Draadloze elektrofysiologische opname van neuronen door beweegbare Tetrodes in vrij zwem vissen
Summary
Een nieuwe draadloze techniek voor het opnemen van extracellulaire neurale signalen uit de hersenen van vrij zwemmen goudvis wordt gepresenteerd. Het opnameapparaat bestaat uit twee tetrodes, een Microdrive, een neurale datalogger en een waterdichte behuizing. Alle onderdelen zijn op maat gemaakt, met uitzondering van de datalogger en de connector.
Abstract
De neurale mechanismen voor het gedrag van vissen blijven grotendeels onbekend, hoewel vissen de meerderheid van alle gewervelde dieren vormen. De mogelijkheid om hersenactiviteit van vrij bewegende vis op te nemen, zou het onderzoek naar de neurale basis van het visgedrag aanzienlijk vooruit brengen. Bovendien is nauwkeurige controle van de opnamelocatie in de hersenen van cruciaal belang voor het bestuderen van gecoördineerde neurale activiteit tussen regio’s in de hersenen van de vis. Hier presenteren we een techniek die draadloos registreert vanuit de hersenen van het vrij zwemmen van vis tijdens het beheersen van de diepte van de opnamelocatie. Het systeem is gebaseerd op een neurale logger die is gekoppeld aan een nieuw water-compatibel implantaat dat de opnamelocatie kan aanpassen door Microdrive-gestuurde tetrodes. De mogelijkheden van het systeem worden geïllustreerd door opnames van de telencephalon van Goldfish.
Introduction
Vissen zijn de grootste en meest diverse groep gewervelde dieren, en net als andere gewervelde dieren vertonen ze complexe cognitieve vaardigheden zoals navigeren, socialiseren, slapen, jagen, enz. Niettemin, de neurale mechanismen voor het gedrag van de vis blijven voor het grootste deel onbekend.
In de afgelopen decennia zijn extracellulaire opnames van geïmmobiliseerde vis voornamelijk geïmplementeerd om verschillende aspecten van de neurale basis van gedrag1,2teonderzoeken. Hoewel deze techniek geschikt is voor sommige sensorische systemen, is onderzoek naar het volledige spectrum van de neurale basis van gedrag moeilijk, zo niet onmogelijk in geïmmobiliseerde dieren. De eerste vooruitgang betrof het opnemen van de Mauthner-cellen van de tethered-zwemvis3,4. Echter, Mauthner cellen zijn onevenredig groot en de opgenomen actie potentiële amplituden, die kan gaan zo hoog als een paar mV, vergemakkelijken opname. Later, Canfield et al. beschreef een proof of concept bij het gebruik van een tethered dier om op te nemen van de telencephalon van vis5. Een andere recente techniek voor het opnemen van neurale activiteit van vis is calcium beeldvorming (Zie beoordelingen door Orger en de Polavieja6, en Vanwalleghem et al.7). Deze techniek is ontwikkeld voor gebruik met zebravis larven omdat de huid en de schedel transparant zijn tijdens de larvale fase. Deze techniek kan echter niet worden gebruikt om complexe gedragingen in latere ontwikkelingsstadia te bestuderen.
Hier presenteren we een nieuwe techniek voor het opnemen van extracellulaire neurale activiteit uit de hersenen van vrij zwemmen van vissen. Dit is een gewijzigde versie van het protocol zoals beschreven in Vinepinsky et al.8. De belangrijkste innovatie is de toevoeging van een Microdrive die het mogelijk maakt om de positie van de elektroden na de operatie te controleren. De techniek is ontworpen voor opname van de telencephalon van goudvis met behulp van een set van tetrodes die zijn aangesloten op een neurale datalogger via een Microdrive. De hele Setup is draadloos en verankerd aan de schedel van de vis. Het specifieke gewicht van het systeem wordt gelijkgesteld met het waterspecifieke gewicht door een kleine vlotter toe te voegen waarmee de vis vrij kan zwemmen.
De techniek is gebaseerd op het gebruik van een neurale datalogger die het signaal versterkt, digitaliseert en opslaat in een ingebouwd geheugenapparaat. De logger telemetrie systeem wordt gebruikt om te starten en stoppen van de opnames, en voor de synchronisatie met de videocamera. In dit protocol wordt een 16-kanaals neurale logger gebruikt, ingebed in een waterdichte doos samen met de Microdrive.
De Microdrive-assemblage is vervaardigd uit twee hoofdcomponenten: de Microdrive zelf en de Microdrive-behuizing (Figuur 1A, B). De behuizing houdt de Microdrive en de tetrodes, en fungeert ook als het anker tussen de schedel en de logger box (Figuur 1C). De PVC logger doos is vervaardigd met behulp van een machine proces en wordt verzegeld met behulp van een O-ring (Figuur 1E-G, zie ook aanvullende figuur 1, aanvullende figuur 2, en aanvullende figuur 3 voor een driedimensionaal [3D] diagram). Aan de ene kant is een stukje piepschuim bevestigd aan de logger box om het gewicht van het implantaat te compenseren en de vis te voorzien van een drijf-neutraal implantaat. De constructie van de in het protocol beschreven Microdrive volgt de door Vandecasteele et al.9 gepresenteerde procedure met een wijziging om de micro schijf aan de behuizing te bevestigen (Figuur 1a). Alle belangrijke stappen worden gepresenteerd.
De procedure beschreven in het Protocol ter voorbereiding van de schedel van de vis is vergelijkbaar met die in Vinepinsky et al.8 en wordt kort beschreven in het protocol. Een dag na de operatie, de vis zijn normaal volledig hersteld van de effecten van anesthesie en zijn klaar voor de gedrags experimenten. Merk op dat de Tetrode-locatie kan worden aangepast door de Microdrive-schroef te draaien. De schroef heeft een tussenruimte van 300 μm per volledige rotatie en een vooruitgang van 75 μm wordt aanbevolen totdat de doellocatie van de hersenen is bereikt. Een geschikte hersen Atlas moet worden geraadpleegd om het specifieke hersengebied te targeten dat van belang is. Het is raadzaam om de elektrode impedantie te testen elke keer dat de vis wordt verdotiseerd voor vervanging van de batterij of geheugenkaart.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol Details van de stappen die betrokken zijn bij het implanteren van een Tetrode array in de telencephalon van vrij zwemmen goudvis. Deze techniek implementeert een neurale logger die versterkt en registreert de signalen verkregen van maximaal 16 kanalen samen met een Microdrive die de positie van de Tetrode in de hersenen aanpassen. De Microdrive maakt het mogelijk om de positie in de hersenen aan te passen om de opname te optimaliseren.
Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar Nachum Ulanovsky en de leden van het Ulanovsky Lab voor al hun hulp. Daarnaast zijn we heel blij met tal Novoplansky-Tzur voor nuttige technische assistentie. We erkennen de financiële steun van het ISRAËLISCH SCIENCE FOUNDATION-FIRST-programma (Grant nr. 281/15) en de Helmsley liefdadigheids Trust via het landbouw-, biologisch-en cognitief robotica-initiatief van de Ben-Gurion Universiteit van de Negev.
Materials
| 0.7 mm round drill bits | Compatible with the drill. | ||
| 15-blade Scalpel | Sigma-Aldrich | ||
| 16 channel PCB board | Neurlynx | EIB-16 | |
| 1X3M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 1X3M phillips round head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 27 cm X 19 cm X 1 mm brass plate | See Figure 2 | ||
| 2X6M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 3140 RTV coating | Dow Crowning | 2767996 | |
| 75 µm Silver wire | A-M Systems | ||
| Brass machine screws #00-90 | 947-1006 | ||
| Brass plates 7.5mm X 2.5mm X 0.6mm | A 3D drawing is provided. See supplementary 1 | ||
| Coated Tungsten wire 25µm | California Fine Wire Company | 5000160 | Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000) |
| Coated Tungsten wire 50µm | A-M Systems | 795500 | Can be replaced with any other wire with low impedance |
| Cyanoacrilic glue | |||
| Dental Burnisher | ComDent UK | Any small sterille stainless-still tool will do. | |
| Dental cement – GCFujiPLUS | GC | 431011 | Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other. |
| Dental drill or nail polish drill | Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement. | ||
| Drill bit #65 | 947-65 | ||
| Fast curing epoxy | Any 5 minutes curing epoxy can be used here. | ||
| Logger box with O-ring sealing | A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger. | ||
| Motorized turning device | Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means. | ||
| Mouselog-16 Neural logger | Deuteron Technologies Ltd | There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam | |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% |
| Nano-Z plating | White Matter LLC | The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics. | |
| PCB pins | Neurlynx | Neuralynx EIB Pins | |
| Polymide tubing 250µm | A-M Systems | 822000 | |
| Rechargable battery | 3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time. | ||
| Silicone tubing 0.64 mm | A-M Systems | 806100 | |
| Stainless steel 1.5 mm | A-M Systems | 846000 | |
| Sudium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Tap #00-90 | 947-1301 | ||
| Vaseline | Any type of soft petroleum skin protectant can be used here. |
References
- Jacobson, M., Gaze, R. M. Types of visual response from single units in the optic tectum and optic nerve of the goldfish. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 49 (2), 199-209 (1964).
- Ben-Tov, M., Donchin, O., Ben-Shahar, O., Segev, R. Pop-out in visual search of moving targets in the archer fish. Nature Communications. 6, 6476 (2015).
- Zottoli, S. J. Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).
- Canfield, J. G., Rose, G. J. Activation of Mauthner neurons during prey capture. Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. Journal of Neuroscience Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Vanwalleghem, G. C., Ahrens, M. B., Scott, E. K. Integrative whole-brain neuroscience in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 50, 136-145 (2018).
- Vinepinsky, E., Donchin, O., Segev, R. Wireless electrophysiology of the brain of freely swimming goldfish. Journal of Neuroscience Methods. 278, 76-86 (2017).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3568 (2012).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators A: Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Arcot Desai, S., Rolston, J. D., Guo, L., Potter, S. M. Improving impedance of implantable microwire multi-electrode arrays by ultrasonic electroplating of durable platinum black. Frontiers in Neuroengineering. 3, 5 (2010).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network: Computation in Neural Systems. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Teixeira, F. B., Freitas, P., Pessoa, L. M., Campos, R. L., Ricardo, M. Evaluation of IEEE 802.11 underwater networks operating at 700 MHz, 2.4 GHz and 5 GHz. Proceedings of the 10th International Conference on Underwater Networks & Systems. , (2015).
- Sendra, S., Lloret, J., Rodrigues, J. J., Aguiar, J. M. Underwater wireless communications in freshwater at 2.4 GHz. IEEE Communications Letters. 17 (9), 1794-1797 (2013).
- Lloret, J., Sendra, S., Ardid, M., Rodrigues, J. J. Underwater wireless sensor communications in the 2.4 GHz ISM frequency band. Sensors. 12 (4), 4237-4264 (2012).
- Hoogerwerf, A. C., Wise, K. D. A three-dimensional microelectrode array for chronic neural recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 41 (12), 1136-1146 (1994).
- Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165 (2016).
