Verzamel buisjes met gesorteerde cellen (zie rubriek 1 voor celextractie). Centrifugeer de buisjes op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Verwijder de meeste supernatant voorzichtig zonder de pellet af te doen en laat 50 – 80 μL bovenop de celpellet. Dit minimaliseert celverlies.
- Redilatatie van de celpellet in stamcel expansie medium tot een eindvolume afhankelijk van het aantal te testen voorwaarden (meet 100 μL per goed/staat van cultuur).
- Maak een 2x kweekmedium met stamcel expansie medium, stamcel factor (200 ng/mL), FLT3 ligand (4 ng/mL) en pen-STREP antibiotica (1%) (2x Basaal medium; Tabel met materialen).
- Neem een steriele weefselcultuur behandeld 96 U-bodem goed plaat (tabel van materialen) en identificeren van de putten waar de cellen zullen worden gekweekt (plaat ontwerp in Figuur 1B).
Opmerking: Gebruikers wordt geadviseerd om marginale putten te vermijden, omdat ze gevoeliger zijn voor verdamping. - Plaats 100 μL van 2x Basaal medium dat eerder in stap 2,3 in deze putjes is bereid. In de NR gemarkeerde goed toevoegen 2 μL van een 100x NR oplossing (tabel van materialen). Vul NR elke 24 h.
Opmerking: Aanvulling is specifiek voor NR. Andere metabole modulatoren kunnen of kunnen geen aanvulling nodig hebben. - Zaad 100 μL cellen bereid in stap 2,2 bovenop de putjes met 2x Basaal medium. In dit experiment was het aantal HSCs per put tussen de 800 – 1000 cellen.
- Maak vijf extra putten met 2x Basaal medium. In elk van deze toevoegen 100.000 hele beenmergcellen (uit stap 1,13) geresuspendeerd in 100 μL stamcel expansie medium te gebruiken als kleurings regelaars voor post Culture flow cytometrie analyse.
Opmerking: Als gebruikers stamcel markeringen en mitochondriale markers voor analyse van de post cultuur willen combineren, wordt het aanbevolen om de populatie van voorlopercellen bovendien te sorteren (ofwel Ckit + cel of LKSCD150-cellen). Zaai deze gesorteerde voor ouders in de kleurings controleputten voor de analyse van de post cultuur stroom cytometrie. Bereid één goed per enkele vlek kleur. - Plaats 200 μL geautoclaveerd water in alle omringende putjes om de verdamping van putjes met cellen te verminderen. Laat de plaat ongestoord in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor de duur van de kweekperiode (72 uur). Verwijder de plaat om de NR elke 24 h aan te vullen en plaats deze terug in de incubator.
3. meting van het mitochondriale massa-en membraanpotentiaal
- Aan het einde van de cultuur periode bereiden een 100x oplossing van TMRM (20 μM) en Mitotracker groen (10 μM) (groene fluorescerende vlek) in stamcel expansie medium (tabel van materialen).
- Voeg in elk van de test putten 2 μL 100x TMRM-oplossing en 2 μL 100x groene fluorescerende vlek oplossing toe. Voeg 2 μL 100x TMRM toe in de TMRM-controle. Voeg 2 μL 100x groene fluorescerende vlek toe aan de Mitotracker-besturing. Plaats de plaat terug in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor 45 min. dek de bovenkant van de plaat af met aluminiumfolie.
Opmerking: Een extra controle met verapamil (ABC pomp remmer) kan worden voorbereid als ABC pomp gemedieerde kleurstof Efflux moet worden getest. Voeg hiervoor 50 μM verapamil toe in een van de test putten 1 h voor kleuring voor TMRM en groene fluorescerende vlek. - Verwijder de plaat uit de incubator en centrifugeer deze op 300 x g gedurende 5 min. keer de plaat om om het supernatant te verwijderen. Voeg 200 μL standaard FACS buffer (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS) toe, centrifugeer de plaat bij 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant. Herhaal deze wasstap 3x. De gebruikers moeten ervoor zorgen dat de plaat altijd bedekt is met folie, om minimale blootstelling aan direct licht te bieden.
Opmerking: Als gebruikers de mitochondriale kleuring met stamcel kleuring moeten combineren, moet het monster worden geïnineerd met een antilichaammix van alle stamcel markeringen en moeten de éénkleurige besturingselementen met afzonderlijke antilichamen afzonderlijk worden gekleurd bij 4 °C gedurende 30 – 45 minuten.
Opmerking: Bij alle stappen moeten gebruikers de plaat bedekt met aluminiumfolie houden. Gebruikers moeten er rekening mee dat deze extra kleurings stap en daaropvolgende wasstappen kunnen resulteren in extra celverlies. - Respendeer de cellen in 200 μL FACS buffer en breng deze over naar FACS tubes.
- Voer de monsters uit op de flow-cytometer (Zie Figuur 1). Enkele kleur buizen met WBM omvatten: (1) Onbevlekt; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) groene fluorescerende vlek (FITC); (5) volledige vlek (PE en FITC).
- Eerst verkrijgt u de besturingselementen met één kleur om de machine in te stellen. Gebruik de actieve software op de machine om de compensatie te berekenen. Zodra de compensatie is toegepast, verkrijgt u het HSC-voorbeeld en registreert u zo veel mogelijk gebeurtenissen.
Opmerking: Als de stamcel en mitochondriale markers worden gecombineerd, moeten de gebruikers bijzonder voorzichtig zijn met compensatie tussen TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) en SCA-1 (APC). Ook moeten de monsters onmiddellijk na kleuring worden uitgevoerd. - Exporteer de FACS-bestanden van de cytometer en analyseer de gegevens op een analyse software (tabel met materialen).
- Open het bestand op de analyse software voor de analyse. Met behulp van FSC-A en SSC-een gating identificeren van de celpopulatie. Identificeer onderhemden in de volgende Gates voordat u de DAPI-negatieve fractie (levende cellen) plotten. In de Live Cell Gate maken een contour plot in de TMRM en groen fluorescerende vlek kanaal voor het meten van ΔΨm en massa, respectievelijk (Figuur 2a). Exporteer de gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI) van deze twee kanalen in de Live Cell Gate.
- De TMRM low Gate wordt ingesteld op basis van de schouder populatie in het TMRM-kanaal. Het TMRM-besturingselement met één kleur kan worden gebruikt om deze schouder populatie te identificeren om de poort in te stellen. Exporteer de proportie van cellen in de TMRM-lage poort in uw besturings-en testsamples om te plotten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In Figuur 1 tonen we de gating strategie voor de isolatie van hematopoietische stamcellen uit het beenmerg van de muis en de lay-out van de plaat voor hun ex vivo cultuur. Figuur 1a toont de identificatie van de LYMFOCYTEN Fractie in de SSC-A/FSC-a plot. Doublets werden verwijderd in de singlet Gate gevolgd door de identificatie van levende cellen door de afwezigheid van DAPI-signaal. De LKS populatie, gedefinieerd door Lineage-Sca1+ckit+, werd geïdentificeerd. Het is bekend dat deze populatie stam-en voorlopercellen bevat. HSCs vormen ongeveer 5 – 10% van de cellen in de LKS-populatie en werden geïdentificeerd door gating voor CD150+CD48- populatie. Figuur 1B vertegenwoordigt de lay-out van de 96-well plate voor ex vivo cultuur. Gesorteerde HSCs werden verguld in verschillende cultuuromstandigheden: in dit geval, controle en NR aangevuld cultuuromstandigheden. Hele beenmergcellen werden ook verguld als single-Color besturingselementen zoals beschreven in het protocol. Het is belangrijk om alle omringende putten met water te vullen om verdamping van media te voorkomen van cel-bevattende putten. Bovendien, zoals eerder vermeld, werden marginale putten vermeden voor celkweek omdat ze gevoeliger zijn voor verdamping.
Figuur 2 toont de meting van het Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) en de massa in de hscs-post cultuur. Figuur 2A toont representatieve percelen van tmrm niveaus (boven) en groene fluorescerende mitochondriale vlek (onder) in hscs gekweekt in controle en nr aangevuld voorwaarden. NR behandeling toonde een duidelijke toename van de TMRMlage populatie. Figuur 2B toont de kwantificering van drie onafhankelijke monsters. NR behandeling aanzienlijk verhoogd het aandeel van cellen in de TMRMlage poort en toonde een significante verlaging van de intensiteit van de tmrm fluorescentie. Mitochondriale massa (vertegenwoordigd door groen-fluorescentie intensiteit) niet gewijzigd bij NR suppletie. Daarnaast combineerden we stamcel marker kleuring met mitochondriale kleurings post cultuur. Figuur 2C toont de gating strategie om hscs te identificeren van Lineage negatieve en LKS populaties post cultuur in de twee cultuuromstandigheden. De TMRM en groen fluorescerende mitochondriale vlek Profiel van deze gated HSCs is te zien in Figuur 2D. Blootstelling aan NR toonde een significante stijging van de% TMRMlage populatie en een significante afname van de intensiteit van de tmrm fluorescentie in gated hscs. Het groene fluorescerende mitochondriale vlek groen signaal bleef onveranderd in de twee omstandigheden.
Figuur 3 toont de meting van het Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) en de massa in verschillende menselijke T-cellen: perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCS) CD4+ -en CD8+ T-cellen, evenals CD4+ -en CD8+ tumor infiltrerende lymfocyten (tils) na het Rapid Expansion Protocol (rep). Figuur 3A toont representatieve plots van de tmrm niveaus (boven) en groen-fluorescerende mitochondriale vlek niveaus (onder) van circulerende (PBMC) en Tumor-Infiltrating (Til) CD4+ en CD8+ T cellen. TILs toonde een duidelijke toename van de TMRM en groene fluorescerende mitochondriale vlek signaal in vergelijking met circulerende T cellen. Figuur 3B toont de MFI-kwantificering van tmrm en groene fluorescerende mitochondriale kleuring. TILs weergegeven hogere TMRM en groene fluorescerende mitochondriale kleuring signalen in vergelijking met PBMC-afgeleide T-cellen. Deze gegevens geven aan dat TILs hebben een onderscheidende metabole profiel met verhoogde ΔΨm en mitochondriale massa.
Figuur 1: isolatie en cultuur van hematopoietische stamcellen. a) strategie voor de isolatie van hematopoietische stamcellen (hscs) op basis van celoppervlak markeringen. HSCs werden geïdentificeerd als Lineage-Sca1+ ckit+ (LKS) CD150+CD48-. B) ontwerp van 96 put in cultuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: mitochondriale profielen van hscs. (a) FACS contour plot tonen hscs post cultuur in basale of nr aangevuld voorwaarden. TMRM (boven) en groene fluorescerende mitochondriale vlek (Mitotracker) (hieronder) profielen worden weergegeven. B) kwantificering van TMRM en groen fluorescerende mitochondriale vlek signaal. NR suppletie resulteerde in een afname van de TMRM profiel met behoud van de groene fluorescerende mitochondriale vlek signaal. C) contour plots met identificatie van HSC populatie in controle en nr aangevuld voorwaarden post cultuur. D) contour plots en kwantificering van TMRM en groen fluorescerend mitochondriaal vlek signaal in fenotypische hscs-post cultuur. NR suppletie verminderde het TMRM-signaal terwijl het groene fluorescerende mitochondriale vlek signaal onveranderd bleef in HSCs. student t test * * *p < 0,001, * * p < 0,01, * p < 0,05, niet significant > 0,05, Error bars = SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: mitochondriale profielen van menselijke PBMCs en tils: (a) FACS contour plot toont CD4+ en CD8+ vers geïsoleerd van PBMCs of tumor-afgeleide CD4+ en CD8+ post rep (Rapid Expansion Protocol). TMRM (boven) en groene fluorescerende mitochondriale vlek (Mitotracker) (hieronder) profielen worden weergegeven. B) kwantificering van TMRM en groen fluorescerende mitochondriale vlek signaal. TILs weergegeven lagere mitochondriale activiteit en massa. Student t-test * * *p < 0,001, * *p < 0,01, *p < 0,05, niet significant > 0,05, Error bars = SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| S.No | Naam van het antilichaam | Werkverdunning |
| 1 | Streptavidin TX rood | 1/200 |
| 2 | Sca1 APC | 1/200 |
| 3 | Ckit PeCy7 | 1/100 |
| 4 | CD150 PE | 1/100 |
| 5 | CD48 PB | 1/100 |
| Alleen te gebruiken als stamcel en mitochondriale markers gecombineerd. | ||
| 6 | Streptavidin Pac oranje | 1/200 |
| 7 | CD150 PE-Cy5 | 1/100 |
Tabel 1: verdunningen van antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een strakke regulering van de HSC-functie is belangrijk om stabiele hematopoiese te handhaven tijdens de levensduur van een organisme. Net als verschillende andere celtypen in het lichaam, een belangrijke component die bijdraagt aan de regulering van de functie HSC is cellulaire metabolisme. Eerdere studies van ons lab9 en anderen2,3 hebben het belang van mitochondriën betrokken bij het handhaven van een duidelijke metabole toestand in hscs. vanwege het extreem lage aantal hscs geïsoleerd uit het muriene beenmerg, is het moeilijk om ze te analyseren via standaard metabole testen (bijv. zuurstofverbruik met SeaHorse). Op basis van ons vorige werk hebben we een eenvoudige flow cytometrie-assay gestandaardiseerd om de mitochondriale massa en het membraan potentieel (een indirecte uitlezen voor activiteit) in een laag aantal cellen (d.w.z. HSCs) betrouwbaar te meten. Deze bepaling maakt meting op levende cellen mogelijk zonder afbreuk te doen aan hun levensvatbaarheid9, waardoor ze beschikbaar zijn voor alle downstream functionele testen (zoals cfus of beenmergtransplantaties) die gebruikers kunnen wensen uit te voeren. We voorzien deze assay in de screening experimenten, waardoor een snelle uitlezen van het mitochondriale Profiel van HSCs uit verschillende genetische achtergronden of Knockout-modellen mogelijk is. Belangrijk is dat onze assay gecombineerd kan worden met CFSE-kleuring om een dubbele uitlezen op de proliferatie van HSC en het mitochondriale profiel9te hebben,10, waardoor de analyse van het metabolische lot van het verdelen van hscs. gezien het feit dat het een moeilijke kleurings procedure is en we werken met een laag aantal cellen (hscs), is het belangrijk dat post centrifugeren de gebruikers altijd 80 – 100 μL oplossing in de buisjes achterlaten om celverlies te minimaliseren. Bovendien moeten de buizen of platen tijdens alle post kleurings stappen worden beschermd tegen licht, hetzij door ze in folie te bedekken of in een omgeving met weinig licht te werken. Als de gebruikers besluiten om HSC Stain te combineren met mitochondriale kleurstoffen, moeten ze controleren of de compensatie correct wordt uitgevoerd, vooral tussen TMRM (PE), PeCy5 en APC.
Belangrijk is dat een recente publicatie vragen heeft over het gebruik van mitochondriale kleurstoffen in HSCs omdat ze vatbaar zijn voor pomp Efflux. Deze studies melden dat de meeste primitieve hematopoietische compartimenten hebben hogere aantallen mitochondriën in vergelijking met hun toegewijde voor ouders20. In onze ervaring, het gebruik van muis genetische modellen (Mito eGFP muizen21), mitochondriën kleurstof-onafhankelijke kleurings methoden (TOM20 antilichaam), qPCR analyse ondersteunt de notie dat de meeste primitieve hematopoietische compartimenten hebben lagere mitochondriale inhoud10. Wij zijn van mening dat verdere studies moeten worden uitgevoerd om deze discrepantie in het veld te verduidelijken.
Parallel hieraan tonen we aan dat het gebruik van mitochondriale profilering kan worden benut om de metabole geschiktheid van menselijke TILs te bepalen en metabolische strategieën te ontwikkelen die gericht zijn op het herstellen van de functie van uitgeputte T-cellen. Eigenlijk, T cellen geïsoleerd van PBMCs display lagere mitochondriale activiteit (TMRM) en massa (Mitotracker groen), terwijl meer uitgeput T cellen zoals TILs hebben hogere mitochondriale activiteit en massa, suggereren een mogelijke metabole herprogrammering optreedt tijdens uitputting. Dienovereenkomstig, eerdere gepubliceerde studies hebben aangetoond dat stamcel-achtige geheugen t cellen (TSCM), t cellen met verbeterde persistentie en geschikt voor lange termijn terugroepen reactie, hebben lagere ΔΨm en behandelingen gericht T-cel metabolisme kan hun functie22,23sterk beïnvloeden.
Ten slotte geloven wij dat onze aanpak een waardevol instrument zou kunnen zijn voor de identificatie van nieuwe verbindingen die disfunctionele HSCs (bijv. veroudering of hematologische maligniteiten) kunnen repareren door hun mitochondriale fitheid te herstellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sommige elementen van dit werk zijn ingediend als aanvraag P1828EP00 aan het Europees Octrooibureau.
Acknowledgments
We danken de UNIL flow Cytometry core faciliteit voor hun ondersteuning, vooral Dr. Romain bedel. Dit werk werd gesteund door de Kristian Gerhard Jebsen Stichting Grant aan N. V en AG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL FACS tubes | Falcon | 352235 | Sample preparation |
| 96-U bottom plate | Corning | 3799 | Cell culture |
| AutoMACS pro separator | Miltenyi Biotec | Automatic Cell separation | |
| BD FACS AriaIII | Becton and Dickinson | Cell sorting | |
| BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit | BD | 558451 | Lineage depletion |
| BD LSRII | Becton and Dickinson | FACS acquisition machine | |
| BD-DIVA | Becton and Dickinson | Acquisition software | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Antibody staining mix |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Antibody staining mix |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Antibody staining mix |
| Centrifuge- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Antibody staining mix |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Analysis software | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Plotting data into graphs | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | Custom synthesized in house | Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM | |
| PBS | CHUV | 1000324 | Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x |
| RBC Lysis buffer | Biolegend | 420301 | Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x |
| Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL |
| Recombinant mouse stem cell factor (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Antibody staining mix |
| StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | SIGMA | S0192 | Ex vivo culture |
| Streptavidin Pac orange | Life Technologies | S32365 | Antibody staining mix |
| Streptavidin Tx red | Life Technologies | S872 | Antibody staining mix |
| TMRM | Invitrogen | T668 | Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM |
| Ultra pure EDTA | Invitrogen | 15575-038 | Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM |
References
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
- Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
- Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
- Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
- Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
- Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).
- Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
- Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
- Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).
- Wherry, E. J.
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
- van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
- Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).
