Summary
Vi presenterer en protokoll for evaluering av de elektromekaniske effektene av GtACR1 aktivering i kanin kardiomyocytter. Vi gir detaljert informasjon om celleisolasjon, kuling og adenoviral transduksjon, og om funksjonelle eksperimenter med patch-clamp og karbonfiber teknikker.
Abstract
I løpet av de siste to tiårene har optogenetiske verktøy blitt etablert som potente midler for å modulere celle-type spesifikk aktivitet i spennende vev, inkludert hjertet. Mens Channelrhodopsin-2 (ChR2) er et vanlig verktøy for å depolarisere membranpotensialet i kardiomyocytter (CM), har potensielt utløsende virkningspotensialer (AP), et effektivt verktøy for pålitelig deaktivering av CM-aktivitet manglet. Det har blitt foreslått å bruke anion channelrhodopsins (ACR) for optogenetisk hemming. Her beskriver vi en protokoll for å vurdere effekten av å aktivere den naturlige ACR GtACR1 fra Guillardia theta i kultivert ekan cm. Primære avlesninger er elektrofysiologiske patch-klemme opptak og optisk sporing av CM sammentrekninger, begge utført mens du bruker ulike mønstre av lysstimulering. Protokollen inkluderer CM isolasjon fra kanin hjerte, seeding og kuling av cellene i opptil 4 dager, transduksjon via adenovirus koding for lys-gated klorid kanal, utarbeidelse av patch-klemme og karbonfiber oppsett, datainnsamling og analyse. Ved hjelp av patch-clamp teknikken i hele cellen konfigurasjon gjør at man kan registrere lysaktiverte strømmer (i spenning-klemme modus, V-klemme) og AP (strøm-klemme modus, I-clamp) i sanntid. I tillegg til patch-clamp eksperimenter, gjennomfører vi kontraktilitetsmålinger for funksjonell vurdering av CM-aktivitet uten å forstyrre det intracellulære miljøet. For å gjøre dette registreres celler mekanisk forhåndslastet ved hjelp av karbonfibre og sammentrekninger registreres ved å spore endringer i sarkomlengde og karbonfiberavstand. Dataanalyse inkluderer vurdering av AP-varighet fra I-clamp-opptak, toppstrømmer fra V-klemmeopptak og kraftberegning fra karbonfibermålinger. Den beskrevne protokollen kan brukes på testing av biofysiske effekter av forskjellige optogenetiske aktuatorer på CM-aktivitet, en forutsetning for utvikling av en mekanistisk forståelse av optogenetiske eksperimenter i hjertevev og hele hjerter.
Introduction
ChR-medierte fotostrømmer ble først registrert i øyeflekken av encellet grønne alger1,2. Kort tid etter genetisk kloning og heterologous uttrykk for Chlamydomonas reinhardtii ChR1 og ChR2, ChR ble brukt som verktøy for å endre membranpotensialet i Xenopus oocytes og pattedyr celler av lys3,4. Kasjon ikke-selektiv ChR depolariserer membranen av celler med et hvilemembranpotensial som er negativt for reverseringspotensialet til ChR. De kan dermed brukes til å fremkalle AP i spennende celler, inkludert nevroner og CM, slik at optisk pacing5,6.
Komplementære til kation ChR, lysdrevet proton, klorid og natriumpumper7,8,9 har blitt brukt til å hemme nevronal aktivitet10,11,12. Sistnevnte har imidlertid begrensninger, som krever høy lysintensitetog vedvarende belysning, da en ion transporteres per absorbert foton. I 2014 beskrev to uavhengige studier av Wietek et al. og Berndt et al. konvertering av kation-ledende ChR til ACR via mutasjoner i kanalen pore13,14. Ett år senere ble naturlig ACR oppdaget i kryptophyte Guillardia theta (GtACR)15. Som konstruert ACR viste gjenværende kation ledningsevne, ble de erstattet av naturlig ACR, preget av en stor enkanals ledningsevne og høy lysfølsomhet15. GtACR ble brukt til å dempe nevronal aktivitet ved å polarisere membranpotensialet mot reverseringspotensialet til klorid16,17. Govorunova et al. brukte GtACR1 til kultivert rotte ventrikulær CM og viste effektiv fotohemming ved lave lysintensitetsnivåer som ikke var tilstrekkelige til å aktivere tidligere tilgjengelige hemmingsverktøy, for eksempel protonpumpen Arch18. Vår gruppe rapporterte nylig at GtACR1-mediert fotohemming av CM er basert på depolarisering og at GtACR1 også kan brukes, derfor for optisk tempo på CM19.
Her presenterer vi en protokoll for å studere de elektrofysiologiske og mekaniske effektene av GtACR1 fotoaktivering på kultivert kanin ventrikulær CM. Vi beskriver først celleisolasjon, kuling og transduksjon. Elektrofysiologiske effekter måles ved hjelp av helcellepatchklemmeopptak. Lysmedierte strømmer med en gitt membranspenning vurderes i V-klemmemodus. Membran potensiell dynamikk måles mens elektrisk eller optisk pacing CM (I-clamp modus). Optisk hemming av elektrisk utløst AP testes ved hjelp av vedvarende lysapplikasjon. Mekaniske effekter måles ved hjelp av karbonfibre i kombinasjon med bildebasert sporing av sarkomerlengde. For å gjøre dette er optisk fartsbare celler mekanisk forhåndslastet ved å feste to karbonfibre til plasmamembranen nær motsatte celleender. Sarcomere lengde endringer registreres under optisk eller elektrisk tempo. Til slutt måles fotohemming under elektrisk feltstimulering av cellene, og genererte krefter analyseres.
Protokollen inneholder følgende trinn vist i flytskjemaet i figur 1:kanin dyp anestesi, thiopental overdose injeksjon, hjerte eksisjon, Langendorff-perfusjon og vev fordøyelse, mekanisk dissosiasjon av vevet for å frigjøre celler, mikroskopisk analyse av CM utbytte, kulturing av CM, transduksjon med adenovirus type 5, etterfulgt av inkubasjon og funksjonelle eksperimenter.
Figur 1: Flytskjema for protokollen som brukes til å oppnå elektrisk og optisk fartsbar CM. Hjerter blir skåret ut fra kaniner 9-10 uker gammel, og hjertevev fordøyes mens de blir perfundert ved hjelp av et Langendorff-oppsett. Celler frigjøres av mekanisk agitasjon. CM-utbyttet telles under et mikroskop. CM er kultivert, transduced med adenovirus type 5 og funksjonelle eksperimenter utføres 48-72 timer etter transduksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
Alle kanineksperimenter ble utført i henhold til retningslinjene som er angitt i eu-parlamentets direktiv 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål og godkjent av lokale myndigheter i Baden-Württemberg (Regierungspräsidium Freiburg, X-16/10R, Tyskland).
1. Løsninger for celleisolering
- Forbered løsningene for celleisolasjonen med vann av følgende krav (Tabell 1) og i henhold til de ioniske komposisjonene som er oppført i tabell 2.
MERK: CaCl2 og MgCl2 legges til fra 1 M lagerløsninger.
| Vannkrav | |
| Ledningsevne [μS/cm] ved 25 °C | 0.055 |
| Pyrogen [EU/ml] | < 0,001 |
| Partikkel (størrelse > 0,22 μm) [1/ml] | ≤ 1 |
| Totalt organisk karbon [ppb] | < 5 |
| Mikroorganismer [CFU/ml] | ≤ 1 |
| RNase [ng/ml] | < 0,01 |
| DNase [ng/ml] | < 4 |
Tabell 1: Vannkrav.
| Fysiologisk saltoppløsning (1) | Lavt kalsium, høy kaliumløsning (2) | Enzymoppløsning (3) | Blokkeringløsning | |
| NaCl [mM] | 137 | 137 | 137 | 137 |
| KCl [mM] | 4 | 14 | 14 | 14 |
| Hepes [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Kreatin [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Taurine [mM] | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Glukose [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| MgCl2 [mM] | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Adenosin [mM] | 5 | 5 | 5 | 5 |
| L-karnitin [mM] | 2 | 2 | 2 | 2 |
| CaCl2 [mM] | 1 | - | 0.1 | 0.1 |
| Na-Heparin [IE/L] | 5000 | - | - | - |
| EGTA [mM] | - | 0.096 | ||
| Collagenase type 2, 315 E/mg [g/L] | - | - | 0.6 | - |
| Protease XIV [g/l] | - | - | 0.03 | - |
| Storfe serum albumin [%] | - | - | - | 0.5 |
| Osmolarity [mOsmol/L] | 325 ± 5 | 345 ± 5 | 345 ± 5 | 345 ± 5 |
Tabell 2: Løsninger for CM-isolasjon.
- Juster alle løsninger til pH 7.4 ved 37 °C og sjekk osmolaritet.
MERK: Oppløs enzymene (Collagenase type 2 og Protease XIV) rett før hjerteavgift. Oksygener alle løsninger før bruk.
2. Utarbeidelse av Langendorff-perfusjonsoppsettet
MERK: Det brukte oppsettet er skreddersydd. Som avbildet i figur 2består oppsettet av tre vannjakkede reservoarer (1-3), en spiral motstrømsvarmeveksler (4) og et vannjakkeperfusjonsfartøy (5).
Figur 2: Langendorff-perfusjonsoppsett optimalisert for kanincelleisolering. (1-3) Vannjakkede reservoarer med (1) fysiologisk saltvannsløsning, (2) lavt kalsium, høy kaliumoppløsning og (3) enzymholdig kardioplegisk oppløsning. (4) Spiral motstrømsvarmeveksler og (5) vannjakkeforsamlingstank. Tilstrømningen av vannjakkesystemet er spiralvarmeveksleren (temperatur på løsninger som forlater perfusjonskanylen på slutten av varmeveksleren, skal være konstant ved 37 °C), etterfulgt av perfusjonsbeholderen og de tre reservoarene. Alle løsninger er oksygenert (stiplet linje). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Slå på pumpen av vannbadet for å sirkulere vann ved 38 °C i varmevekslingssystemet og forvarm alle løsninger til 37 °C.
MERK: Temperaturen ved utstrømningen av (4) må kontrolleres og konstant ved 37 °C. - Fyll de tre reservoarene med den respektive løsningen og vask hver linje (svart) med tilsvarende oppløsning. Fyll hovedlinjen (blå) på enden uten luftbobler ved hjelp av oppløsning (1).
MERK: Oksygener oppløsningene før (10 min) og under bruk. Fyll linjen fra reservoaret (3) til springen med lavt kalsium, høy kaliumoppløsning. - Forbered en sutur for å knytte hjertet rundt aorta på kanylen.
3. Celleisolasjon
- Forbered følgende sprøyter.
- For sedasjon/anestesi: Bland 0,5 ml/kg kroppsvekt esketaminhydroklorid (25 mg/ml) og 0,2 ml/kg kroppsvekt xylazinhydroklorid (2 %).
- Fyll to sprøyter med 12 ml NaCl-oppløsning (0,9 %).
- Forbered 6 ml 12,5 mg/ml Na-thiopental, oppløst i 0,9 % NaCl-oppløsning.
- Fyll 0,2 ml esketaminhydroklorid (25 mg/ml) i en sprøyte.
- Fortynn 0,2 ml Na-heparin (5000 IE/ml) i 1 ml på 0,9 % NaCl-oppløsning (endekonsentrasjon 1000 IE/ml).
- Sedate/bedøve kaniner (9-10 uker, New Zealand hvit kanin, hunn eller mann, ~ 2 kg) via intramuskulær injeksjon av esketaminhydroklorid og xylazinhydroklorid (trinn 3.1.1).
MERK: Kaniner trenger minst 10 min for å være fullstendig bedøvet; nøyaktig varighet avhenger av kroppsvekten. Bekreft anestesi med tap av rettingsrefleksen. - Barber brystet og ørene der venene er plassert.
- Sett en fleksibel kanyle inn i ørevenen, fest den med tape og skyll den med 0,9 % NaCl-løsning.
- Injiser 1 ml Na-heparinoppløsning intravenøst og skyll med 0,9 % NaCl-oppløsning.
- Injiser 0,2 ml esketaminhydroklorid, skyll igjen med 0,9 % NaCl-oppløsning og injiser Na-thiopental til apné.
MERK: Kanin en skal ikke reagere på pedaluttaksrefleksen. - Åpne brystet på venstre side og fjern perikardiet.
- Start timeren når hjertet blir skåret ut og vask hjertet to ganger i fysiologisk saltvannsløsning.
MERK: Bruk saks med runde spisser for å unngå utilsiktet skade på hjertevev. - Kanyre aorta i et bad med fysiologisk saltvannløsning og hold alt vev i oppløsning. Slå på Langendorff-perfusjonssystemet (fysiologisk saltvannsløsning (1), hastighet 24 ml/min).
- Overfør hjertet til Langendorff-perfusjonsoppsettet, koble aorta til perfusatdysen, og bind hjertet tett med suturen rundt aortaen til kanylen (< 1 min).
MERK: Fyll kanylen før den fysiologiske saltvannsløsningen, sørg for at ingen luftbobler kommer inn i kanylen under transport fra cannulation-området til Langendorff-oppsettet, koble boblefri. - Perfuse hjertet til alt blod er vasket ut (2-3 min).
- Bytt til lavt kalsium, høy kaliumoppløsning (2). Perfuse i 2 min etter at hjertet har sluttet å slå og bytte til enzymløsning.
- Begynn å resirkulere enzymløsningen, etter 2 min fra fordøyelsesstart, tilbake i reservoaret. Reduser hastigheten til 16 ml/min etter 5 min fordøyelse.
- Når vevet ser mykt (40-50 min fordøyelse), kutt hjertet av kanylen og skille venstre ventrikkel.
- Slipp cellene ved mekanisk dissosiasjon (trekk forsiktig fra hverandre vevet med en pipette og en fin tang for å holde vevet) i blokkeringsløsning.
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom et nett (porestørrelse på 1 mm2) og sentrifuge i 2 min ved 22 x g (gravitasjonsakselerasjon).
- Fjern supernatanten som inneholder ikke-myocytter og re-suspendere CM i blokkeringsløsning.
4. Dyrking av CM
MERK: Utfør følgende trinn under sterile forhold.
- Fortynn Laminin (fra Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkom kjellermembran, 1 mg/ml) 1:10 i steril fosfat bufret saltvann (uten Ca2+/Mg2+) til en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml.
- Forbered kulturmedium i M199-Medium med kosttilskudd som angitt i tabell 3.
| Cellekultur medium i M199-Medium | |
| Kreatin [mM] | 5 |
| L-karnitinhydroklorid [mM] | 2 |
| Taurine [mM] | 5 |
| Na-Pyruvat [mM] | 1 |
| Insulin (storfe bukspyttkjertel) [U/L] | 0.25 |
| Cytosin-β-D-arabinofuranoside [mM] | 0.01 |
| Gentamycin [mg/ml] | 0.05 |
Tabell 3: Cellekulturmedium.
- Steril-filter løsning (0,22 μm) og tilsett 5% Fetal Bovine Serum.
- For patch-clamp eksperimenter autoklav dekkslips ø 16 mm, tykkelse Nr. 0, belegge dem med 100 μg/ml laminin rett før kuling.
- For karbonfibereksperimenter, belegge Petri-skåloverflaten med poly (2-hydroksyetymetakrylat) (poly-HEMA, 0,12 g/ml i 95:5 EtOH:H20) og la den stivne.
MERK: Cellene "stikker ikke" til poly-HEMA belagt Petri retter; Dette er avgjørende for deres friksjonsfrie sammentrekning i cellemekanikkstudier. - Etter re-suspendert CM har avgjort (~ 10-15 min), fjerne supernatant, og deretter re-suspendere CM i kultur medium.
- Tell CM med et Neubauer kammer og frø på en måltetthet på 17 500 celler / ml enten på laminin belagt coverslips eller i poly-HEMA belagt Petri retter.
- Inkuberceller ved 37 °C, 5 % CO2 i 3-4 timer. Bytt mellommed (37 °C) av skjulte celler.
- Legg til adenovirus (type 5) koding for GtACR1-eGFP med en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 75 og start funksjonelle eksperimenter etter 48 timer.
MERK: Etter transduksjon holder cellene i mørket. Bruk rød belysning når du arbeider med blå eller grønne lysaktiverte proteiner. Et kommersielt tilgjengelig adenoviral leveringssystem (se Materialtabellen) brukes til å klone genene som koder GtACR1-eGFP i den adenovirale vektoren. Innsatsen av interesse, her GtACR1-eGFP, er PCR forsterket og deretter kombinert med en adenoviral vektor inkludert en CMV-arrangør i en IN-Fusion Kloning reaksjon. CMV (human cytomegalovirus) promotoren brukes ofte til å drive overuttrykk av transgener i pattedyrceller. eGFP er et forbedret grønt fluorescerende protein avledet fra Aequorea victoria med en eksitasjon maksimalt 488 nm og et utslipp maksimum på 507 nm. Adenovirus (type 5) ble eksternt produsert ved Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin, prof. Dr. Michael Schupp.
FORSIKTIG: Adenoviral transduksjon kategoriseres som BSL-2 sikkerhetsnivåarbeid, og passende sikkerhetstiltak er lovpålagt.
5. Funksjonelle eksperimenter
MERK: Opptak utføres ved hjelp av et invertert fluorescensmikroskop. Filtrer overføringslyset med et rødt båndpassfilter (630/20 nm) i kondensatoren for å unngå samtidig aktivering av GtACR1.
-
Oppsett av plaster
- Bruk en forsterker i kombinasjon med en analog-til-digital omformer. Bruk en datainnsamlingsprogramvare til å registrere strøm- og spenningsdata (se Materialtabellen).
MERK: De registrerte dataene digitaliseres med 10 kHz og filtreres med 5 kHz.
- Bruk en forsterker i kombinasjon med en analog-til-digital omformer. Bruk en datainnsamlingsprogramvare til å registrere strøm- og spenningsdata (se Materialtabellen).
-
Oppsett av karbonfiber
- Bruk et kamera til å oppdage karbonfiberposisjon og sarkomlengde ved å spore endringer i optisk kontrast (karbonfibre vises som mørkere strukturer, lagt over på det striated cellemønsteret). En skjematisk representasjon av oppsettet vises i figur 3.
MERK: Sarkomerlengde beregnes i sanntid ved hjelp av en rask Fourier transform (FFT) av strømspekteret av striasjonsmønsteret.
- Bruk et kamera til å oppdage karbonfiberposisjon og sarkomlengde ved å spore endringer i optisk kontrast (karbonfibre vises som mørkere strukturer, lagt over på det striated cellemønsteret). En skjematisk representasjon av oppsettet vises i figur 3.
Figur 3: Ordningen som viser eksperimentelt oppsett for karbonfibermålinger. (Tegning er ikke i stor skala). To karbonfibre er festet på en celle og deres posisjon styres av en piezo-positioner. Pacer brukes til elektrisk feltstimulering. Multi-farge lysdioder er koblet til epifluorescensporten til det inverterte mikroskopet for belysning av celler i objektplanet. LED-strøm styres via en egen kontrollboks, som mottar digitale pulser via den digitale utgangen til den digital-analoge omformeren (DAC). DAC kommuniserer via analog utgang med fluorescenssystemgrensesnittet. Et svart-hvitt kamera (774 piksler med 245 linjer) for mobilbilder er koblet til datamaskinen for å spore sarkomerlengde og karbonfiberbøying. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Tidsriktig belysning
- Gi lys for fluorescensmikroskopi og aktivering av lys-gated ion kanaler via en ekstern spesialbygd LED kontrollboks, bestående av tre lysdioder av forskjellig farge (460 nm, 525 nm, 640 nm, se Table of Materials).
- Endre mikrokontrolleren og den grafiske brukergrensesnittkoden (GUI) for kontrollboksen for å tillate kontroll av LED-lampen via eksterne Time to Live (TTL)-pulser, generert i datainnsamlingsprogramvareprotokoller (se Materialtabell). Overfør TTL-pulser til LED-kontrollboksen via den digitalanaloge omformeren.
- Kjør led-lampen og velg antall pulser via GUI. Når du mottar kommandoen fra GUI, starter mikrokontrolleren en prosess på en ny kjerne. I denne prosessen vil TTL-inngangen samt en kontrollbryter satt fra GUI kontinuerlig bli kontrollert.
- Når TTL-inngangen er positiv, slår mikrokontrolleren led-lampen på og fortsetter deretter å kontrollere TTL-inngangen. Når TTL-signalet går tilbake til null, slår mikrokontrolleren led-lampen av og reduserer antall pulser som er igjen av én. Hvis kontrollbryteren på et tidspunkt er usann eller antall pulser er null, stopper mikrokontrolleren denne prosessen til en ny kommando mottas fra GUI.
- Koble lysdiodene direkte inn i bakhavnen av mikroskopet.
- Bestemmelse av lysintensitet i objektplanet
- Mål det opplyste området med et stadium mikrometer (objektiv forstørrelse 40x, A = 0,8 mm2).
- Bruk en optisk strømmåler (se Materialtabellen).
- Definer innstillingene for forsøkene: eksitasjonsbølgelengde (525 nm), objektiv forstørrelse (40x), eksitasjonsfilter (530/20 nm) eller speil, og les ut lyskraften [W] ved ulike LED-inngangsspenninger.
- Beregn lysintensiteten [W/mm2] ved å dele lyseffekten [W] med det opplyste området [mm2] (her: 0,8 mm2).
MERK: Mål den faktiske lyskraften med de respektive protokollene i trinn 5.6 for å kontrollere om korte lyspulsvarigheter på 10 ms rekkevidde og lange varigheter holder den innstilte verdien (Tilleggsfigur 1).
- Forberedelse til patch-clamp eksperimenter
- Klargjør følgende eksterne og interne løsninger (Tabell 4; for vannbehov, se tabell 1).
- Juster osmolariteten med glukose til 300 ± 5 mOsmol/L. Aliquot den interne løsningen og oppbevar ved -20 °C.
MERK: Oppbevar den interne løsningen på is for opptaksdagen. Oppbevar den eksterne løsningen ved romtemperatur. Her beskrev patch-clamp løsninger var basert på tidligere brukte løsninger og Cl- konsentrasjonen ble endret til lavere, mer fysiologiske nivåer7. For karakterisering av ionselektivitet av den respektive optogenetiske aktuatoren foreslår vi å variere konsentrasjonene av store ioner (f.eks. Cl-, Na+, K+, H+) i de ekstra- og intracellulære løsningene19. - Ta av opptakselektroden fra pipetteholderen og fjern sølvkloridlaget fra sølvtråden med veldig fint sandpapir.
MERK: Gjør dette trinnet i begynnelsen av hver måledag. - Koble ledningen til den positive polen på et 1,5 V-batteri og senk i 3 M KCl-oppløsning for sølvkloridbelegg i 10 min.
MERK: Den negative polen er koblet til en referanse sølvtråd nedsenket i 3 M KCl-oppløsningen. - Forbered målekammeret: sett silisiumfett på rammen av målekammeret og plasser en dekkslip (diameter: 50 mm, tykkelse nr. 0) på toppen av rammen som kammeret er forseglet.
- Sett en referanse sølv / sølv-klorid pellet elektrode i badekaret og koble den med hodet scenen.
- Trekk 1,7 - 2,5 MΩ-plasterpipetter fra kapillærer i sodakalkglass (ytre diameter: 1,55 mm, indre diameter: 1,15 mm) med mikropipetteavtrekker (se Materialbord).
- Start datainnsamlingsprogramvare og juster membrantesten (puls 10 mV for 15 ms, baseline 0 mV).
| Ekstern badløsning | Intern pipetteløsning | |
| NaCl [mM] | 140 | - |
| KCl [mM] | 5.4 | 11 |
| CaCl2 [mM] | 1 | - |
| MgCl2 [mM] | 2 | 2 |
| Glukose [mM] | 10 | - |
| Hepes [mM] | 10 | 10 |
| K-Aspartate [mM] | - | 119 |
| Mg-ATP [mM] | - | 3 |
| EGTA [mM] | - | 10 |
| Ph | 7.4 (Naoh) | 7.2 (KOH) |
| Osmolarity (juster med glukose) [mOsmol/L] | 300 ± 5 | 300 ± 5 |
Tabell 4: Patch-clamp løsninger.
- Protokoller for patch-clamp målinger
- Ta opp fotoaktiveringsprotokoll i V-klemmemodus med et holdingpotensial på -74 mV. Bruk lyspulser på 300 ms.
MERK: Vi foreslår å utføre V-klemmeopptak nær hvilemembranpotensialet til kultivert CM (etablert i I-clamp; i våre hender mellom -79 mV og -77 mV både for transdusert og ikke-transducert CM19). Nyisolerte celler viser et gjennomsnittlig hvilemembranpotensial på -79 mV (Supplerende figur 2, alle verdier etter korreksjon for væskekrysspotensial). - Ta opp AP i I-clamp-modus ved 0 pA.
- For elektrisk tempo injiserer du gjeldende pulser på 10 ms (rampe fra 0 pA til den innstilte verdien innen 10 ms), 0,25 Hz og finner terskelen for å fremkalle AP. Ta opp AP etter gjeldende injeksjoner på 50 % mer enn terskelen.
- For optisk tempo bruk lyspulser på 10 ms, 0,25 Hz med minimal lysintensitet for å fremkalle pålitelig AP.
- Ta opp fotohemming i I-clamp-modus ved 0 pA. Fremkall AP som beskrevet i trinn 5.6.2.1 og påfør vedvarende lys i 64 s ved 4 mW/mm2 etter 15 elektrisk utløste AP.
MERK: Figur 6F viser en fotohemmingsprotokoll der det under vedvarende lys påføres høyere strøminjeksjoner. Fra 1,5 ganger terskelen (her: 0,7 nA) ble den injiserte strømmen økt i trinn på 0,1 nA (siste nivå: 2,2 nA). I det hele tatt testet nåværende amplituder, vedvarende lys applikasjon hemmet AP generasjon.- Som et kontrolleksperiment, pause elektrisk stimulering for 64 s uten lys påføring.
- Ta opp fotoaktiveringsprotokoll i V-klemmemodus med et holdingpotensial på -74 mV. Bruk lyspulser på 300 ms.
- Patch-clamp eksperimenter
MERK: Utfør følgende eksperimenter i mørket (rødt lys kan brukes til blå/grønt lysaktiverte verktøy).- Plasser dekkslip med celler i målekammeret med ekstern løsning og velg fluorescerende CM.
MERK: EGFP-positive celler kan oppdages ved hjelp av en blå LED (460 nm) i kombinasjon med et band-pass eksitasjonsfilter (450 nm - 490 nm), et 510 nm dichroic speil og et 515 nm langpassutslippsfilter. Hvis andre fluorescerende koder brukes, bruk tilsvarende LED- og fluorescensfiltersett. Hvis en høy transduksjonseffektivitet oppnås (i våre hender > 99% med GtACR1 adenovirus), er det ikke nødvendig å sjekke eGFP fluorescens før de funksjonelle eksperimentene; dette unngår potensiell GtACR1 pre-aktivering. - Fyll lappepipetten med intern oppløsning. Sørg for at det ikke er luftbobler i spissen.
- Fest pipetten til pipetteholderen, og sett inn den sølvkloridbelagte sølvledningen i den interne oppløsningen.
- Etter å ha nådd den cellevedlagte konfigurasjonen, bytter du til helcellemodus i datainnsamlingsprogramvaren med et holdingpotensial på -74 mV. Ruptur membranen ved å forsiktig bruke negativt trykk for å få tilgang til hele cellekonfigurasjonen. Dette indikeres av en umiddelbar økning i målt kapasitans.
- Kjør protokollene som er beskrevet i del 5.6.
- Plasser dekkslip med celler i målekammeret med ekstern løsning og velg fluorescerende CM.
- Karbonfiber teknikk
- Produser karbonfibre.
- Bruk glasskapillærer med følgende parametere: ytre diameter: 2,0 mm, indre diameter: 1,16 mm, lengde: 100 mm (se Materialtegntabell). Bruk en mikropipetteavtrekker til å trekke glasskapillæren i to pipetter av samme lengde (total konsmallengde ~ 11 mm, figur 5)til en endelig indre diameter på ~ 30 μm.
MERK: Innstillingene som brukes for første og andre trekk er 85,2% (andel til maksimal effekt av avtrekkeren) og 49,0%, henholdsvis (vil avhenge av avtrekkeren, typen og alderen på filamentet). - Bøy pipettene opptil 45° med en selvlaget mikrosmi ved hjelp av innstillinger på 12 V, 24 A (se figur 4 for detaljer om pipettebøyeoppsettet).
- Juster kapillæren (2) på den røde linjen i orienteringssirkelen (5), hold plasseringen av kapillærkonstanten slik at lengden på bøyedelen alltid er den samme etter midten av orienteringssirkelen (radius på 4,5 mm).
- Bøy kapillæren opp til 45° (grønn linje) ved å skyve ned tuppen av kapillæren med bøyen (3) og smi ved å varme opp filamentet (4) til kapillæren fanger 45° vinkelen selv etter at bøyen er fjernet.
- Monter karbonfibrene (levert fra prof. Jean-Yves Le Guennec) i den fine spissen av glasskapillæren under et stereomikroskop. Bruk fine tang med myke rør på slutten for å øke grepet og redusere risikoen for å skade fibrene.
MERK: Disse fibrene er preget av mikrostrukturer, noe som øker kontaktflaten mellom fibre og celler, og forbedrer dermed vedhende20. - Skjær karbonfibrene i en lengde på 2 mm og bruk superlim (cyanoakrylat) for å feste fiberen til den fremre delen av kapillæren.
MERK: Jo lenger fibrene er, desto mer bøyer de seg ved påføring av samme kraft.
- Bruk glasskapillærer med følgende parametere: ytre diameter: 2,0 mm, indre diameter: 1,16 mm, lengde: 100 mm (se Materialtegntabell). Bruk en mikropipetteavtrekker til å trekke glasskapillæren i to pipetter av samme lengde (total konsmallengde ~ 11 mm, figur 5)til en endelig indre diameter på ~ 30 μm.
- Kalibrer karbonfibre.
- Kalibrer karbonfibrene ved hjelp av en krafttransduser med en følsomhet på 0,05 mN/V og et kraftområde på 0 - 0,5 mN (se Materialtabellen).
MERK: Dette oppsettet er skreddersydd for å måle komprimering i stedet for "pull". - Fest kapillæren med karbonfiberen til en holder som styres av en mikromanipulator og en piezomotor.
- Plasser spissen av fiberen i kontakt med kraftsensoren, men uten å produsere noen kraft og flytt piezomotoren i trinn på 10 μm (total bevegelse på 60 μm) mot sensoren og les ut den målte spenningen (E) i Volt.
MERK: Kontroller at krafttransduseren kontaktes av selve spissen av den frie enden av karbonfiberen. - Gjenta disse målingene tre ganger.
- Bruk formel 1 til å beregne kraften for hver piezoposisjon (ΔΕ-forskjellen
på målt spenning mellom piezomotortrinnene):
MERK: Følsomheten til krafttransduseren er avhengig av transduserens modell (her: 0,05 mN/V = 50 μN/V). Gevinsten kan stilles inn på kontrolleren. - Plott kraften [μN] mot piezoposisjonen. Hellingen tilsvarer fiberstivheten [μN/μm].
- Kalibrer karbonfibrene ved hjelp av en krafttransduser med en følsomhet på 0,05 mN/V og et kraftområde på 0 - 0,5 mN (se Materialtabellen).
- Rekordkraft av kontrahering CM.
MERK: Utfør følgende eksperimenter i mørket (rødt lys kan brukes til blå/ grønt lysaktivertverktøy).- Coat overflaten av målekammeret med poly-HEMA. Fyll målekammeret med ekstern badløsning og legg noen dråper av den kultiverte cellesuspensjonen i kammeret (trinn 4.9).
- Fest kapillærene med karbonfibre til scenen mikromanipulator. Velg GtACR1-uttrykkende CM ved å kontrollere muligheten til å indusere sammentrekninger ved bruk av korte pulser med grønt lys. Juster karbonfibrene nesten horisontalt til overflaten av målekammeret.
- Senk den første fiberen på celleoverflaten. Fest den andre fiberen parallelt med den første fiberen i den andre enden av CM. Den ideelle justeringen er nær vinkelrett på celleaksen.
MERK: Fest fiberen forsiktig ved å skyve cellen forsiktig til bunnoverflaten. Slipp trykket før du fester den andre fiberen. Ikke strekk cellen ved å feste den andre fiberen. - Etter at begge fibrene er festet på cellen, løft fibrene, slik at cellen ikke har noen kontakt med kammeroverflaten lenger og er i stand til å kontrakt uten friksjon.
- Fokuser sarkatene i datainnsamlingsprogramvaren (se Materialtabellen) og sett sporingsvinduet for sarkomerlengde (figur 7AI (3)) mellom fibrene.
MERK: Resulterende FFT effektspektrum (Figur 7AI (2)) viser ideelt sett en skarp topp, som representerer den gjennomsnittlige sarkomlengde. - Spor fiberbøying ved hjelp av kantdeteksjonsmodulen. Angi deteksjonsområdene med det røde og grønne vinduet og definer en terskel (rød og grønn horisontal linje) ved første derivat av lysintensitetssporet (Figur 7A III).
- Begynn å optisk tempo cellen på 0,25 Hz (hvis mulig, prøv raskere tempopriser) og spore sarkomer lengde og fiber bøying.
MERK: Fiberholderposisjon, LED-utløser og elektriske stimuleringspulser styres via datainnsamlingsprogramvaren (se Materialtabellen). - Etter registrering av minst 15 optisk fremkalte sammentrekninger, stimulerer feltcellen elektrisk (se Materialtabellen). Finn terskelen for å fremkalle sammentrekninger og registrere ved å bruke 1,5 ganger av terskelspenningen.
- For hemming protokollen, bruke elektriske stimuli å fremkalle sammentrekninger og deretter utsette for vedvarende lys av 64 s (ved ulike lys intensiteter).
- Produser karbonfibre.
på målt spenning mellom piezomotortrinnene):
Figur 4: Pipettebøyingsoppsett. (1) Mikromanipulatoren på venstre side brukes til å kontrollere posisjonen til kapillæren, og en annen mikromanipulator til høyre brukes til å bøye den. (2) Kapillær. (3) Bender. (4) Microforge. (5) Orienteringsirkel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Pipette med karbonfiber. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Dataanalyse
-
Patch-klemme opptak
MERK: Korriger alle registrerte og kommandospenninger for væskekoblingspotensialet etter eksperimentet. Bestem væskekoblingspotensialet i datainnsamlingsprogramvaren ved hjelp av muligheten for verktøykoblingspotensialkalkulator (for de angitte patch-clamp-løsningene i tabell 4: 14,4 mV ved 21 °C). Trekk det flytende koblingspotensialet fra den registrerte/kommandospenningen.- For Ap-opptak i I-klemme, sjekk elektrisk tempo kontra optisk tempo. Beregn AP-varigheten (APD) ved 20 og 90 % repolarisering med et spesialskrevet skript (tilleggsmateriale). Bestem hvilemembranpotensialet og AP amplitude.
MERK: Bestem APD som beskrevet i Wang K. et al.21 Skriptet for å laste inn ABF-filer er vanligvis tilgjengelig via følgende kobling: https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload. Gjennomsnittlige APD-verdier for minst 6 AP. - For Fotoaktivering av V-klemme må du kontrollere om baseline er ved 0 pA. Hvis ikke justere baseline til null. Analyser den registrerte strømmen utløst av 300 ms lyspulser ved -74 mV. Overfør dataene til dataanalyseprogramvare og bestem topp- og gjennomsnittlig stasjonær strøm.
- For Ap-opptak i I-klemme, sjekk elektrisk tempo kontra optisk tempo. Beregn AP-varigheten (APD) ved 20 og 90 % repolarisering med et spesialskrevet skript (tilleggsmateriale). Bestem hvilemembranpotensialet og AP amplitude.
-
Karbonfiber eksperimenter
- Sammentrekningsopptak under optisk tempo: Last inn de registrerte dataene i datainnsamlingsprogramvaren og les opp grunnlinjen og maksimal karbonfiberbøying og sarkofamerlengden endres.
MERK: Gjennomsnittlige verdier for 10 sammentrekninger av et stabilt opptak. - Mål cellebredden og beregn tverrsnittsområdet i cellen forutsatt en elliptisk tverrsnitt (Figur 7B II).
MERK: Formelen for området av en ellipse er A = π·a·b (Formel 2) hvor a er avstanden fra midten til toppunktet og b er avstanden fra midten til co-toppunktet. I vårt tilfelle betyr dette en = (bredden på cellen)/2 og b = (tykkelsen på cellen)/2. Ifølge Nishimura et al.22 tykkelsen på CM kan anslås å være en tredjedel av cellebredden slik at A = π· (1/2)·bredde· (1/2)·tykkelse = π· (1/4)·bredde· (1/3)·bredde = π· (1/12)·bredde2. - Beregn sluttsystolisk kraft (F):
- Beregn den endesystolisk celledeformasjonen (ESD):
MERK: Ytterligere kontraktile parametere kan analyseres: hvilesarkomer lengde, tid til topp, tid til 90% avslapning, fraksjonell sarkomer forkortelse, maksimal hastighet på sammentrekning og avslapning (se programvare oppkjøp manuell).
- Sammentrekningsopptak under optisk tempo: Last inn de registrerte dataene i datainnsamlingsprogramvaren og les opp grunnlinjen og maksimal karbonfiberbøying og sarkofamerlengden endres.
Representative Results
GTACR1-eGFP ble uttrykt i kultivert kanin CM (Figur 6 innsats) og fotostrømmer ble målt med patch-clamp teknikken. Photoactivation av GtACR1 viser store innover regisserte strømmer på -74 mV. I figur 6En toppstrøm (IP) ved 4 mW/mm2 er 245 pA. AP ble utløst enten elektrisk (Figur 6B) eller optisk (Figur 6C) med gjeldende injeksjoner 1,5 ganger terskelen, eller korte depolariserende lyspulser på henholdsvis 10 ms. Analysere APD-verdier, elektrisk tempo CM viser en APD 20 av 0,24 ± 0,08 s og en APD 90 på 0,75 ± 0,17 s, mens optisk tempo CM viser en APD 20 av 0,31 ± 0,08 s og en APD 90 av 0,81 ± 0,19 s (SE, n = 5, N = 2, her presentert eksempel APD 20elektrisk = 0,17 s; APD 20optisk = 0,27 s og APD 90elektrisk = 0,61 s; APD 90optisk = 0,68 s; Figur 6D). Optisk tempo CM viser en langsommere AP-innsettende (figur 6D). CM-aktivering ble hemmet ved vedvarende belysning (for 64 s, 4 mW/mm2) ved å polarisere membranpotensialet mot reverseringspotensialet til klorid, her -58 mV (figur 6E). Høyere strøminjeksjoner enn 1,5 ganger terskelen ikke fremkaller AP-generering (figur 6F). Genererte toppkrefter ble bestemt av karbonfiberbøyning (Figur 7B,C,E). CM genererte 232 μN/mm2 ved elektrisk tempo (figur 7B) og 261 μN/mm2 etter optisk tempo (figur 7C). Langvarige pulser med grønt lys hemmer sammentrekninger (figur 7E). Etter optisk hemming for 64 s, reoccurring sammentrekninger generere en lavere kontraktile kraft, og kraftverdier gjenopprette mot baseline etter ~ 10 sammentrekninger (pacing på 0,25 Hz, figur 7D)i tråd med diastolisk kalsium tap fra kanin CM.
Figur 6: Representative patch-clamp opptak av elektrisk og optisk tempo / hemmet CM. (A) Representativ fotostrøm ved -74 mV med en lyspuls på 300 ms, 4 mW/mm2. IP indikerer toppstrømmen. Innsatsen viser en positiv gtacr1-eGFP-celle. (B) Representativ AP-opptak ved 0 pA ved hjelp av en strømrampe på 10 ms, 0,6 nA for å elektrisk tempo cm. (C) Representativ AP-opptak ved 0 pA ved hjelp av lyspulser på 10 ms, 0,4 mW/mm2. (D) Toppgrafen viser overlegget av 10th AP elektrisk (blå) og optisk (grønn) aktivert CM. AP ble justert med maksimal endring i membranpotensial (dV / dt maks). Bunngrafen viser forskjellen på membranpotensial mellom optisk og elektrisk utløst AP (Eoptisk-Eelektrisk). (E) Elektrisk utløst AP ble hemmet under vedvarende lys på 64 s, 4 mW/mm2. (F) AP hemmes av høyere strøminjeksjoner enn 1,5 ganger terskelen (fra 0,7 nA i trinn på 0,1 nA til 2,2 nA) under vedvarende lys. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Representative data fra karbonfiberopptak av optisk og elektrisk tempo/hemmet CM. (A) Vis i datainnsamlingsprogramvaren. Bilde (I) viser den målte CM med vinduet for beregning av sarkomerlengde. Cellebredden er merket i oransje. (1) Rekkevidde av relevante frekvenser. (2) FFT effektspekteret viser frekvensen av sarkomeravstanden på cellen. Den gjennomsnittlige sarkomlengden beregnes fra toppfrekvensen. (3) Sarkomer lengde sporing vindu. (4) Intensitetssporing. (5) Intensitetssporingen multiplisert med et Hamming-vindu er vindusintensitetssporingen. Ordningen (II) viser elliptiske tverrsnitt et av cellen. Bredde i oransje og tykkelse i stiplet blå. Bilde (III) viser plasseringen av karbonfibrene med de respektive deteksjonsboksene, igjen i rødt og høyre i grønt. (6) Intensitetssporing. (7) Første derivat av intensitetssporing (se datainnsamlingsprogramvarehåndbok). (B) Representativspor av elektrisk fremkalte sammentrekninger. Panel (I) viser sarkomerlengde forkortelse, panel (II) avstanden mellom de to karbonfibrene. (C) Representativspor av optisk fremkalte sammentrekninger (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2). Panel (I) viser sarkomerlengde forkortelse, panel (II) avstanden mellom de to karbonfibrene. (D) Generert toppkraft fra sammentrekning 1 til 11 etter en pause forårsaket av hemming av AP-generering. (E) Representativ spor av optisk hemming av sammentrekninger under vedvarende belysning (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). Panel (I) viser sarkomerlengde forkortelse, panel (II) lengden mellom de to karbonfibrene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| A | Området |
| Acr | anion channelrhodopsin |
| Ap | handling potensial |
| Apd (andre kan foregå | handling potensiell varighet |
| Cfu | koloni forming enhet |
| Chr | kanalrhodopsin (andre er i gang med |
| Cm | kardiomyocyte |
| eAvis eI00 | forbedret grønt fluorescerende protein |
| Esd | avslutte systolisk celledeformasjon |
| Eu | endotoksinenheter |
| F | Kraft |
| Fft | rask Fourier transform |
| GtaCR (andre kan være på | Guillardia theta anion channelrhodopsin |
| Gui | grafisk brukergrensesnitt |
| I-klemme | strømklemme |
| Ie | internasjonale enheter |
| Moi | mangfold av infeksjon |
| poly-HEMA | poly (2-hydroksyety metakrylat) |
| V-klemme | spenning-klemme |
Tabell 5: Liste over forkortelser.
Tilleggsfigur 1: Lysintensitetsmålinger med optisk effektmåler. (A) Måling av 10 ms lyspulser ved 4 mW/mm2. (B) Måling av vedvarende belysning på 64 s ved 4 mW/mm2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 2: Egenskaper av nyisolert CM og deres strukturelle tilpasning i kultur. (A) AP-opptak av en nyisolert CM (APD 20 av 1,11 ± 0,34 s, APD 90 av 1,96 ± 0,32 s, n = 7, N = 2). Gjennomsnittlig hvilemembranpotensial på -79,3 ± 0,8 mV (n = 7, N = 2). (B) Karbonfiberopptak av en elektrisk tempo, nyisolert CM. Gjennomsnittlig toppkraft på 205 ± 78 μN/mm2 (n = 7, N = 2). (C) Konfokale bilder av en nyisolert CM (I); utransdusert (II) og transdusert (III) CM etter 48 timer i kulturen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsmateriale: MatLab-skript for å bestemme APD- og hvilemembranpotensialet. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Mens optogenetiske verktøy muliggjør modulering av excitable celle elektrofysiologi på en ikke-invasiv måte, de trenger grundig karakterisering i ulike celletyper (f.eks CM) for å tillate en å velge det beste tilgjengelige verktøyet for en bestemt eksperimentell design. Patch-clamp teknikken er en standard metode for å vurdere cellulær elektrofysiologi. I hele cellekonfigurasjonen gjør det mulig for en å registrere fotoaktiverte strømmer over plasmamembranen eller temporale endringer i membranspenning etter lysstimulering/hemming. Optogenetisk manipulering av elektrisk eksitasjon påvirker også CM-sammentrekninger. Vi bruker sarkomersporing og karbonfiberassisterte kraftmålinger for å kvantifisere effekten av optisk avhør på den mekaniske aktiviteten til myocytter.
Vi beskriver en protokoll for å karakterisere de grunnleggende effektene av en lys-gated klorid kanal, GtACR1, i CM. Som modellsystem valgte vi kanin CM, da deres elektrofysiologiske egenskaper (f.eks. AP-form og ildfast periode) ligner de som observeres i menneskelig CM nærmere enn gnager CM. Dessuten kan kan kan inrabbit CM dyrkes i flere dager, lenge nok til adenoviral levering og uttrykk for GtACR1-eGFP. Spesielt, isolert CM endre sine strukturelle egenskaper i kultur over tid, inkludert avrunding av celle avslutninger og gradvis tap av kryss-striation, T-rørformet system og caveolae23,24. I tråd med dette har funksjonelle endringer blitt rapportert i kultivert CM: depolarisering av hvilemembranpotensialet, forlengelse av AP og endringer i cellulær Ca2 + håndtering. For gjennomgang av cellulære tilpasninger i kultur, vennligst se Louch et al.25. Supplerende figur 2 viser eksemplariske AP- og sammentrekningsmålinger av nyisolert CM for sammenligning med de som er observert i kultivert CM (Figur 6, Figur 7) ved hjelp av den her presenterte protokollen.
Helcellede patch-clamp opptak muliggjør direkte målinger av fotostrømmer egenskaper (f.eks amplituder og kinetikk) og lysinduserte endringer i membranpotensial eller AP-egenskaper ved høy temporal oppløsning. Imidlertid har slike opptak flere begrensninger: For det første erstattes cytosolet av pipetteløsningen i helcelleopptak, noe som er fordelaktig å kontrollere ioniske elektrokjemiske gradienter, men har den indre ulempen med å vaske ut cellulære organeller, proteiner og andre forbindelser, og dermed potensielt påvirke cellulære elektriske responser. For det andre er bivirkninger som aktivering av flere ionekanaler som følge av ikke-fysiologisk lang depolarisering (f.eks. langsomme tidskonstanter av lys-gated ionkanaler) vanskelig å vurdere, da vår metode bare tillater en å oppdage endringer i APD, men ikke å gjennomføre direkte målinger av ioniske konsentrasjoner i elektrofysiologisk relevante cellerom. Dette kan gjøres med fluorescerende indikatorer (f.eks. ca2+ sensorer) eller ionselektive elektroder. Ytterligere karakterisering kan omfatte lysintensitetstitreringer, bestemmelse av pH-avhengighet, fotostrømkinetikk ved ulike membranpotensialer, og utvinning kinetikk under repeterende lysstimulering.
I motsetning til patch-clamp opptak, gjør encellede kraftmålinger analyse av cellulære sammentrekninger av intakte myocytter uten å påvirke deres intracellulære miljø. Sekundære effekter på ionkonsentrasjoner (f.eks.ca. 2+) kan indirekte vurderes ved å bestemme generert kraftamplitude og dynamikk (f.eks. maksimal hastighet på sammentrekning og avslapning; her ikke analysert). Kraftmålinger med karbonfiberteknikken har en fordel over fritt kontraherende celler, da de gir direkte informasjon om passive og aktive krefter i forhåndslastede celler (dvs. under forhold som ligner mer på in situ- eller in vivo-innstillingene). Mekanisk forhåndslasting er spesielt viktig når du analyserer cellulær kontraktilitet, da stretch påvirker kraftproduksjon og avslapning26,27.
Optogenetiske tilnærminger tillater spatiotempoally presis manipulering av cellulær membran potensial, både i enkelt CM og intakt hjertevev. Klassisk, ChR2, en lys-gated kation ikke-selektiv kanal, har blitt brukt for depolarisering av membranpotensialet, mens lysdrevne proton- og/eller kloridpumper ble brukt til membranhyperpolarisering. Begge grupper av optogenetiske aktuatorer krever høye uttrykksnivåer, da ChR2 er preget av en iboende lav enkanalsledning28 og lysdrevne pumper som maksimalt transporterer en ion per absorbert foton. Videre kan langvarig aktivering av ChR2 i CM føre til Na+ og/ eller Ca2 + overbelastning, og lysdrevne pumper kan endre trans-sarcolemmal H+ eller Cl- gradienter29,30. I søk etter alternative verktøy for optogenetisk kontroll av CM aktivitet, vi nylig testet den naturlige anion channelrhodopsin GtACR1, preget av en overlegen enkeltkanals ledningsevne og høyere lysfølsomhet sammenlignet med kation ChR som ChR2. Vi fant at GtACR1 aktivering depolariserer CM og kan brukes til optisk tempo og hemming, avhengig av lys puls timing og varighet. En ekstra fordel med å bruke ACR i stedet for kation ChR kan være det mer negative reverseringspotensialet til Cl- sammenlignet med Na+, noe som reduserer kunstig introduserte ionstrømmer. Som vi tidligere har vist, kan optisk tempo med GtACR1 føre til AP-forlengelse som følge av den langsomme komponenten av GtACR1-kanallukking, som kan overvinnes ved hjelp av raskere GtACR1 mutanter19. Ap-forlengelse er imidlertid mye mindre uttalt når du bruker en lavere, mer fysiologisk intracellulær Cl- konsentrasjon (se figur 6). Videre gtacr1-mediert hemming av langvarig belysning resulterer i dyp membran depolarisering, som igjen kan aktivere sekundær Na+ og Ca2 + tilstrømning, og dermed endre aktiviteten til spenningsstyrte kanaler. I våre målinger finner vi at AP- og sammentrekningsparametre gjenoppretter til baseline innen 40 s etter en lysindusert hemming i 1 min (se Kopton et al. 2018, Figur 6, Figur 7). Lys-gated K+ kanaler tilbyr et potent alternativ for å dempe CM uten å påvirke CM hvilemembran potensial31.
I fremtiden ønsker vi å kvantitativt sammenligne ulike optogenetiske verktøy for deres potensial til å hemme hjerteaktivitet. For dette formål tester vi en rekke lys-gated ion kanaler inkludert ACR, ChR2 og rød-forskjøvet ChR varianter32, samt hyperpolariserende aktuatorer som halorhodopsin eller lyset gated adenylyl cyclase bPAC i kombinasjon med kaliumkanalen SthK (PAC-K)31.
Her presenteres protokollen kan brukes for grundig karakterisering av de elektromekaniske egenskapene til CM. Det gjelder hovedsakelig også for CM fra andre arter, og til CM isolert fra syk myokardiet. Optisk stimulering gjør det mulig å tempo CM ved forskjellige frekvenser, og forskjellige preloader kan testes under karbonfiber sammentrekning eksperimenter. Et interessant eksperiment ville være å bruke lavintensitetsbelysning for subterskeldepolarisering, for å etterligne gradvis økning i hvilemembranpotensialet, som kan observeres under utviklingen av hjertevevsmodellering under sykdomsprogresjon. Til slutt kan funksjonelle målinger kombineres med Ca2+ avbildning for ytterligere innsikt i eksitasjon-sammentrekningskobling, eller med farmakologiske intervensjoner for å evaluere effekten av ulike legemidler på CM-aktivitet.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Stefanie Perez-Feliz for utmerket teknisk assistanse, Dr. Jonas Wietek (Humboldt-University, Berlin, Tyskland) for å gi pUC57-GtACR1 plasmid, Prof. Dr. Michael Schupp (Charité- Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin) for adenovirusproduksjonen og Dr. Anastasia Khokhlova (Ural Federal University) for å dele sin ekspertise for å forbedre celleisolasjonsprotokollen og å re-designe pipettebøyingsoppsettet. Prosjektet ble finansiert av German Research Foundation (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Emmy-Noether fellesskap: SCHN1486/2-1) og ERC Advanced Grant CardioNECT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Cell isolation/Culturing/Transduction | |||
| Adeno-X Adenoviral System 3 CMV | TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA | ||
| Aortic cannula | Radnoti | 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm | |
| Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0151 | Borosilicate Glass |
| Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm | Samuel Findings, London, UK | TSGBL3 | |
| Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland | Galaxy 170S | |
| Langendorff-perfusion set-up | Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany | Custom-made | |
| Langendorff-pump | Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland | ISM444 | |
| Mesh: Nylon Monodur filter cloth | Cadisch Precision Meshes Ltd | 800 µm holes, 1 m wide | |
| Neubauer chamber | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 717806 | |
| Rabbit, New Zealand White | Charles River | Strain Code: 052 | |
| Scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BC774R | Bauchdeckenschere ger. 18cm |
| Sterile filter, 0.22 µm | Merck, Darmstadt, Germany | SLGP033RB | |
| Equipment - Patch-clamp | |||
| Amplfier | AxonInstruments, Union City, CA, United States | Axopatch 200B | |
| Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0178 | Borosilicate Glass |
| Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, San José, CA, United States | 1550A | |
| Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | BZ:00 |
| Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
| Headstage | AxonInstruments, Union City, CA, United States | CV203BU | |
| Interface | Scientifica, Uckfield, UK | 1U Rack, 352036 | |
| LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
| LED control software | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
| LED control system | custom-made | ||
| Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PP-830 | |
| Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
| Motorised Micromanipulator | Scientifica, Uckfield, UK | PatchStar | |
| Optical power meter | Thorlabs, Newton, NJ, United States | PM100D | |
| Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
| Silver wire | A-M Systems, Sequim, WA, United States | 787500 | Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet |
| Soda lime glass capillaries | Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark | 160213 BRIS, ISO12772 | 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm |
| Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
| Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
| Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
| Equipment - Carbon fiber | |||
| Carbon fibers | provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec | BZ:00 | |
| Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States | 1550B | |
| Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | |
| Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
| Fluorescence System Interface | IonOptix, Milton, MA United States | FSI-800 | 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm |
| Force Transducer System | Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada | 406A | |
| Glass capillaries for force measurements | Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States | GC200F-10 | |
| Interface National Instruments | National Instruments, Budapest, Hungary | BNC-2110 | |
| LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
| LED control box | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
| LED control system | custom-made | ||
| Microcontroller | Parallax Inc., Rocklin, California, United States | Propeller | |
| Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PC-10 | |
| Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
| MyoCam-S camera | IonOptix, Dublin, Ireland | ||
| MyoCam-S camera Power | IonOptix, Milton, MA, United States | MCS-100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States | MYP100 | |
| Piezo Motor | Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | E-501.00 | |
| Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
| Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
| Software IonWizard | IonOptix, Dublin, Ireland | Version 6.6.10.125 | |
| Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
| Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
| Chemicals | |||
| Adenosine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9251-100G | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A7030-50G | |
| CaCl2 | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 21114-1L | |
| L-Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C9500-25G | |
| Collagenase type 2, 315 U/mg | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS004177 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C0780-50G | |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C1768-100MG | |
| EGTA | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3054.3 | |
| Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL | Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany | PZN-07829486 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | F9665 | |
| Gentamycin 50 mg/mL | Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA | 15750-037 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | G7021-1KG | |
| Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | PZN-03029843 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | H3375-1KG | |
| Insulin (bovine pancreas) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | I6634-50MG | |
| K-aspartate | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A6558-25G | |
| KCl | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 26764.260 | 1 mg/mL |
| KOH | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 35113-1L | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | L2020-1MG | |
| M199-Medium | Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States | M4530 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9187-1G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 63069-500ML | |
| NaCl | Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK | 10428420 | |
| NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 3200950 | |
| NaOH | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A6579 | without Ca2+/Mg2+ |
| Na-pyruvat | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P2256-100MG | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | D1408-500ML | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma, Poole, UK | 192066 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P5147-1G | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | T0625-500G | |
| Thiopental Inresa 0.5 g | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | PZN-11852249 | |
| Xylazine hydrochloride, Rompun 2% | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN-01320422 |
References
- Harz, H., Hegemann, P. Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas. Nature. 351, 489-491 (1991).
- Litvin, F. F., Sineshchekov, O. A., Sineshchekov, V. A. Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis. Nature. 271, 476-478 (1978).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
- Lozier, R. H., Bogomolni, R. A., Stoeckenius, W. Bacteriorhodopsin: a light-driven proton pump in Halobacterium Halobium. Biophysical journal. 15 (9), 955-962 (1975).
- Schobert, B., Lanyi, J. K. Halorhodopsin is a light-driven chloride pump. Journal of Biological Chemistry. 257 (17), 10306-10313 (1982).
- Inoue, K., et al. A light-driven sodium ion pump in marine bacteria. Nature Communications. 4, 1678 (2013).
- Han, X., et al. A High-Light Sensitivity Optical Neural Silencer: Development and Application to Optogenetic Control of Non-Human Primate Cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Grimm, C., Silapetere, A., Vogt, A., Bernal Sierra, Y. A., Hegemann, P. Electrical properties, substrate specificity and optogenetic potential of the engineered light-driven sodium pump eKR2. Scientific Reports. 8, 9316 (2018).
- Wietek, J., et al. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel. Science. 344 (6182), New York, N.Y. 409-412 (2014).
- Berndt, A. Structure-Guided Transformation. Science. 344 (6182), New York, N.Y. 420-424 (2014).
- Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
- Mohamed, G. A., et al. Optical inhibition of larval zebrafish behaviour with anion channelrhodopsins. BMC Biology. 15 (1), 103 (2017).
- Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. Optogenetic Neuronal Silencing in Drosophila during Visual Processing. Scientific Reports. 7, 13823 (2017).
- Govorunova, E. G., Cunha, S. R., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. Anion channelrhodopsins for inhibitory cardiac optogenetics. Scientific Reports. 6, 33530 (2016).
- Kopton, R. A., et al. Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels. Frontiers in Physiology. 9, 1806 (2018).
- Peyronnet, R., et al. Load-dependent effects of apelin on murine cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 333-343 (2017).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).
- Nishimura, S., et al. Single cell mechanics of rat cardiomyocytes under isometric, unloaded, and physiologically loaded conditions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), 196-202 (2004).
- Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. Action potentials, ion channel currents and transverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell culture. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 43 (6), 814-827 (1996).
- Burton, R. A. B., et al. Caveolae in Rabbit Ventricular Myocytes: Distribution and Dynamic Diminution after Cell Isolation. Biophysical Journal. 113 (5), 1047-1059 (2017).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Janssen, P. M., Hunter, W. C. Force, not sarcomere length, correlates with prolongation of isosarcometric contraction. The American Journal of Physiology. 269 (2), 676-685 (1995).
- Monasky, M. M., Varian, K. D., Davis, J. P., Janssen, P. M. L. Dissociation of force decline from calcium decline by preload in isolated rabbit myocardium. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 456 (2), 267-276 (2008).
- Kleinlogel, S., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca 2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature Neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
- Schneider-Warme, F., Ravens, U. Using light to fight atrial fibrillation. Cardiovascular Research. 114 (5), 635-637 (2018).
- Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
- Bernal Sierra, Y. A., et al. Potassium channel-based optogenetic silencing. Nature Communications. 9 (1), 4611 (2018).
- Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9 (1), 3949 (2018).
