Summary
Presentiamo un protocollo per valutare gli effetti elettromeccanici dell'attivazione di GtACR1 nei cardiomiociti del coniglio. Forniamo informazioni dettagliate sull'isolamento cellulare, la coltura e la trasduzione adenovirale, e sugli esperimenti funzionali con le tecniche patch-clamp e fibra di carbonio.
Abstract
Negli ultimi due decenni, sono stati istituiti strumenti optogenetici come potenti mezzi per modulare l'attività specifica di tipo cellulare nei tessuti eccitabili, compreso il cuore. Mentre la Channelrhodopsin-2 (ChR2) è uno strumento comune per depolarizzare il potenziale della membrana nei cardiomiociti (CM), potenzialmente suscitando potenziali di azione (AP), uno strumento efficace per un silenziamento affidabile dell'attività CM è mancato. È stato suggerito di utilizzare le channelrhodopsins di anion (ACR) per l'inibizione optogenetica. Qui, descriviamo un protocollo per valutare gli effetti dell'attivazione dell'ACR GtACR1 naturale da Guillardia theta in CM coniglio coltivato. Il protocollo include l'isolamento CM dal cuore di coniglio, la semina e la coltura delle cellule per un massimo di 4 giorni, la trasduzione tramite codifica adenovirus per il canale cloruro illuminato, la preparazione di patch-clamp e configurazioni in fibra di carbonio, la raccolta e l'analisi dei dati. L'utilizzo della tecnica patch-clamp nella configurazione a celle intere consente di registrare le correnti attivate dalla luce (in modalità morso di tensione, V-clamp) e AP (modalità di morsetto di corrente, I-clamp) in tempo reale. Oltre agli esperimenti di patch-clamp, conduciamo misurazioni di contrattilità per la valutazione funzionale dell'attività CM senza disturbare l'ambiente intracellulare. Per fare ciò, le cellule vengono precaricate meccanicamente utilizzando fibre di carbonio e le contrazioni vengono registrate monitorando i cambiamenti nella lunghezza del sarcomere e nella distanza della fibra di carbonio. L'analisi dei dati include la valutazione della durata degli AP dalle registrazioni i-clamp, le correnti di picco dalle registrazioni dei morsetti a V e il calcolo della forza dalle misurazioni della fibra di carbonio. Il protocollo descritto può essere applicato alla sperimentazione degli effetti biofisici di diversi attuatori optogenetici sull'attività della CM, un prerequisito per lo sviluppo di una comprensione meccanicistica degli esperimenti optogenetici nel tessuto cardiaco e nei cuori interi.
Introduction
Le fotocorrenti mediate da ChR sono state registrate per la prima volta nell'oculare delle alghe verdi unicellulari1,2. Poco dopo la clonazione genetica e l'espressione eteologa di Chlamydomonas reinhardtii ChR1 e ChR2, ChR sono stati utilizzati come strumenti per alterare il potenziale della membrana negli ovociti Xenopus e nelle cellule dei mammiferi dalla luce3,4. Cation CR non-selettivo depolarizzare la membrana delle cellule con un potenziale di membrana a riposo che è negativo per il potenziale di inversione di ChR. Essi possono quindi essere utilizzati per suscitare AP in cellule eccitabili, compresi neuroni e CM, permettendo ritmo ottico5,6.
Complementare alla cation ChR, protone leggero, cloruro e pompe di sodio7,8,9 sono stati utilizzati per inibire l'attività neuronale10,11,12. Tuttavia, questi ultimi hanno limitazioni, che richiedono un'elevata intensità luminosa e un'illuminazione sostenuta, poiché uno ione viene trasportato per fotone assorbito. Nel 2014, due studi indipendenti di Wietek et al. Un anno dopo, ACR naturale sono stati scoperti nel cryptophyte Guillardia theta (GtACR)15. Poiché l'ACR ingegnerizzato ha mostrato una conduttanza residua, sono stati sostituiti da ACR naturale, caratterizzato da una grande conduttanza a canale singolo e ad alta sensibilità alla luce15. I GtACR sono stati utilizzati per silenziare l'attività neuronale polarizzando il potenziale della membrana verso il potenziale di inversione del cloruro16,17. Govorunova et al. applicato GtACR1 a massa CM ventricolare di ratto coltivato e ha mostrato una fotoinibizione efficiente a bassi livelli di intensità luminosa che non erano sufficienti per attivare gli strumenti di inibizione precedentemente disponibili, come la pompa protone Arch18. Il nostro gruppo ha recentemente riferito che la fotoinibizione mediata da GtACR1 di CM si basa sulla depolarizzazione e che GtACR1 può anche essere utilizzato, quindi, per il ritmo ottico di CM19.
Qui presentiamo un protocollo per studiare gli effetti elettrofisiologici e meccanici della fotoattivazione GtACR1 sul cm ventricolare del coniglio coltivato. Descriviamo prima l'isolamento cellulare, la coltura e la trasduzione. Gli effetti elettrofisiologici sono misurati utilizzando registrazioni di morsetti a tutta cellula. Le correnti mediate dalla luce in una determinata tensione della membrana sono valutate in modalità morsetto a V. Le dinamiche potenziali della membrana vengono misurate durante la stimolazione elettrica o ottica di CM (modalità I-clamp). L'inibizione ottica dell'AP attivato elettricamente viene testata mediante un'applicazione di luce sostenuta. Gli effetti meccanici sono misurati utilizzando fibre di carbonio in combinazione con il tracciamento basato sull'imaging della lunghezza del sarcomere. Per farlo, le cellule otticamente misurabili vengono precaricate meccanicamente collegando due fibre di carbonio alla membrana plasmatica vicino alle estremità cellulari opposte. I cambiamenti di lunghezza di Sarcomere vengono registrati durante il ritmo ottico o elettrico. Infine, la fotoinibizione viene misurata durante la stimolazione del campo elettrico delle cellule e le forze generate vengono analizzate.
Il protocollo include i seguenti passaggi illustrati nel diagramma di flusso nella Figura 1: anestesia profonda del coniglio, iniezione di sovradosaggio tiopentale, escissione cardiaca, perfusione Langendorff e digestione dei tessuti, dissociazione meccanica del tessuto per rilasciare le cellule, analisi microscopica della resa CM, coltura di CM, trasduzione con adenovirus di tipo 5, seguita da incubazione e esperimenti funzionali.
Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo utilizzato per ottenere CM elettricamente e otticamente utilizzabile. I cuori vengono astenuti dai conigli di 9-10 settimane di età e il tessuto cardiaco viene digerito mentre viene perfuso utilizzando una configurazione Langendorff. Le cellule vengono rilasciate per agitazione meccanica. La resa CM viene conteggiata al microscopio. I CM sono coltivati, trasdotti con adenovirus di tipo 5 e gli esperimenti funzionali vengono eseguiti 48-72 ore dopo la trasduzione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Tutti gli esperimenti sui conigli sono stati effettuati secondo le linee guida delineate nella direttiva 2010/63/EU del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e approvati dalle autorità locali del Baden-Wàrttemberg (Regierungspr-sidium Diiburg, X-16/10R, Germania).
1. Soluzioni per l'isolamento delle cellule
- Preparare le soluzioni per l'isolamento cellulare con acqua dei seguenti requisiti (Tabella 1) e in base alle composizioni ioniche elencate nella tabella 2.
NOTA: CaCl2 e MgCl2 vengono aggiunti da soluzioni stock 1 M.
| Fabbisogno idrico | |
| Conduttività [S/cm] a 25 gradi centigradi | 0.055 |
| Pirogeno [UE/mL] | < 0.001 |
| Particella (dimensioni > 0,22 m) [1/mL] | N. 1 |
| Totale carbonio organico [ppb] | < 5 |
| Microrganismi [CFU/mL] | N. 1 |
| RNase [ng/mL] | < 0,01 |
| DNase [ng/mL] | < 4 |
Tabella 1: Requisiti dell'acqua.
| Soluzione salina fisiologica (1) | Calcio basso, soluzione ad alto potassio (2) | Soluzione enzimatica (3) | Soluzione di blocco | |
| NaCl [mM] | 137 | 137 | 137 | 137 |
| KCl [mM] | 4 | 14 | 14 | 14 |
| HEPES [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Creatina [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Taurina [mM] | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Glucosio [mM] | 10 | 10 | 10 | 10 |
| MgCl2 [mM] | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Adenosina [mM] | 5 | 5 | 5 | 5 |
| L-Carnitina [mM] | 2 | 2 | 2 | 2 |
| CaCl2 [mM] | 1 | - | 0.1 | 0.1 |
| Na-Heparin [IU/L] | 5000 | - | - | - |
| EGTA [mM] | - | 0.096 | ||
| Collagenae tipo 2, 315 U/mg [g/L] | - | - | 0.6 | - |
| Protease XIV [g/L] | - | - | 0.03 | - |
| Albumin siero bovino [%] | - | - | - | 0.5 |
| Osmolarità [mOsmol/L] | 325 X 5 | 345 X 5 | 345 X 5 | 345 X 5 |
Tabella 2: Soluzioni per l'isolamento CM.
- Regolare tutte le soluzioni per pH 7.4 a 37 gradi centigradi e controllare l'osmolarità.
NOTA: Sciogliere gli enzimi (Collagenae tipo 2 e Protease XIV) direttamente prima dell'escissione del cuore. Ossigenare tutte le soluzioni prima dell'uso.
2. Preparazione dell'installazione Langendorff-perfusion
NOTA: la configurazione utilizzata è personalizzata. Come illustrato nella Figura 2, l'impostazione è costituita da tre serbatoi rivestiti di acqua (1-3), uno scambiatore di calore a contrasto a spirale (4) e un recipiente perfusione rivestito in acqua (5).
Figura 2: Impostazione langendorff-perfusione ottimizzata per l'isolamento delle celle di coniglio. (1-3) Serbatoi in giacca idrica con (1) soluzione salina fisiologica, (2) calcio basso, soluzione ad alto potassio e (3) soluzione cardioplegica contenente enzimi. (4) Scambiatore di calore a contrasto a spirale e (5) serbatoio di raccolta rivestito in acqua. L'afflusso del sistema rivestito d'acqua è lo scambiatore di calore a spirale (temperatura di soluzioni che lasciano la cannula di perfusione alla fine dello scambiatore di calore dovrebbe essere costante a 37 gradi centigradi), seguito dal recipiente perfusione e dai tre serbatoi. Tutte le soluzioni sono ossigenate (linea tratteggiata). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Accendere la pompa del bagno d'acqua per far circolare l'acqua a 38 gradi centigradi nel sistema di cambio di calore e preriscaldare tutte le soluzioni a 37 gradi centigradi.
NOTA: La temperatura al deflusso di (4) deve essere controllata e costante a 37 gradi centigradi. - Riempire i tre serbatoi con la rispettiva soluzione e lavare ogni linea (nero) con la soluzione corrispondente. Riempire la linea principale (blu) alla fine senza bolle d'aria utilizzando la soluzione (1).
NOTA: Ossigenare le soluzioni precedenti (10 min) e durante l'uso. Riempire la linea dal serbatoio (3) al rubinetto con calcio basso, soluzione ad alto potassio. - Preparare una sutura per legare il cuore intorno all'aorta alla cannula.
3. Isolamento cellulare
- Preparare le seguenti siringhe.
- Per sedazione/anestesia: Miscela di 0,5 mL/kg di peso corporeo esketamine hydrocloride (25 mg/mL) e 0,2 mL/kg di peso corporeo xylazine idrocloruro (2%).
- Riempire due siringhe con 12 mL di soluzione NaCl (0,9%).
- Preparare 6 mL di 12,5 mg/mL Na-thiopental, sciolto in soluzione NaCl 0.9%.
- Riempire 0,2 mL di cloruro di esketamina (25 mg/mL) in una siringa.
- Diluire 0,2 mL di Na-heparin (5.000 IU/mL) in 1 mL di 0,9% soluzione NaCl (fine concentrazione 1.000 IU/mL).
- Sedate/anasthetize conigli (9-10 settimane, coniglio bianco neozelandese, femmina o maschio, 2 kg) tramite iniezione intramuscolare di idrocloruro di esketamina e clorchiuro di xilazina (passo 3.1.1).
NOTA: I conigli hanno bisogno di almeno 10 min per essere completamente anaprotesi; la durata esatta dipende dal loro peso corporeo. Confermare l'anestesia con la perdita del riflesso di raddorqui. - Rasare il petto e le orecchie dove si trovano le vene.
- Inserire una cannula flessibile nella vena dell'orecchio, fissarla con del nastro adesivo e sciacquarla con la soluzione NaCl dello 0,9%.
- Iniettare 1 mL di soluzione Na-heparin per via endovenosa e lavare con 0,9% soluzione NaCl.
- Iniettare 0,2 mL di cloruro di esketamina, lavare di nuovo con 0,9% soluzione NaCl e iniettare Na-thiopental fino all'apnea.
NOTA: Il coniglio non deve rispondere al riflesso di ritiro del pedale. - Aprire il torace sul lato sinistro e rimuovere il pericardio.
- Avviare il timer quando il cuore viene espulso e lavare il cuore due volte in soluzione salina fisiologica.
NOTA: Utilizzare le forbici con punte rotonde per prevenire danni accidentali al tessuto cardiaco. - Cannula l'aorta in un bagno con soluzione salina fisiologica e mantieni tutti i tessuti in soluzione. Accendere il sistema Langendorff-perfusione (soluzione salina fisiologica (1), velocità 24 mL/min).
- Trasferire il cuore all'impostazione Langendorff-perfusione, collegare l'aorta all'ugello del perfusate e legare saldamente il cuore con la sutura intorno all'aorta alla cannula (< 1 min).
NOTA: Pre-riempire la cannula con soluzione salina fisiologica, assicurarsi che nessuna bolla entra nella cannula durante il trasporto dal sito di cannutal allo configurazione Di Langendorff, collegare senza bolle. - Perfuso il cuore fino a quando tutto il sangue è lavato (2-3 min).
- Passare al calcio basso, soluzione ad alto potassio (2). Perfuso per 2 più min dopo che il cuore ha smesso di battere e passare alla soluzione enzimatica.
- Iniziare a ricircolare la soluzione enzimatica, dopo 2 min dall'inizio della digestione, di nuovo nel serbatoio. Diminuire la velocità a 16 mL/min dopo 5 min di digestione.
- Quando il tessuto appare morbido (40-50 minuti di digestione), tagliare il cuore dalla cannula e separare il ventricolo sinistro.
- Rilasciare le cellule mediante dissociazione meccanica (che separano delicatamente il tessuto con una pipetta e una pinze sottili per tenere il tessuto) in soluzione di blocco.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso una mesh (dimensione pome di 1 mm2)e centrifugare per 2 min a 22 x g (accelerazione gravitazionale).
- Rimuovere il supernatante contenente non-miociti e sospendere nuovamente CM in soluzione di blocco.
4. Coltura di CM
NOTA: eseguire i passaggi seguenti in condizioni sterili.
- Diluire Laminin (da Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane, 1 mg/mL) 1:10 in fosfato sterile bufferans salina (senza Ca2o/Mg2) ad una concentrazione finale di 100 g/mL.
- Preparare il mezzo di coltura in M199-Medium con i supplementi come indicato nella tabella 3.
| Mezzo di coltura cellulare in M199-Medium | |
| Creatina [mM] | 5 |
| L-Carnitina cloruro [mM] | 2 |
| Taurina [mM] | 5 |
| Na-Pyruvat [mM] | 1 |
| Insulina (pancreas bovino) [U/L] | 0.25 |
| Citosina-z-D-arabinofuranoside [mM] | 0.01 |
| Gentamycina [mg/mL] | 0.05 |
Tabella 3: Mezzo di coltura cellulare.
- Soluzione sterile-filtro (0,22 m) e aggiungere il 5% di siero bovino fetale.
- Per gli esperimenti patch-clamp autoclave coverslips 16 mm, spessore n. 0, coprirli con 100 lamennini sg/mL direttamente prima della coltura.
- Per esperimenti con fibra di carbonio, rivestire la superficie del piatto Petri con poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (poly-HEMA, 0,12 g/mL in 95:5 EtOH:H20) e lasciarlo solidificare.
NOTA: Le celle non si "attaccano" ai piatti Petri rivestiti di poli-HEMA; questo è fondamentale per la loro contrazione senza attrito negli studi di meccanica cellulare. - Dopo che la CM si è riaccesa (10-15 min), rimuovere il supernatante e quindi sospendere nuovamente CM nel supporto di coltura.
- Contare CM con una camera Neubauer e semi ad una densità obiettivo di 17.500 cellule /mL sia su coperchi rivestiti di laminina o in piatti Petri rivestiti poli-HEMA.
- Incubare le cellule a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 per 3-4 ore. Scambiare il mezzo (37 gradi centigradi) delle cellule semi-elevia di coverslip.
- Aggiungere la codifica adenovirus (tipo 5) per GtACR1-eGFP a una molteplicità di infezione (MOI) di 75 e avviare esperimenti funzionali dopo 48 ore.
NOTA: Dopo la trasduzione mantenere le cellule al buio. Utilizzare l'illuminazione rossa quando si lavora con proteine blu o verde attivate dalla luce. Un sistema di somministrazione adenovirale disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali)viene utilizzato per clonare i geni che codificano GtACR1-eGFP nel vettore adenovirale. L'inserto di interesse, qui GtACR1-eGFP, è amplificato PCR e quindi combinato con un vettore adenovirale tra cui un promotore CMV in una reazione IN-Fusion Cloning. Il promotore di CMV (citomegalovirus umano) è comunemente usato per guidare la sovraespressione dei transgeni nelle cellule dei mammiferi. eGFP è una proteina fluorescente verde potenziata derivata da Aequorea victoria con un massimo di eccitazione di 488 nm e un massimo di emissione a 507 nm. Adenovirus (tipo 5) è stato prodotto esternamente presso Charité-Universit'tsmedizin Berlin, Institut f'r Pharmakologie, Berlino, Prof.
AVVISO: La trasduzione adenovirale è classificata come lavoro a livello di sicurezza BSL-2 e sono necessarie misure di sicurezza adeguate.
5. Esperimenti funzionali
NOTA: le registrazioni vengono eseguite utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita. Filtrare la luce di trasmissione con un filtro passa-banda rossa (630/20 nm) nel condensatore per evitare la co-attivazione di GtACR1.
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Configurazione del morsetto
- Utilizzare un amplificatore in combinazione con un convertitore analogico-digitale. Utilizzare un software di acquisizione dati per registrare i dati correnti e di tensione (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: i dati registrati vengono digitalizzati a 10 kHz e filtrati a 5 kHz.
- Utilizzare un amplificatore in combinazione con un convertitore analogico-digitale. Utilizzare un software di acquisizione dati per registrare i dati correnti e di tensione (vedere Tabella dei materiali).
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Configurazione della fibra di carbonio
- Usa una fotocamera per rilevare la posizione della fibra di carbonio e la lunghezza del sarcomero monitorando i cambiamenti nel contrasto ottico (le fibre di carbonio appaiono come strutture più scure, sovrapposte al modello a cellule striate). Una rappresentazione schematica dell'impostazione è illustrata nella figura 3.
NOTA: la lunghezza di Sarcomere viene calcolata in tempo reale utilizzando una trasformazione veloce di Fourier (FFT) dello spettro di potenza del modello di striatura.
- Usa una fotocamera per rilevare la posizione della fibra di carbonio e la lunghezza del sarcomero monitorando i cambiamenti nel contrasto ottico (le fibre di carbonio appaiono come strutture più scure, sovrapposte al modello a cellule striate). Una rappresentazione schematica dell'impostazione è illustrata nella figura 3.
Figura 3: Schema raffigurante la configurazione sperimentale per le misurazioni della fibra di carbonio. (Il disegno non è in scala). Due fibre di carbonio sono attaccate su una cella e la loro posizione è controllata da un posizionatore piezo. Il pacer viene utilizzato per la stimolazione elettrica del campo. I LED multicolore sono accoppiati nella porta dell'epifluorescenza del microscopio invertito per l'illuminazione delle cellule nel piano dell'oggetto. La potenza LED è controllata tramite una scatola di controllo dedicata, che riceve impulsi digitali tramite l'uscita digitale del convertitore digitale-analogico (DAC). L'elenco DAC comunica tramite uscita analogica con l'interfaccia del sistema a fluorescenza. Una fotocamera in bianco e nero (774 x 245 linee) per l'imaging cellulare è collegata al computer per monitorare la lunghezza del sarcomere e la piegatura in fibra di carbonio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Illuminazione a tempo
- Fornire luce per la microscopia a fluorescenza e l'attivazione dei canali ionici illuminati tramite una scatola di controllo LED personalizzata esterna, che comprende tre LED di colore diverso (460 nm, 525 nm, 640 nm, vedere Tabella dei materiali).
- Modificare il codice microcontrollore e il codice dell'interfaccia utente grafica (GUI) per la casella di controllo per consentire il controllo del LED tramite impulsi Cedro (TTL) esterni, generati in protocolli software di acquisizione dati (vedere Tabella dei materiali). Trasmettere impulsi TTL alla scatola di controllo LED tramite il convertitore digitale-analogico.
- Guidare il LED e scegliere il numero di impulsi tramite la GUI. Dopo aver ricevuto il comando dalla GUI il microcontrollore avvia un processo su un nuovo core. In questo processo l'ingresso TTL e un interruttore di controllo impostato dalla GUI verranno continuamente controllati.
- Quando l'ingresso TTL è positivo, il microcontrollore accende il LED e quindi riprende il controllo dell'ingresso TTL. Una volta che il segnale TTL torna a zero, il microcontrollore spegne il LED e riduce il numero di impulsi lasciati di uno. Se in qualsiasi momento l'interruttore di controllo è false o il numero di impulsi è zero, il microcontrollore interrompe questo processo fino a quando non viene ricevuto un nuovo comando dalla GUI.
- Accoppiare direttamente i LED nel backport del microscopio.
- Determinazione dell'intensità della luce nel piano dell'oggetto
- Misurare l'area illuminata con un micrometro dello stadio (ingrandimento obiettivo 40x, A - 0,8 mm2).
- Utilizzare un misuratore di potenza ottico (vedere Tabella dei materiali).
- Definire le impostazioni per gli esperimenti: lunghezza d'onda di eccitazione (525 nm), ingrandimento oggettivo (40x), filtro di eccitazione (530/20 nm) o specchio, e leggere la potenza della luce [W] a varie tensioni di ingresso a LED.
- Calcolare l'intensità della luce [W/mm2] dividendo la potenza della luce [W] per l'area illuminata [mm2] (qui: 0,8 mm2).
NOTA: Misurare la potenza effettiva della luce con i rispettivi protocolli nel passaggio 5.6 per verificare se le brevi durate degli impulsi di luce di 10 ms raggiungono e lunghe durate contengono il valore impostato (Figura supplementare 1).
- Preparazione per esperimenti di morsetto
- Preparare le seguenti soluzioni esterne ed interne (Tabella 4; per i requisiti idrici, vedere la tabella 1).
- Regolare l'osmolarità con glucosio a 300 x 5 mOsmol/L. Aliquot la soluzione interna e conservare a -20 gradi centigradi.
NOTA: Mantenere la soluzione interna sul ghiaccio per il giorno della registrazione. Mantenere la soluzione esterna a temperatura ambiente. Le soluzioni patch-clamp qui descritte erano basate su soluzioni utilizzate in precedenza e la concentrazione Cl- è stata modificata in livelli più bassi e più fisiologici7. Per la caratterizzazione della selettività ioculista del rispettivo attuatore optogenetico, suggeriamo di variare le concentrazioni di ioni maggiori (ad es., Cl-, Na,K,H) nelle soluzioni extra- e intracellulari19. - Togliere l'elettrodo di registrazione dal supporto pipetta e rimuovere lo strato di cloruro d'argento dal filo d'argento con carta vetrata molto fine.
NOTA: Eseguire questo passaggio all'inizio di ogni giorno di misurazione. - Collegare il filo al palo positivo di una batteria da 1,5 V e immergere in soluzione KCl 3 M per il rivestimento in cloruro d'argento per 10 minuti.
NOTA: Il palo negativo è collegato ad un filo d'argento di riferimento immerso nella soluzione 3 M KCl. - Preparare la camera di misura: mettere il grasso di silicio sul telaio della camera di misura e posizionare un coperchio (diametro: 50 mm, spessore n. 0) sulla parte superiore del telaio che la camera è sigillata.
- Mettere un elettrodo pellet argento/argento-cloruro di riferimento nella vasca da bagno e collegarlo con la fase della testa.
- Tirare 1,7 - 2,5 M' patch pipette da capillari di vetro di calce soda (diametro esterno: 1,55 mm, diametro interno: 1,15 mm) con un estrattore micropipette (vedi Tabella dei materiali).
- Avviare il software di acquisizione dati e regolare il test di membrana (impulso 10 mV per 15 ms, linea di base 0 mV).
| Soluzione bagno esterna | Soluzione pipetta interna | |
| NaCl [mM] | 140 | - |
| KCl [mM] | 5.4 | 11 |
| CaCl2 [mM] | 1 | - |
| MgCl2 [mM] | 2 | 2 |
| Glucosio [mM] | 10 | - |
| HEPES [mM] | 10 | 10 |
| K-Aspartate [mM] | - | 119 |
| Mg-ATP [mM] | - | 3 |
| EGTA [mM] | - | 10 |
| Ph | 7.4 (NaOH) | 7.2 (KOH) |
| Osmolarità (regola con glucosio) [mOsmol/L] | 300 x 5 | 300 x 5 |
Tabella 4: Soluzioni patch-clamp.
- Protocolli per le misurazioni dei morsetti
- Registrare il protocollo di fotoattivazione in modalità morsetto a V con un potenziale di mantenimento di -74 mV. Utilizzare impulsi di luce di 300 ms.
NOTA: Suggeriamo l'esecuzione di registrazioni a V-clamp vicino al potenziale della membrana a riposo del CM coltivato (stabilito in I-clamp; nelle nostre mani tra -79 mV e -77 mV sia per CM19trasmassato che non transdotto ). Le cellule appena isolate mostrano un potenziale di membrana a riposo medio di -79 mV(Figura supplementare 2, tutti i valori dopo la correzione per il potenziale di giunzione liquida). - Registrare AP in modalità i-clamp a 0 pA.
- Per il ritmo elettrico, iniettare impulsi di corrente di 10 ms (rampda da 0 pA al valore impostato entro 10 ms), 0,25 Hz e trovare la soglia per far entrare AP. Record AP con iniezioni correnti del 50% in più rispetto alla soglia.
- Per la stimolazione ottica utilizzare impulsi di luce di 10 ms, 0,25 Hz alla minima intensità di luce per suscitare AP affidabile.
- Registrare la fotoinia in modalità I-clamp a 0 pA. Elicit AP come descritto al punto 5.6.2.1 e applicare la luce sostenuta per 64 s a 4 mW/mm2 dopo 15 AP attivati elettricamente.
NOTA: La figura 6F mostra un protocollo di fotoinibizione in cui durante le iniezioni di corrente più elevata sostenuta vengono applicate. A partire da 1,5 volte la soglia (qui: 0,7 nA) la corrente iniettata è stata aumentata nei passi di 0,1 nA (livello finale: 2,2 nA). A tutti gli amplitudini di corrente testati, l'applicazione di luce sostenuta ha inibito la generazione di AP.- Come esperimento di controllo, mettere in pausa la stimolazione elettrica per 64 s senza applicazione luminosa.
- Registrare il protocollo di fotoattivazione in modalità morsetto a V con un potenziale di mantenimento di -74 mV. Utilizzare impulsi di luce di 300 ms.
- Esperimenti di patch-clamp
NOTA: eseguire i seguenti esperimenti al buio (la luce rossa può essere utilizzata per gli strumenti attivati a luce blu/verde).- Posizionare il coperchio con le celle nella camera di misura con soluzione esterna e selezionare CM fluorescente.
NOTA: le celle eGFP-positive possono essere rilevate utilizzando un LED blu (460 nm) in combinazione con un filtro di eccitazione a bande (450 nm - 490 nm), un mirror dichroic di 510 nm e un filtro di emissione long-pass di 515 nm. Se si utilizzano altri tag fluorescenti, utilizzare i set di filtri LED e a fluorescenza corrispondenti. Se si ottiene un'elevata efficienza di trasduzione (nelle nostre mani >99% con l'adenovirus GtACR1), non è necessario controllare la fluorescenza eGFP prima degli esperimenti funzionali; in questo modo si evita una potenziale pre-attivazione di GtACR1. - Riempire la patch pipetta con soluzione interna. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella punta.
- Attaccare la pipetta al supporto della pipetta, inserendo il filo d'argento rivestito in argento nella soluzione interna.
- Dopo aver raggiunto la configurazione collegata alla cella, passare alla modalità intera cella nel software di acquisizione dati con un potenziale di mantenimento di -74 mV. Rompere la membrana applicando delicatamente una pressione negativa per accedere alla configurazione dell'intera cella. Ciò è indicato da un aumento immediato della capacità misurata.
- Eseguire i protocolli descritti nella sezione 5.6.
- Posizionare il coperchio con le celle nella camera di misura con soluzione esterna e selezionare CM fluorescente.
- Tecnica della fibra di carbonio
- Produrre fibre di carbonio.
- Utilizzare i capillari di vetro con i seguenti parametri: diametro esterno: 2,0 mm, diametro interno: 1,16 mm, lunghezza: 100 mm (vedere Tabella dei materiali). Utilizzando un tiratore di micropipette, tirare il vetro capillare in due pipette della stessa lunghezza (lunghezza media totale 11 mm, Figura 5) fino ad un diametro interno finale di 30 m.
NOTA: le impostazioni utilizzate per il primo e il secondo tiro sono rispettivamente dell'85,2% (proporzione alla potenza massima dell'estraente) e del 49,0% (dipenderà rispettivamente dall'puller, dal tipo e dall'età del filamento). - Piegare le pipette fino a 45 gradi con una micro forgia autofatta utilizzando le impostazioni di 12 V, 24 A (vedere la figura 4 per i dettagli della configurazione di piegatura pipetta).
- Allineare il capillare (2) sulla linea rossa nel cerchio di orientamento (5), mantenere il posizionamento della costante capillare in modo che la lunghezza della parte di piegatura sia sempre la stessa dopo il centro del cerchio di orientamento (raggio di 4,5 mm).
- Piegare il capillare fino a 45 gradi (linea verde) spingendo verso il basso la punta del capillare con la bender (3) e forgiare riscaldando il filamento (4) fino a quando il capillare cattura l'angolo di 45 gradi anche dopo la rimozione del bender.
- Montare le fibre di carbonio (fornite dal prof. Utilizzare pinze sottili con tubi morbidi alla fine per aumentare la presa e diminuire il rischio di danneggiare le fibre.
NOTA: Queste fibre sono caratterizzate da microstrutture, che aumentano la superficie di contatto tra fibre e cellule, migliorando così l'adesione20. - Tagliare le fibre di carbonio ad una lunghezza di 2 mm e utilizzare super colla (cianoacrylato) per fissare la fibra alla sezione anteriore del capillare.
NOTA: più a lungo sono le fibre, più si piegano sull'applicazione della stessa forza.
- Utilizzare i capillari di vetro con i seguenti parametri: diametro esterno: 2,0 mm, diametro interno: 1,16 mm, lunghezza: 100 mm (vedere Tabella dei materiali). Utilizzando un tiratore di micropipette, tirare il vetro capillare in due pipette della stessa lunghezza (lunghezza media totale 11 mm, Figura 5) fino ad un diametro interno finale di 30 m.
- Calibrare le fibre di carbonio.
- Calibrare le fibre di carbonio utilizzando un trasduttore di forza con una sensibilità di 0,05 mN/V e un intervallo di forza da 0 a 0,5 mN (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Questa configurazione è fatta su misura per misurare la compressione invece di "tirare". - Fissare il capillare con la fibra di carbonio a un supporto che è controllato da un micromanipolatore e un motore piezo.
- Mettere la punta della fibra a contatto con il sensore di forza, ma senza produrre alcuna forza e spostare il motore del piezolo in gradini di 10 m (movimento totale di 60 m) verso il sensore e leggere la tensione misurata (E) in Volt.
NOTA: Assicurarsi che il trasduttore di forza sia contattato dalla punta stessa dell'estremità libera della fibra di carbonio. - Ripetere queste misurazioni tre volte.
- Utilizzare la Formula 1 per calcolare la forza per ogni posizione piezo
(differenza di tensione misurata tra i gradini del motore piezo):
NOTA: La sensibilità del trasduttore di forza dipende dal modello del trasduttore (in questo: 0,05 mN/V - 50 n/V). Il guadagno può essere impostato sul controller. - Tracciare la forza contro la posizione del piezo. La pendenza corrisponde alla rigidità della fibra [N/M].
- Calibrare le fibre di carbonio utilizzando un trasduttore di forza con una sensibilità di 0,05 mN/V e un intervallo di forza da 0 a 0,5 mN (vedere Tabella dei materiali).
- Forza record di contrarre CM.
NOTA: eseguire i seguenti esperimenti al buio (la luce rossa può essere utilizzata per gli strumenti attivati a luce blu/verde).- Rivestire la superficie della camera di misura con poli-HEMA. Riempire la camera di misura con soluzione bagno esterna e mettere alcune gocce della sospensione cellulare coltivata nella camera (passaggio 4.9).
- Attaccare i capillari con fibre di carbonio al micromanipolatore palco. Selezionare GtACR1-esprimendo CM controllando la capacità di indurre contrazioni mediante l'applicazione di brevi impulsi di luce verde. Allineare le fibre di carbonio quasi orizzontalmente alla superficie della camera di misurazione.
- Abbassare la prima fibra sulla superficie cellulare. Fissare la seconda fibra parallela alla prima fibra all'altra estremità del CM. L'allineamento ideale è quasi perpendicolare all'asse cellulare.
NOTA: Attaccare la fibra spingendo delicatamente la cella verso la superficie inferiore. Rilasciare la pressione prima di attaccare la seconda fibra. Non allungare la cella collegando la seconda fibra. - Dopo che entrambe le fibre sono attaccate sulla cella, sollevare le fibre, in modo che la cella non ha alcun contatto con la superficie della camera più ed è in grado di contrarsi senza alcun attrito.
- Concentrare i sarcomeres nel software di acquisizione dei dati (vedere Tabella dei materiali) e impostare la finestra di tracciamento della lunghezza del sarcomere ( Figura7AI (3)) tra le fibre.
NOTA: Lo spettro di potenza FFT risultante (Figura 7AI (2)) mostra idealmente un picco acuto, che rappresenta la lunghezza media del sarcomere. - Tracciare la piegatura della fibra utilizzando il modulo di rilevamento dei bordi. Impostare le aree di rilevamento con la finestra rossa e verde e definire una soglia (linea orizzontale rossa e verde) in corrispondenza della prima derivata della traccia di intensità luminosa (Figura 7A III).
- Iniziare a ritmo ottico la cella a 0,25 Hz (se possibile, provare velocità di stimolazione più veloci) e monitorare la lunghezza del sarcomere e la piegatura della fibra.
NOTA: La posizione del supporto della fibra, il grilletto LED e gli impulsi di stimolazione elettrica sono controllati tramite il software di acquisizione dei dati (vedere Tabella dei materiali). - Dopo aver registrato almeno 15 contrazioni ottiche, stimolare il campo elettricamente (vedi Tabella dei materiali). Trova la soglia per suscitare contrazioni e registra applicando 1,5 volte della tensione di soglia.
- Per il protocollo di inibizione, applicare stimoli elettrici per suscitare contrazioni e quindi esporre alla luce sostenuta di 64 s (a varie intensità di luce).
- Produrre fibre di carbonio.
(differenza di tensione misurata tra i gradini del motore piezo):
Figura 4: Impostazione della piegatura Pipette. (1) Il micromanipolatore sul lato sinistro viene utilizzato per controllare la posizione del capillare, e un secondo micromanipolatore a destra viene utilizzato per piegarlo. (2) Capillare. (3) Bender. (4) Microforgie. (5) Cerchio di orientamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Pipette con fibra di carbonio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
6. Analisi dei dati
-
Registrazioni patch-clamp
NOTA: Correggere tutte le tensioni registrate e di comando per il potenziale di giunzione del liquido dopo l'esperimento. Determinare il potenziale di giunzione del liquido nel software di acquisizione dei dati utilizzando il calcolatore potenziale di giunzione degli utensili (per le soluzioni patch-clamp indicate nella tabella 4: 14,4 mV a 21 gradi centigradi). Sottrarre il potenziale di giunzione del liquido dalla tensione registrata/comando.- Per le registrazioni AP I-clamp, controllare il ritmo elettrico rispetto al ritmo ottico. Calcolare la durata AP (APD) al 20 e al 90% di ripolarizzazione con uno script personalizzato (Supplemental Material). Determinare il potenziale della membrana a riposo e l'ampiezza dell'AP.
NOTA: Determinare l'APD come descritto in Wang K. et al.21 Lo script per caricare i file .abf è generalmente accessibile tramite il seguente link: https://de.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/22114-fcollman-abfload. Valori APD medi per almeno 6 AP. - Per la fotoattivazione del morsetto a V, verificare se la linea di base è a 0 pA. Se non regolare la linea di base a zero. Analizzare la corrente registrata attivata da impulsi di luce da 300 ms a -74 mV. Trasferire i dati al software di analisi dei dati e determinare il picco e la corrente stazionaria media.
- Per le registrazioni AP I-clamp, controllare il ritmo elettrico rispetto al ritmo ottico. Calcolare la durata AP (APD) al 20 e al 90% di ripolarizzazione con uno script personalizzato (Supplemental Material). Determinare il potenziale della membrana a riposo e l'ampiezza dell'AP.
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Esperimenti sulla fibra di carbonio
- Registrazioni di contrazione durante il ritmo ottico: caricare i dati registrati nel software di acquisizione dei dati e leggere la linea di base e la massima della flessione della fibra di carbonio e le variazioni di lunghezza del sarcomere.
NOTA: valori medi per 10 contrazioni di una registrazione stabile. - Misurare la larghezza della cella e calcolare l'area della sezione trasversale della cella assumendo una sezione ellittica (Figura 7B II).
NOTA: La formula per l'area di un'ellisse è A , dove a è la distanza dal centro al vertice e b è la distanza dal centro al covertex. Nel nostro caso questo significa un s (larghezza della cella)/2 e b (spessore della cella)/2. Secondo Nishimura et al.22 lo spessore di CM può essere stimato come un terzo della larghezza della cella in modo che A (1/2) - larghezza (1/2) - spessore (1/4) - larghezza (1/3) - larghezza (1/12) - larghezza2. - Calcolare la forza end-systolic (F):
- Calcolare la deformazione delle cellule end-systolic (ESD):
NOTA: Ulteriori parametri contrattili possono essere analizzati: lunghezza del sarcomere a riposo, tempo per picco, tempo di rilassamento 90%, accorciamento sarcomere frazionario, velocità massima di contrazione e rilassamento (vedi manuale di acquisizione del software).
- Registrazioni di contrazione durante il ritmo ottico: caricare i dati registrati nel software di acquisizione dei dati e leggere la linea di base e la massima della flessione della fibra di carbonio e le variazioni di lunghezza del sarcomere.
Representative Results
GtACR1-eGFP è stato espresso in CM di coniglio coltivato(Figura 6 inserto) e le fotocorrenti sono state misurate con la tecnica patch-clamp. La fotoattivazione di GtACR1 mostra grandi correnti rivolte verso l'interno a -74 mV. Nella Figura 6Una corrente di picco (IP) a 4 mW/mm2 è 245 pA. AP sono stati attivati elettricamente (Figura 6B) o otticamente (Figura 6C) con iniezioni di corrente 1,5 volte la soglia, o brevi impulsi di luce depolarizzazione di 10 ms, rispettivamente. Analizzando i valori APD, il CM ritmo elettrico mostra un APD 20 di 0,24 x 0,08 s e un APD 90 di 0,75 x 0,17 s, che la CM a ritmo ottico mostra un APD 20 di 0,31 s e un APD 90 di 0,81 x 0,19 s (SE, n , n, N , 2, nell'esempio qui presentato APD 20elettrico - 0,17 s; APD 20ottiche - 0,27 s e APD 90elettrico - 0,61 s; APD 90ottico : 0,68 s; Figura 6D). Il CM dal ritmo ottico mostra un'insorgenza AP più lenta (Figura 6D). L'attivazione cm è stata inibita al momento dell'illuminazione sostenuta (per 64 s, 4 mW/mm2) polarizzando il potenziale della membrana verso il potenziale di inversione del cloruro, qui -58 mV (Figura 6E). Iniezioni di corrente superiore a 1,5 volte la soglia non suscitano la generazione di AP(Figura 6F). Le forze di picco generate sono state determinate dalla piegatura della fibra di carbonio (Figura 7B,C,E). Il CM ha generato 232 n/mm2 sulla stimolazione elettrica (Figura 7B) e 261 N/mm2 dopo la stimolazione ottica (Figura 7C). Gli impulsi a luce verde prolungati inibiscono le contrazioni (Figura 7E). A seguito di inibizione ottica per 64 s, contrazioni ricorrenti generano una minore forza contrattile, e i valori di forza recuperare verso la linea di base dopo 10 contrazioni di 10 dollari (pacing a 0,25 Hz, Figura 7D) in linea con la perdita di calcio diastolico da CM coniglio.
Figura 6: Registrazioni rappresentative dei cernidi di patch-clamp elettricamente e otticamente ritmo/inibito CM. (A) Fotocorrente rappresentativa a -74 mV con un impulso luminoso di 300 ms, 4 mW/mm2. IP indica la corrente di picco. L'inserto mostra una cella positiva GtACR1-eGFP. (B) Registrazione AP rappresentativa a 0 pA utilizzando una rampa corrente di 10 ms, 0,6 rcA per ritmo elettrico della registrazione CM. (C) Representative AP a 0 pA utilizzando impulsi di luce di 10 ms, 0,4 mW/mm2. (D) Il grafico superiore mostra la sovrapposizione del10th AP di CM. Il grafico inferiore mostra la differenza del potenziale di membrana tra AP otticamente ed elettricamente attivato (Eottico-ElettricoE). (E) Gli AP attivati elettricamente sono stati inibiti sotto una luce sostenuta di 64 s, 4 mW/mm2. (F) Gli AP sono inibiti da iniezioni di corrente più elevate superiori a 1,5 volte la soglia (da 0,7 nA nei gradini da 0,1 nA a 2,2 nA) sotto la luce sostenuta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Dati rappresentativi delle registrazioni in fibra di carbonio della CM otticamente ed elettricamente ritmo/inibito. (A) Visualizzazione nel software di acquisizione dati. L'immagine (I) mostra il CM misurato con la finestra per il calcolo della lunghezza del sarcomere. La larghezza della cella è etichettata in arancione. (1) Gamma di frequenze pertinenti. (2) Lo spettro di potenza FFT mostra la frequenza della spaziatura dei sarcomeri sulla cella. La lunghezza media dei sarcomeri è calcolata dalla frequenza di picco. (3) Finestra di tracciamento della lunghezza di Sarcomere. (4) Traccia di intensità. (5) La traccia di intensità moltiplicata per una finestra Hamming è la traccia di intensità finestrata. Schema (II) mostra la sezione trasversale ellittica della cella. Larghezza in arancione e spessore in blu tratteggiato. Immagine (III) mostra la posizione delle fibre di carbonio con le rispettive caselle di rilevamento, sinistra in rosso e destra in verde. (6) Traccia di intensità. (7) Primo derivato della traccia di intensità (vedi manuale del software di acquisizione dei dati). (B)Traccia rappresentativa delle contrazioni suscitate elettricamente. Il pannello (I) mostra l'accorciamento della lunghezza del sarcomere, il pannello (II) la distanza tra le due fibre di carbonio. (C) Traccia rappresentativa delle contrazioni otticamente suscitate (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2). Il pannello (I) mostra l'accorciamento della lunghezza del sarcomere, il pannello (II) la distanza tra le due fibre di carbonio. (D) La forza massima generata dalla contrazione 1 all'11 dopo una pausa causata dall'inibizione della generazione di AP. (E) Traccia rappresentativa dell'inibizione ottica delle contrazioni sotto un'illuminazione sostenuta (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). Il pannello (I) mostra l'accorciamento della lunghezza del sarcomere, il pannello (II) la lunghezza tra le due fibre di carbonio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Un | Zona |
| Acr | anione channelrhodopsin |
| Ap | potenziale d'azione |
| Apd | azione durata potenziale |
| Cfu | colonia unità di formazione |
| Chr | channelrhodopsin |
| Cm | cardiomiocito |
| eGFP | proteina fluorescente verde potenziata |
| Esd | fine deformazione delle cellule sistoliche |
| Ue | unità endotossina |
| F | Forza |
| Fft | trasformazione veloce Disintonzante |
| GtACR | Guillardia theta anion channelrhodopsin |
| Gui | interfaccia utente grafica |
| I-clamp | corrente-clamp |
| Ui | unità internazionali |
| Moi | molteplicità di infezioni |
| poli-HEMA | poli(2-idrossitotica) |
| Morsetto a V | morsetto di tensione |
Tabella 5: Elenco delle abbreviazioni.
Figura supplementare 1: Misurazioni dell'intensità della luce con misuratore di potenza ottica. (A) Misurazione di impulsi di luce da 10 ms a 4 mW/mm2. (B) Misurazione dell'illuminazione sostenuta di 64 s a 4 mW/mm2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 2: Proprietà del CM appena isolato e loro adattamento strutturale nella cultura. (A) Registrazione AP di un CM appena isolato (APD 20 di 1,11 x 0,34 s, APD 90 di 1,96 x 0,32 s, n , N Potenziale di membrana a riposo medio di -79,3 x 0,8 mV (n - 7, N - 2). (B) Registrazione in fibra di carbonio di una CM appena isolata elettricamente. (C) Immagini confocali di un CM (I) appena isolato; intradusse (II) e transdotti (III) CM dopo 48 ore di coltura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Materiale supplementare: script MatLab per determinare APD e potenziale di membrana a riposo. Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussion
Mentre gli strumenti optogenetici consentono la modulazione dell'elettrofisiologia delle cellule eccitabili in modo non invasivo, hanno bisogno di una caratterizzazione completa in diversi tipi di cellule (ad esempio, CM) per consentire di scegliere il miglior strumento disponibile per un progetto sperimentale specifico. La tecnica patch-clamp è un metodo standard per valutare l'elettrofisiologia cellulare. Nella configurazione dell'intera cellula, permette di registrare correnti foto-attivate attraverso la membrana plasmatica o cambiamenti temporali nella tensione della membrana a seguito di stimolazione/inibizione della luce. La manipolazione optogenetica dell'eccitazione elettrica influisce anche sulle contrazioni CM. Utilizziamo il tracciamento dei sarcomeri e le misurazioni della forza assistita da fibra di carbonio per quantificare gli effetti dell'interrogatorio ottico sull'attività meccanica dei miociti.
Descriviamo un protocollo per caratterizzare gli effetti di base di un canale di cloruro protetto, GtACR1, in CM. Come sistema modello, abbiamo scelto il coniglio CM, poiché le loro caratteristiche elettrofisiologiche (ad esempio, la forma AP e il periodo refrattario) assomigliano a quelle osservate nella CM umana più da vicino rispetto al roditore CM. Inoltre, il coniglio CM può essere coltivato per diversi giorni, abbastanza a lungo per la consegna adenovirale e l'espressione di GtACR1-eGFP. In particolare, CM isolato cambiare le loro proprietà strutturali nella coltura nel corso del tempo, tra cui l'arrotondamento delle terminazioni cellulari e la graduale perdita di striatura incrociata, sistema T-tubaree e caveolae23,24. In linea con questo, sono state segnalate alterazioni funzionali nella CM coltivata: depolarizzazione del potenziale della membrana a riposo, prolungamento dell'AP e cambiamenti nella manipolazione cellulare Ca2. Per la revisione degli adattamenti cellulari nella cultura, vedere Louch etal. Figura supplementare 2 Mostra esempi AP e misurazioni di contrazione di CM appena isolato per il confronto con quelli osservati in CM coltivato (Figura 6, Figura 7) utilizzando il protocollo qui presentato.
Le registrazioni dei morsetti a celle intere consentono misurazioni dirette delle proprietà fotocorrenti (ad esempio, ampiezze e cinetiche) e di cambiamenti indotti dalla luce nel potenziale della membrana o nelle caratteristiche di AP ad alta risoluzione temporale. Tuttavia, tali registrazioni hanno diverse limitazioni: in primo luogo, il citosol viene sostituito dalla soluzione pipetta nelle registrazioni intere cellulari, che è vantaggiosa per controllare i gradienti elettrochimici ionici, ma ha lo svantaggio intrinseco di lavare gli organelli cellulari, le proteine e altri composti, influenzando così potenzialmente le risposte elettriche cellulari. In secondo luogo, gli effetti collaterali come l'attivazione di canali ionici aggiuntivi derivanti da depolarizzazione non fisiologicamente lunga (ad esempio, le costanti temporali lente dei canali ionici con porte di luce) sono difficili da valutare in quanto il nostro metodo consente solo di rilevare i cambiamenti nell'APD, ma non di condurre misurazioni dirette delle concentrazioni ioniche nei compartimenti cellulari elettrofisiologicamente rilevanti. Questo potrebbe essere fatto con indicatori fluorescenti (ad esempio, sensori Ca 2 opiù selettivi) o elettrodi ioni-selettivi. Un'ulteriore caratterizzazione può includere titrazioni dell'intensità della luce, determinazione della dipendenza da pH, cinetica fotocorrente a diversi potenziali di membrana e cinetica di recupero durante la stimolazione della luce ripetitiva.
A differenza delle registrazioni patch-clamp, le misurazioni della forza cellulare consentono l'analisi delle contrazioni cellulari di miociti intatti senza influenzare il loro ambiente intracellulare. Gli effetti secondari sulle concentrazioni di ioni (ad es., Ca2 )possono essere valutati indirettamente determinando l'ampiezza e la dinamica della forza generata (ad esempio, la massima velocità di contrazione e rilassamento; qui non analizzata). Le misurazioni della forza con la tecnica della fibra di carbonio hanno un vantaggio rispetto alle cellule che contraggono liberamente in quanto forniscono informazioni dirette sulle forze passive e attive nelle celle precaricate (cioè in condizioni più simili alle impostazioni in situ o in vivo). Il precaricamento meccanico è particolarmente importante quando si analizza la contrattilità cellulare, in quanto stretch colpisce la produzione di forza e il rilassamento26,27.
Gli approcci optogenetici consentono una manipolazione spatiotemporale del potenziale della membrana cellulare, sia nel singolo CM che nel tessuto cardiaco intatto. Classicamente, ChR2, un canale non selettivo di cation alla luce, è stato utilizzato per la depolarizzazione del potenziale della membrana, mentre sono state utilizzate pompe protoniche e/o cloruro guidate dalla luce per l'iperpolarizzazione della membrana. Entrambi i gruppi di attuatori optogenetici richiedono alti livelli di espressione, poiché ChR2 è caratterizzato da una conduttanza a canale singolo intrinsecamente bassa28 e pompe a guida leggera trasportano al massimo uno ione per fotone assorbito. Inoltre, l'attivazione prolungata di ChR2 in CM può portare al sovraccarico diNa e/o Ca2, e le pompe a guida leggera possono cambiare le pendenze trans-sarcolemmalH o Cl- 29,30. Alla ricerca di strumenti alternativi per il controllo optogenetico dell'attività CM, abbiamo recentemente testato la channelrhodopsin GtACR1 ad anione naturale, caratterizzata da una conduttanza a canale singolo superiore e da una maggiore sensibilità alla luce rispetto alla cation ChR come ChR2. Abbiamo scoperto che l'attivazione di GtACR1 depolarizza CM e può essere utilizzata per il ritmo ottico e l'inibizione, a seconda della tempistica e della durata dell'impulso luminoso. Un ulteriore vantaggio dell'utilizzo di ACR al posto di cation ChR potrebbe essere il potenziale di inversione più negativo di Cl- rispetto a Na,riducendo artificialmente le correnti ioniche. Come abbiamo già dimostrato, il ritmo ottico con GtACR1 può portare al prolungamento di AP a causa della componente lenta della chiusura del canale GtACR1, che potrebbe essere superata utilizzando mutanti GtACR1 più veloci19. Tuttavia, il prolungamento di AP è molto meno pronunciato quando si utilizza una concentrazione inferiore, più fisiologica intracellulare Cl(vedere Figura 6). Inoltre, l'inibizione mediata da GtACR1 dall'illuminazione prolungata provoca una profonda depolarizzazione della membrana, che potrebbe nuovamente attivare l'afflusso secondario diNa e Ca2, alterando così l'attività dei canali legati alla tensione. Nelle nostre misurazioni, troviamo che i parametri AP e contrazione recuperano alla linea di base entro 40 s dopo un'inibizione indotta dalla luce per 1 min (vedi Kopton et al. 2018, Figura 6, Figura 7). Icanali Light-gated K offrono una potente alternativa per mettere a tacere cm senza influenzare il potenziale della membrana a riposo CM31.
In futuro vorremmo confrontare quantitativamente diversi strumenti optogenetici per il loro potenziale di inibire l'attività cardiaca. A tal fine, testiamo una varietà di canali ionici con problemi di luce, tra cui ACR, ChR2 e varianti ChR in rosso32, così come attuatori iperpolarizzanti come halorhodopsin o la luce gated adenyl ciclosie bPAC in combinazione con il canale di potassio SthK (PAC-K)31.
Il protocollo qui presentato può essere utilizzato per una caratterizzazione approfondita delle proprietà elettromeccaniche di CM. È principalmente applicabile anche a CM di altre specie, e alla CM isolata dal miocardio malato. La stimolazione ottica consente di ritmo CM a frequenze diverse, e diversi precarichi possono essere testati durante gli esperimenti di contrazione della fibra di carbonio. Un esperimento interessante potrebbe essere quello di utilizzare l'illuminazione a bassa intensità per la depolarizzazione subsoglia, per imitare un graduale aumento del potenziale della membrana a riposo, come si può osservare durante lo sviluppo del rimodellamento del tessuto cardiaco durante la progressione della malattia. Infine, le misurazioni funzionali potrebbero essere combinate con l'imaging Ca2 per ulteriori informazioni sull'accoppiamento eccitazione-contrazione o con interventi farmacologici per valutare gli effetti di diversi farmaci sull'attività CM.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Stefanie Perez-Feliz per l'eccellente assistenza tecnica, Dr. Jonas Wietek (Humboldt-University, Berlino, Germania) per la fornitura del pLAsmide pUC57-GtACR1, il Prof. Il progetto è stato finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Borsa di studio Emmy-Noether: SCHN1486/2-1) e il CER Advanced Grant CardioNECT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment - Cell isolation/Culturing/Transduction | |||
| Adeno-X Adenoviral System 3 CMV | TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA | ||
| Aortic cannula | Radnoti | 4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm | |
| Coverslips ø 16 mm, Thickness No. 0 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0151 | Borosilicate Glass |
| Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm | Samuel Findings, London, UK | TSGBL3 | |
| Incubator | New Brunswick, Eppendorf, Schönenbuch, Switzerland | Galaxy 170S | |
| Langendorff-perfusion set-up | Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbläserei, Freiburg, Germany | Custom-made | |
| Langendorff-pump | Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Zürich, Switzerland | ISM444 | |
| Mesh: Nylon Monodur filter cloth | Cadisch Precision Meshes Ltd | 800 µm holes, 1 m wide | |
| Neubauer chamber | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 717806 | |
| Rabbit, New Zealand White | Charles River | Strain Code: 052 | |
| Scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BC774R | Bauchdeckenschere ger. 18cm |
| Sterile filter, 0.22 µm | Merck, Darmstadt, Germany | SLGP033RB | |
| Equipment - Patch-clamp | |||
| Amplfier | AxonInstruments, Union City, CA, United States | Axopatch 200B | |
| Coverslip ø 50 mm, Thickness No. 1 | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 631-0178 | Borosilicate Glass |
| Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, San José, CA, United States | 1550A | |
| Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | BZ:00 |
| Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
| Headstage | AxonInstruments, Union City, CA, United States | CV203BU | |
| Interface | Scientifica, Uckfield, UK | 1U Rack, 352036 | |
| LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
| LED control software | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
| LED control system | custom-made | ||
| Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PP-830 | |
| Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
| Motorised Micromanipulator | Scientifica, Uckfield, UK | PatchStar | |
| Optical power meter | Thorlabs, Newton, NJ, United States | PM100D | |
| Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
| Silver wire | A-M Systems, Sequim, WA, United States | 787500 | Silver, Bare 0.015'', Coated 0.0190'', Length 25 Feet |
| Soda lime glass capillaries | Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark | 160213 BRIS, ISO12772 | 1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm |
| Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
| Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
| Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
| Equipment - Carbon fiber | |||
| Carbon fibers | provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec | BZ:00 | |
| Digitizer Axon Digidata | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States | 1550B | |
| Filter (530/20) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513878 | |
| Filter (630/20) | Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States | 227155 | |
| Fluorescence System Interface | IonOptix, Milton, MA United States | FSI-800 | 2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm |
| Force Transducer System | Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada | 406A | |
| Glass capillaries for force measurements | Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States | GC200F-10 | |
| Interface National Instruments | National Instruments, Budapest, Hungary | BNC-2110 | |
| LED 525 nm | Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States | PT-120-G | |
| LED control box | Essel Research and Development, Toronto, Canada | ||
| LED control system | custom-made | ||
| Microcontroller | Parallax Inc., Rocklin, California, United States | Propeller | |
| Micropipette Puller | Narishige Co., Tokyo, Japan | PC-10 | |
| Microscope inverted | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI4000B | |
| MyoCam-S camera | IonOptix, Dublin, Ireland | ||
| MyoCam-S camera Power | IonOptix, Milton, MA, United States | MCS-100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States | MYP100 | |
| Piezo Motor | Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | E-501.00 | |
| Silicone Grease | RS Components, Corby, UK | 494-124 | |
| Software Axon pClamp | Molecular Devices, San José, CA, United States | Version 10.5 | |
| Software IonWizard | IonOptix, Dublin, Ireland | Version 6.6.10.125 | |
| Software MatLab2017 | The MathWorks, Inc. | ||
| Stage micrometer | Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK | 1 mm | |
| Chemicals | |||
| Adenosine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9251-100G | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A7030-50G | |
| CaCl2 | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 21114-1L | |
| L-Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C9500-25G | |
| Collagenase type 2, 315 U/mg | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS004177 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C0780-50G | |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | C1768-100MG | |
| EGTA | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3054.3 | |
| Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL | Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany | PZN-07829486 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | F9665 | |
| Gentamycin 50 mg/mL | Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA | 15750-037 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | G7021-1KG | |
| Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | PZN-03029843 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | H3375-1KG | |
| Insulin (bovine pancreas) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | I6634-50MG | |
| K-aspartate | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A6558-25G | |
| KCl | VWR International GmbH, Leuven, Belgium | 26764.260 | 1 mg/mL |
| KOH | Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA | 35113-1L | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | L2020-1MG | |
| M199-Medium | Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States | M4530 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | A9187-1G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 63069-500ML | |
| NaCl | Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK | 10428420 | |
| NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-Lösung 0.9% | Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 3200950 | |
| NaOH | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A6579 | without Ca2+/Mg2+ |
| Na-pyruvat | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P2256-100MG | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | D1408-500ML | |
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma, Poole, UK | 192066 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | P5147-1G | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | T0625-500G | |
| Thiopental Inresa 0.5 g | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany | PZN-11852249 | |
| Xylazine hydrochloride, Rompun 2% | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN-01320422 |
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