Summary
טכניקה אלחוטית הרומן עבור הקלטת אותות עצביים מן המוח של שחייה בחופשיות הזהב מוצג. המכשיר מורכב משני tetrodes, מיקרודרייב, לוגר מידע עצבי, ומקרה עמיד למים. כל החלקים מותאמים אישית למעט לוגר הנתונים והמחבר שלו.
Abstract
המנגנונים העצביים השולטים בהתנהגות הדג אינם ידועים בעיקר, אך הדגים מהווים את רוב החוליות. היכולת להקליט את פעילות המוח מדגים הנעים בחופשיות יקדם מחקר על בסיס עצבי של התנהגות הדג באופן משמעותי. יתרה מזאת, שליטה מדויקת במיקום ההקלטה במוח היא קריטית ללימוד פעילות עצבית מתואמת על פני אזורים במוח הדגים. כאן, אנו מציגים טכניקה הרושמת באופן אלחוטי מהמוח של דגים שוחים בחופשיות תוך שליטה על עומק מיקום ההקלטה. המערכת מבוססת על לוגר עצבי הקשורים השתל תואם מים הרומן שיכול להתאים את מיקום ההקלטה על ידי מיקרודרייב מבוקרת tetrodes. יכולות המערכת מומחשות באמצעות הקלטות מתוך הטלנצאלון של דג הזהב.
Introduction
דגים הם הקבוצה הגדולה והמגוונת ביותר של בעלי חוליות, וכמו בעלי חוליות אחרים הם מציגים יכולות קוגניטיביות מורכבות כגון ניווט, החברה, שינה, ציד ועוד. למרות זאת, המנגנונים העצביים השולטים בהתנהגות הדג נשארים לרוב לא ידועים.
בעשורים האחרונים, הקלטות ממומשות מ-"מוטפיש" בוצעו בעיקר כדי לחקור היבטים שונים של הבסיס העצבי של התנהגות1,2. למרות שטכניקה זו מתאימה לכמה מערכות חישה, החקירה של הספקטרום המלא של התנהגות עצבית היא קשה אם לא בלתי אפשרי לקיבוע בעלי חיים. ההתקדמות הראשונה מעורבת הקלטה מתאי ארגמן של דג שחייה קשור3,4. עם זאת, תאים מאותנר הם גדולים באופן לא פרופורציונלי ופעולה מוקלטת הפוטנציאל המוני, אשר יכול ללכת גבוה כמו כמה mV, להקל על ההקלטה. מאוחר יותר, Canfield ואח ' תיאר הוכחת רעיון בעת שימוש בחיה קשורה להקליט מתוך הטלנצאלון של הדג5. טכניקה נוספת שנעשתה לאחרונה עבור הקלטת פעילות עצבית מן הדגים הוא הדמיה סידן (ראה ביקורות של Orger ו de Polavieja6, ו Vanwalleghem ואח '7). טכניקה זו פותחה לשימוש עם הזחלים דג זברה כי העור והגולגולת הם שקופים בשלב זחל. עם זאת, לא ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ללמוד התנהגויות מורכבות בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח.
כאן, אנו מציגים טכניקה הרומן עבור הקלטת פעילות עצבית מן המוחות של דגים שוחה בחופשיות. זוהי גירסה ששונתה של הפרוטוקול המתואר ב-Vinepinsky et al.8. החדשנות העיקרית היא תוספת של מיקרודרייב שמאפשר לשלוט על מיקום האלקטרודות לאחר הניתוח. הטכניקה מיועדת להקלטה מתוך הטלנצאלון של דגי זהב באמצעות מערכת של tetrodes המחוברים לוגר מידע עצבי באמצעות מיקרודרייב. כל ההתקנה היא אלחוטית מעוגנת הגולגולת של הדג. המשקל הסגולי של המערכת מוחודש למשקל הספציפי למים על ידי הוספת מצוף קטן המאפשר לדגים לשחות בחופשיות.
הטכניקה מבוססת על השימוש לוגר מידע עצבי המעלה, digitizes, ומאחסן את האות בהתקן זיכרון על הסיפון. מערכת הטלמטריה לאוגר משמשת להפעלה ולעצירה של ההקלטות, ולסנכרון עם מצלמת הווידיאו. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש באוגר עצבי בן 16 ערוצים, המוטבע בתוך תיבה עם המיקרו-כונן.
מכלול המיקרו-כונן מפוברק משני מרכיבים עיקריים: המיקרו-כונן עצמו ומגורי המיקרו-כונן (איור 1א, ב). הדיור מחזיק במיקרו-כונן ובטטרודס, ומשמש גם כעוגן בין הגולגולת לבין תיבת האוגר (איור 1ג). התיבה לאוגר PVC מפוברק באמצעות תהליך מכונה והיא אטומה באמצעות O-ring (איור 1E-G, ראה גם איור משלים 1, איור משלים 2, ואיור משלים 3 עבור דיאגרמה תלת ממדית [3d]). בקצה אחד, פיסת קלקר מחוברת לתיבת האוגר כדי לפצות על המשקל של השתל ולספק את הדג עם שתל לציפה נייטרלי. בניית המיקרו-כונן המתואר בפרוטוקול מלווה את ההליך המוצג על ידי ואנדאקסטיל ואח '9 עם שינוי לחיבור המיקרו-כונן לדיור (איור 1א). כל השלבים העיקריים מוצגים.
ההליך המתואר בפרוטוקול להכין את גולגולת הדג דומה לזה שהוצגו ב Vinepinsky et al.8 והוא מתואר בקצרה בפרוטוקול. יום אחד לאחר הניתוח, הדג בדרך כלל התאושש באופן מלא מן ההשפעות של הרדמה והם מוכנים ניסויים התנהגותיים. שים לב כי ניתן לכוונן את מיקום ה-tetrode על-ידי הפיכת בורג המיקרו-כונן. בורג יש מרווח של 300 יקרומטר לסיבוב מלא וקידום 75 יקרומטר מומלץ עד מיקום המוח היעד הוא הגיע. אטלס המוח המתאים צריך להתייעץ כדי למקד את אזור המוח הספציפי של עניין. מומלץ לבדוק את העכבה אלקטרודה בכל פעם הדג מורדם עבור סוללה או החלפת כרטיס זיכרון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי הניתוח חייבים להיות מאושרים על ידי ועדות האתיקה המקומית על רווחת בעלי חיים (למשל, IACUC).
1. בניית מבנה המיקרו-כוננים
- כדי לבנות את הדיור, לחתוך צלחת 1 מ"מ פליז רחב לתוך לוחית 19 מ"מ x 1 מ"מ באמצעות מסור. חותכים שני חריצים 5.5 מ"מ על כל הצדדים הארוכים בניצב לקצה, כך שכל חתך הוא 6.5 מ"מ מהצדדים הצרים (איור 2א).
- באמצעות צבת, לקפל את האזור בין החריצים על הצדדים הארוכים פנימה, ואז לקפל את החלק התחתון פנימה ואת הצד העליון החוצה כדי להשיג את הדיור (איור 2ב, ג).
- באמצעות מקדחה 3 מ"מ, לעשות חורים עבור ברגים בדיור microdrive.
הערה: חורים אלה ישמשו מאוחר יותר כדי לחבר את הדיור לתיבת לוגר (איור 2ד). - . הלחמה בצידי הבתים
- באמצעות קובץ עגול משובח, ליצור קטן, 1.5 מ"מ ברדיוס, חצי עגול בתחתית הדיור (איור 2E).
הערה: זה יהיה בשימוש מאוחר יותר כדי להכניס את צינור נירוסטה כדי להנחות את האלקטרודות. - השתמש מקדחה 1 מ"מ לעשות חור בחלק האחורי של הדיור עבור tetrodes (איור 2F).
הערה: דגם תלת-ממד של הדיור נמצא בקובץ הדיור המשלים של. stl
2. בניית המיקרודרייב
- באמצעות חותך, לשבור פיסת שלושה פינים מרצועת כותרת בודדת של סיכה זכר (איור 1H). באמצעות צבת, להוציא את הסיכה האמצעית.
- באמצעות חותך, לחתוך את הפינים הנותרים 10 מ"מ באורך (2 מ"מ פחות מאורך בורג). אפשרות נוספת היא להשתמש בבורג ארוך יותר (ראה שלב 2.4).
- קדוח חור באמצעות ה#65 מקדחה דרך חור הפין האמצעי. מקדחה פתיל באמצעות ברז 00-99.
- הכנס את המיקרו-כונן ואת לוחות פליז (7.5 מ"מ x 2.5 mm x 0.6 מ"מ, ראה משלימים איור 4) כך לוחיות הפליז נוגעות פינים. הכנס בורג (#00-90 הראש עגול, 12 מ"מ, פליז) דרך צלחת פליז הראשון, ולאחר מכן דרך חוט הכותרת הסיכה ואת צלחת הפליז השני. לבסוף, הניחו אגוז על הבורג והדקו בעדינות את המיקרו-כונן המורכב.
- הלחמה סיכות יחד עם צלחות פליז, ואת האגוז עם קצה הבורג.
- הלחמה microdrive לתוך הדיור microdrive בארבע נקודות על הצדדים של צלחות פליז microdrive.
- גזור אחד צינור נירוסטה 6 מ"מ ארוך עם קוטר פנימי של 1.5 מ"מ ועוד צינור פלדת אל-חלד 3 מ"מ ארוך עם קוטר פנימי של 1.2 מ"מ. פולנית את קצות הצינורות כדי למנוע קצוות חדים.
- הדבק את הצינור 6 מ"מ ארוך לחתוך חצי עיגול בתחתית הדיור microdrive באמצעות אפוקסי. הדבק את 3 מ"מ נירוסטה ארוך הכותרת העליונה, בשורה עם צינור 6 מ"מ ארוך על הדיור.
- גזור שני 5 ס מ שפופרת סיליקון ארוך מקטעים עם קוטר של 0.64 מ"מ ואחד 5 ס מ שפופרת ארוכה פוליאימיד עם קוטר של 0.250 מ"מ.
- הכנס את שלושת הצינורות לתוך שני צינורות נירוסטה. הדבק את הצינורות לצינור נירוסטה מחובר לכותרת הסיכה באמצעות דבק ציאנואקרילי. לעזאזל המיקרו כונן כל הדרך למעלה ולחתוך את הצינורות עודף מהחלק העליון והתחתון של שני צינורות פלדה.
הערה: המיקרו-כונן עם הדיור מוכן כעת לשימוש (איור 1ג).
3. הכנת מערך הטטרוידה
- כדי להמציא שתל שני tetrode עם ארבע אלקטרודות על כל tetrode, להכין שמונה חוטים, כל 12 ס"מ ארוך, formvar מבודדים, מתוך 25 יקרומטר קוטר טונגסטן תיל.
הערה: אותו עיצוב יכול להכיל ארבעה טטרודס. - מניחים מחזיק ללוח ממשק האלקטרודה 16 ערוצים (EIB-16) PCB (ראה טבלת חומרים) מתחת למיקרוסקופ.
- באמצעות טוויצר משופעת רך ומצית, להסיר את הציפוי של כל אחד משמונת החוטים בצד אחד באמצעות הלהבה.
הערה: זה כדי להבטיח כי התיל יהיה מחובר כראוי למחבר PCB בהמשך. - לדחוף חוט לתוך אחד החורים של EIB-16 עם הצד המצופה בחור. מניחים סיכה ולוחצים אותו באמצעות צבת. בדוק את הקישוריות על-ידי מדידת ההתנגדות בין הסיכה לבין הצד הבלתי מצופה של התיל.
הערה: ההתנגדות היא בסדר. של עשרות מואמים - חזור על שלב 3.4 עם כל שמונת החוטים.
- קלטת שתי קבוצות של ארבעה חוטים יחד באמצעות נייר דבק בסוף כל חוט.
הערה: כל קבוצה תהיה מודבקת ביחד מאוחר יותר כדי ליצור tetrode. - חותכים חתיכה אחת של חוט טונגסטן 12 ס"מ אורך עם קוטר של 50 יקרומטר. חבר אותו לאחד מחיבורי EIB-16.
הערה: התיל הזה ישמש. כאלקטרודות התייחסות - חותכים שני חוטים כסף חשופים 12 ס"מ אורך עם קוטר של 75 יקרומטר שישמש עילה עבור לוגר ההקלטה. הלחמה שני חוטים לחיבור הקרקע ב EIB-16.
- להחזיק את EIB-16 מעל מכשיר מפנה ממונע ולמקם את הסרט הדביק קצה של קבוצה אחת של ארבעה חוטים על המכשיר כוונון מוטורי. החל 130 סיבובים בכיוון השעון ולאחריו 20 סיבובים נגד כיוון השעון. החלת דבק ציאנואקרילי. כדי לכסות את הטטרגד
- . חכה שהדבק ירפא . תחתוך את הטטרודה קרוב לסרט הדביק
- חזור על שלבים 3.9 ו-3.10 עם ה-tetrode השני.
הערה: זה מייצר את מערך 2-tetrode המוגמר (איור 1ד).
4. הרכבת השתל
- . לעזאזל עם המיקרו-כונן כל הדרך למטה
- שימוש 1 x 3M פיליפס עגול ברגים הראש, לצרף את EIB-16 לצלחת PVC.
- באמצעות פינצטה לסוף רך, למשוך את כל החוטים וחוטי דרך החור בחלק הקדמי של מכסה תיבת לוגר.
- השימוש בברגים עם הראש השטוח של 2 x 6M, מחבר את צלחת ה-PVC למכסה התיבה. השאר את מחבר EIB-16 בכיוון הנכון כך שניתן יהיה להרכיב את הרשם ב-EIB-16. ודא ש-EIB-16 קבוע במקום כדי להימנע מפריטים בתנועה באות שהוקלט.
- אטום את החוטים לתיבה באמצעות אפוקסי. החל מעט ככל האפשר מכיוון שהאיטום הראשוני ייעשה על-ידי טמפרטורת החדר (RTV) בהמשך.
- חברו את מגורי המיקרו-כוננים לכיסוי התיבה באמצעות ברגים בשני מ"מ.
- הפתיל tetrodes וכל החוטים דרך החור בחלק האחורי של הדיור microdrive. הפתיל tetrodes דרך שני צינורות סיליקון במיקרו כונן. פתיל 50 יקרומטר חוט טונגסטן דרך צינור פוליאימיד במיקרו כונן.
- הדבק את tetrodes וחוטים לצינורות שלהם על ידי החלת דבק ציאנואקריל לקצה העליון של צינורות, כדי להבטיח את התנועה תואמת את המיקרו-כונן. לעזאזל עם המיקרו-כונן. כל הדרך עד לפסגה
- החל נפט רך (ראה טבלת חומרים) על tetrode חשוף וחוטים בתוך מגורי microdrive כדי למנוע תנועה.
- חותכים בחלון התחתון של 12 מ"מ x 14.5 מילימטר צלחת פטרי באמצעות להב תער מחומם. הצמד את החלון לקדמת מגורי המיקרו-כונן עם אפוקסי. . השאר את חוטי הקרקע מחוץ לחלון
- החל ציפוי RTV לבין החוטים החשופים וחוטי החשמל בין מכסה התיבה לאוגר לבין מגורי המיקרו-כונן.
- לאחר הטיפול ב-RTV, סגור את התיבה במשקל קטן בפנים, וטבול במים בלילה כדי להבטיח שאין דליפת מים בתוך הקופסה.
- חותכים את tetrodes ואת חוט התייחסות לאורך הרצוי באמצעות מספריים חדים.
- הצמד את קצף הבלטת מסומן (ראה טבלת חומרים) לתיבה. כוונן את גודלה כך שציפה שלו תהיה מאוזנת כאשר הוא מתחת למים באמבט.
- טובלים את הטיפים tetrode בפתרון שחור פלטינה ולהשתמש בזרם ישיר (-0.2 μA) כדי לחלוק את האלקטרודות ולהגדיר את העכבה של אלקטרודות כרצונך. השתמש בבודק עכבה רב-אלקטרודה (ראה טבלת חומרים) לציפוי ומדידות עכבה.
הערה: ב הפליום של דג הזהב, ערך של 40 kOhm הוא הטוב ביותר. בהתאם ליישום, העכבה אלקטרודה יכול להיות מותאם על ידי שינוי ציפוי פלטינה שחור10,11.
5. הכנה הרדמה-1% MS-222 מניות פתרון
זהירות: הכנה הרדמה כוללת את השימוש אבקת MS-222, מסרטן. מכאן, צעדים 5.2 ו 5.3 חייב להיעשות במכסה כימי באמצעות כפפות.
- הוסף 100 mL של מים לצינור שיכול להכיל יותר מ 100 mL.
- בשכונה כימית, הניחו צלחת חד פעמית בקנה מידה. מוסיפים 1 גר' אבקת MS-222 באמצעות מרית, ולאחר מכן להוסיף את האבקה לצינור.
- . נענע היטב את הצינור
הערה: בצורה נוזלית, MS-222 ניתן להשתמש מחוץ למכסה המנוע הכימי לובש כפפות אבל לא דורש מסכה. - מניחים צלחת שקלול חד פעמי בקנה מידה. הוסף 2 גרם של נתרן ביקרבונט באמצעות מרית, ולאחר מכן להוסיף את האבקה לצינור. . נענע היטב את הצינור
6. הכנת גולגולת הדג
הערה: בשלב זה, הדג מוכן לניתוח השתל. לפני הניתוח, ודא כי כל הרכיבים והאספקה כבר מעוקר על ידי ההליכים המתאימים. עבור שלב זה, מחזיק מתוך מים בצורת הדגים יש צורך. בפרוטוקול זה, מחזיק אלומיניום המתאים לראש של 15 ס מ לזנב דג זהב ארוך משמש. מערכת זו מחזיקה את הדג מחוץ למים בזמן שהיא משרה את הזימים במים מחמצן. לפרטים ראו Vinepinsky et al.8.
- מניחים את הדג ב 0.02% MS-222 מרחץ מים עבור 20 דקות עד הדגים ישנים.
- באמצעות כפפות סטרילי, להוציא את הדג מהמים ולמקם אותו במחזיק.
הערה: המים החמצן מכילים את הדגים מכיל MS-222 בריכוז של 0.02%, כך הדג נשאר מורדם במהלך הניתוח. - באמצעות מרית סטרילית, להחיל לידוקאין 5% להדביק על העור מעל המקום המיועד לניתוח עבור 10 דקות, ולאחר מכן להסיר את הלידוקאין.
הערה: התייעץ עם אטלס המוח המתאים. למקד את אזור המוח המסוים - באמצעות אזמל סכין סטרילי 15, להסיר את העור מעל הגולגולת באזור של השתל.
- באמצעות מקדחה שיניים עם מקדחה 0.7 mm חתיכות, לקדוח 4 חורים בגולגולת. הכנס בורג מילימטר אחד (3 מ"מ אורך) לתוך כל חור ולהחיל דבק ציאנואקרילי על החורים ממש לפני הכנסת הבורג.
- באמצעות שיניים בורשר, להחיל מלט שיניים על הברגים ועל הפריפריה של הגולגולת חשוף.
- באמצעות מקדחה שיניים, לעשות חור קוטר 5 מ"מ בגולגולת מעל אזור המוח של עניין. הסירו את רקמת השומן בין הגולגולת למוח וחשפו את היעד של אזור המוח בעזרת מלקחיים עדינים ונייר טישו רך. להיזהר לא לפגוע כלי הדם הגדולים מתחת לגולגולת.
הערה: עד סוף השלב הזה, הדג מוכן להשתיל את הגשוש. רק השלבים העיקריים הספציפיים לפרוטוקול זה מתוארים כאן. מספר הליכים שלאחר הניתוח (כגון תיעוד מפורט על בריאות בעלי החיים ועיקור של כלים ושטחים של כירורגיה) אינם מוצגים או דנים משום שהם חלים על כל הניתוחים עם דגים או בעלי חיים קטנים.
7. שתילת המקדח
הערה: כדי להשלים את השלב האחרון בפרוטוקול, מניפולטור שיכול להחזיק את השתל במקום בזמן שהוא מוכנס למוח נדרש.
- השתמש מניפולטור כדי להחזיק את מכסה תיבת לוגר עם tetrodes הצבעה לכיוון המוח דגים.
- לכופף את האלקטרודה ההפניה כך כאשר הטטרדות מונטים לתוך המוח, ההפניה נשארת מחוץ למוח.
- . לחתוך את השטח שיתאים לגולגולת באופן אופציונלי, לחבר חוט הקרקע אחד לאחד ברגים הגולגולת.
- הנמך את השתל כך האלקטרודות מוכנסים לתוך המוח בעוד החלק התחתון של הדיור microdrive הוא ליד הגולגולת.
- התחילו לחבר את השתל לגולגולת על ידי החלת כמות קטנה של מלט שיניים בין הדיור לבין בורג הגולגולת הקרוב ביותר.
- לאחר החלק הראשון של מלט שיניים הוא נרפא, להחיל מלט שיניים ולסגור את החור מעל הגולגולת ואת הגולגולת החשופה כולה.
הערה: בדרך כלל מספר סבבים של יישומים בצמנט שיניים נחוצים על מנת לכסות את כל הגולגולת החשופה. - התקן את הרשם ואת הסוללה בתיבה וחתום את התיבה עם כל הברגים.
- החלת אנטיביוטיקה ומשככי כאבים מקומיים בהתאם לסוג הדג המשמש לניסויים.
- שוטפים את הזימים של הדג במים מתוקים עד שהדג מתחיל להתעורר. להסיר את הדג מהמאחז ולמקם אותו במיכל הבית שלו.
הערה: הדג הוא התאושש באופן מלא בתוך 60 דקות לאחר הניתוח. - ודא כי הדג מסוגל לשחות בחופשיות עם השתל (איור 3, וידאו משלים 1). במקרה הצורך, הזינו בדיוק את גודל הקלקר שמעל לתיבת האוגר, כך שהדגים יוכלו לאזן בקלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במהלך הקלטה הקליט דג הזהב בחופשיות במיכל המים המרובע, ואילו הפעילות העצבית בטלנצהאלון נרשמה. המטרה של ניסויים אלה הייתה ללמוד כיצד הפעילות העצבית של תאים בודדים קובעת את התנהגותו של הדג. כדי לעשות זאת, פעילות העולה צריך להיות מזוהה בנתונים המוקלט. פעילות המוח, בעת ההקלטה, היתה מוקלטת ב-31,250 Hz ו-high-pass מסוננים ב 300 הרץ על ידי לוגר הנתונים. לאחר מכן, במצב לא מקוון, מסנן העברת רצועות (300-5000 Hz) הוחל על האותות, והנתונים הגולמיים הממוינים הופרדו לערוצים של tetrode ולערוץ הייחוס (איור 4א). לאחר מכן, מיון משותף של דקר שימשו לאפיון פעילות תא בודדת. ראשית, כל ערוץ סונן באופן ידני על ידי הסף המינימלי של משרעת היתד (ביחס לרמות הרעש של כל ערוץ). אז, בגלל הטיפים של tetrodes לא באותו אתר, ואת האלקטרודה התייחסות היה מחוץ למוח, קוצים שהופיעו יותר מאשר tetrodes אחד או בערוץ הייחוס גם סוננו. הנתונים המסוננים מקובצים באופן ידני וסוננו לפי צורה, אורך, מרווח בין-ספייק (הזמן שבין פוטנציאל הפעולה העוקב חייב לדבוק בתקופה הקשה של הנוירונים), ועל-ידי ניתוח רכיבים ראשיים (PCA). דוגמאות לאשכולות תאים בודדים לעומת אשכולות מרובים ומנוכי רעש מוצגים באיור 4.
איור 1: הרכבת שתל. (א) microdrive, עשוי כותרת סיכה, צלחות פליז, ובורג. (ב) מיקרודרייב מגורים, עשוי מצלחת פליז אחת על ידי קיפול. (ג) מכלול מיקרו-כונן שנעשה עם המיקרודרייב (A) והשיכון (ב). (ד) מערך ה-tetrode נעשה באמצעות eib-16, שני משטחים, אלקטרודה התייחסות, ועילה המחוברת למחבר (ראו טבלת חומרים). (ה) ו-(ו) ההרכבה השתל של microdrive מחוברת למכסה התיבה לאוגר עמיד למים. מחבר ההרכבה של tetrode ממוקם בתוך התיבה והטטרודס מודבקים למיקרו-כונן. (G) תיבת לוגר בסיס שבו ממוקמים הרשם והסוללה. טבעת O מסביב לבסיס משמש לאיטום. (ח) שורה אחת כותרות עליונות של פינים זכריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקרודרייב מתקפלים שיטת הדיור. (א) התחל בצלחת פליז ברוחב 1 מ"מ והפוך ארבעה חריצים. (ב) לקפל את החלק האמצעי של הצד פנימה. (ג) מקפלים את החלק העליון לאחור ואת החלק התחתון פנימה. (ד) מקדחה שלושה 3 מילימטר חורים בחלק העליון. (ה) נקבר בחצי מילימטר בתחתית. (ו) קדח חור אחד באמצע של הצד העליון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הקלטה מדגי זהב מתנהגים בחופשיות. (א) הטטרודס מושתל במוח הדגים וההרכבה מחוברת לגולגולת הדג. (ב) הקופסא אטומה עם הרשם בפנים. (C-E) דג שוחה בחופשיות עם האסיפה לאחר הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מייצגות. (א) הקלטה0.5 s זמן רב מדגים שוחה בחופשיות 24 שעות לאחר הניתוח. האות מסונן באמצעות מסנן פס-מעבר (300-10000 Hz). אין רעש משרעת גבוהה באלקטרודה התייחסות, המציינת חוסר חפצים בתנועה. אין פוטנציאל לפעולה בטטרוידה השנייה (ערוצים ירוקים). נתוני האלקטרודות הראשונים מוצגים בערוצים החומים. כוכבים כחול אדום מצביעים על קוצים מאשכולות כחול ואדום המוצג פאנלים B ו-C, בהתאמה. (ב) ספייק צורות של שני אשכולות שונים של נוירונים בודדים, הקליט מתוך tetrode 1. (ג) הקרנה על שלושת המרכיבים העיקריים של הנתונים מהטטרדה הראשונה של כל מועמדים ספייק שחצו את הסף. אשכולות כחולים ואדומים מתאימים לצורות של דקר כחול ואדום מלוח B. נקודות אפורות מייצגות רעש עצבי או פעילות מרובת יחידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו משלים 1: דפוסי שחייה: דוגמה של דגי זהב ביום לפני ניתוח השרשה (משמאל) ויום אחרי (מימין). וידאו מראה דפוסי שחייה דומים, המציין כי הדג לא מופרעת על ידי ניתוח. מהירות וידאו היא x 1.8. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
איור משלים 1: תרשים החדר הראשי של תיבת לוגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 2: תרשים מכסה התיבה לאוגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 3: תרשים המכסה הקאמרי של EIB-16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 4: תרשים לוחית הפליז המשמשת למיקרו-כונן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: דיאגרמת דיור. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הכרוכים בנטיעת מערך מעטפת לתוך הטלנצאלון של דגי זהב שוחים בחופשיות. טכניקה זו מיישמת לוגר עצבי כי מגביר ומתעד את האותות שנרכשו של עד 16 ערוצים יחד עם מיקרודרייב שיכול להתאים את המיקום tetrode במוח. המיקרו-כונן מאפשר לכוונן את המיקום במוח כדי למטב את ההקלטה.
פרוטוקול זה יכול בקלות להיות שונה עבור הקלטה מאזורים אחרים במוח (ראה Vinepinsky et al.8 עבור הקלטה של tectum אופטי באמצעות טכניקה דומה) או כל חיה ימית אחרת 15 ס מ ארוך או גדול (כ שווה לראש דג זהב לזנב, ~ 100 גרם משקל). בנוסף, ניתן לשנות את הפרוטוקול לעבודה עם לוגר מידע כל עוד הוא מתקשר בתדר שיכול לחדור למים. הרשם המשמש כאן מתקשר באמצעות תדר רדיו של 900 MHz והוא יכול לתקשר באמצעות כ -20 ס מ מים. תדר רדיו של 2.4 GHz יכול גם לחדור דרך ~ 15 ס מ של מים מתוקים. תדרים נמוכים יותר וחלופות אחרות עשויות להביא תוצאות טובות יותר13,14,15. הפרוטוקול המוצג כאן השתמש במערך דו-טטרודה עם שמונה ערוצי הקלטה. בנוסף, הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי לשלב בדיקת גיאומטריות אחרות כגון מערך התיל16 או בדיקה סיליקון9.
ישנם מספר יתרונות כדי להשתמש לוגר נתונים על מערכת הקלטה מלאה טלמטריה או מערכת קשורה. ראשית, תקשורת אלחוטית מוסיפה רעש להקלטה. לפיכך, שידור מלא של הנתונים יקטין את איכות האות. בנוסף, רישום הנתונים מבטיח שלא יאבדו נתונים אם התקשורת נכשלת. יתרה מזאת, מערכות אלחוטיות מאפשרות לדגים לשחות בחופשיות, בניגוד לבעלי חיים קשור. לבסוף, פרוטוקול זה פותח כדי להקליט פוטנציאל פעולה, אך ניתן להשתמש בו גם כדי להקליט את פוטנציאל השדה המקומי על-ידי הגדרת מסנן המעבר האנלוגי של לוגר ל-1 Hz במקום 300 Hz. חיסרון אחד של הרשם הוא הצורך להוריד פיזית את הנתונים ולהחליף את הסוללה כאשר הוא מופעל.
המיקרו-כונן המוצע בפרוטוקול מגביר באופן משמעותי את הסבירות להקלטה של פעילות תא בודדת. ללא התקן microdrive, tetrodes מושתל ממוקמים בערך באותו אתר הקלטה במוח למשך כל הזמן את הדג נבדק. זה מגביל פיזית את הסבירות להקליט מספר נוירונים בודדים מאותו דג, ולכן מכורטים את התשואה ההקלטה לכל דג. העובדה כי אתר ההקלטה הספציפי במוח נשאר לא ידוע עד לאחר הניתוח מחזק את הצורך במכשיר מטלטלין המאפשר להעביר את האלקטרודות במוח לאחר קיבוע גם.
תכונה חשובה של פרוטוקול זה שהושמט לבהירות היא קביעת עכבה האלקטרודה. עכבה האלקטרודה יכול להיות מותאם על ידי הבחירה של קוטר התיל (כלומר, קוטר גבוה יותר מוביל עכבה נמוכה), חוט הרכב (g., טונגסטן או nichrome), וציפוי אלקטרודה (g., פלטינה שחור עבור טונגסטן וזהב עבור nichrome) אשר מניב חוטים עם קטרים נמוכים ועכבה נמוכה. מכיוון שכל הפרמטרים הללו הם קריטיים להצלחת ההקלטות הנוירואליות, הקורא מומלץ מאוד להתייעץ עם הספרות הנרחבת בנושא זה, כולל האריס ואח '17.
שים לב לחשיבות האלקטרודה ההפניה בזיהוי מקורות רעש חיצוניים אפשריים במערכת. אלקטרודה ההתייחסות היא העכבה נמוכה יחסית, כי הוא מוכנס לתוך הגולגולת אבל הוא מחוץ למוח. מכיוון שהוא אינו בא במגע עם רקמת המוח, הוא מתעד את חתימת האות, המורכבת מרעש תרמי, מחפצי תנועה ומרעש חיצוני. מקורות הרעש העיקריים במערכת זו הם מקור התנועה ורעשי התקשורת שניתן לשלוט בהם ולתזמן אותם באמצעות הרשם. רעשים אלה יכולים בקלות להתגלות על ידי החתימה שהם לכפות על האות של האלקטרודה ההפניה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו אסירי תודה לנחום אולנובסקי ולחברי מעבדת אולאנקובסקי על כל עזרתם. בנוסף, אנו אסירי תודה לטל נובאופנסקי-צור לקבלת סיוע טכני מועיל. אנו מכירים בהכרת המדינה את התמיכה הפיננסית בקרן המדע הישראלית-התוכנית הראשונה (מענק מס ' 281/15), וקרן הנאמנות ההלמסלי דרך היוזמה החקלאית, הביולוגית והקוגניטיבית של אוניברסיטת בן-גוריון בנגב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm round drill bits | Compatible with the drill. | ||
| 15 blade Scalpel | Sigma-Aldrich | ||
| 16 channel PCB board | Neurlynx | EIB-16 | |
| 1x3M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 1x3M phillips round head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 27 cm x 19 cm x 1 mm brass plate | See Figure 2 | ||
| 2x6M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 3140 RTV coating | Dow Crowning | 2767996 | |
| 75 µm Silver wire | A-M Systems | ||
| Brass machine screws #00-90 | 947-1006 | ||
| Brass plates 7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm | A 3D drawing is provided. See supplementary 1 | ||
| Coated Tungsten wire 25µm | California Fine Wire Company | 5000160 | Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000) |
| Coated Tungsten wire 50 µm | A-M Systems | 795500 | Can be replaced with any other wire with low impedance |
| Cyanoacrilic glue | |||
| Dental Burnisher | ComDent UK | Any small sterille stainless-still tool will do. | |
| Dental cement - GCFujiPLUS | GC | 431011 | Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other. |
| Dental drill or nail polish drill | Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement. | ||
| Drill bit #65 | 947-65 | ||
| Fast curing epoxy | Any 5 min curing epoxy can be used here. | ||
| Logger box with O-ring sealing | A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger. | ||
| Motorized turning device | Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means. | ||
| Mouselog-16 Neural logger | Deuteron Technologies Ltd | There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam | |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% |
| Nano-Z plating | White Matter LLC | The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics. | |
| PCB pins | Neurlynx | Neuralynx EIB Pins | |
| Polymide tubing 250 µm | A-M Systems | 822000 | |
| Rechargable battery | 3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time. | ||
| Silicone tubing 0.64 mm | A-M Systems | 806100 | |
| Stainless steel 1.5 mm | A-M Systems | 846000 | |
| Sudium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Tap #00-90 | 947-1301 | ||
| Vaseline | Any type of soft petroleum skin protectant can be used here. |
References
- Jacobson, M., Gaze, R. M. Types of visual response from single units in the optic tectum and optic nerve of the goldfish. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 49 (2), 199-209 (1964).
- Ben-Tov, M., Donchin, O., Ben-Shahar, O., Segev, R. Pop-out in visual search of moving targets in the archer fish. Nature Communications. 6, 6476 (2015).
- Zottoli, S. J. Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).
- Canfield, J. G., Rose, G. J. Activation of Mauthner neurons during prey capture. Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. Journal of Neuroscience Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Vanwalleghem, G. C., Ahrens, M. B., Scott, E. K. Integrative whole-brain neuroscience in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 50, 136-145 (2018).
- Vinepinsky, E., Donchin, O., Segev, R. Wireless electrophysiology of the brain of freely swimming goldfish. Journal of Neuroscience Methods. 278, 76-86 (2017).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3568 (2012).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators A: Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Arcot Desai, S., Rolston, J. D., Guo, L., Potter, S. M. Improving impedance of implantable microwire multi-electrode arrays by ultrasonic electroplating of durable platinum black. Frontiers in Neuroengineering. 3, 5 (2010).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network: Computation in Neural Systems. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Teixeira, F. B., Freitas, P., Pessoa, L. M., Campos, R. L., Ricardo, M. Evaluation of IEEE 802.11 underwater networks operating at 700 MHz, 2.4 GHz and 5 GHz. Proceedings of the 10th International Conference on Underwater Networks & Systems. , Arlington, VA. (2015).
- Sendra, S., Lloret, J., Rodrigues, J. J., Aguiar, J. M. Underwater wireless communications in freshwater at 2.4 GHz. IEEE Communications Letters. 17 (9), 1794-1797 (2013).
- Lloret, J., Sendra, S., Ardid, M., Rodrigues, J. J. Underwater wireless sensor communications in the 2.4 GHz ISM frequency band. Sensors. 12 (4), 4237-4264 (2012).
- Hoogerwerf, A. C., Wise, K. D. A three-dimensional microelectrode array for chronic neural recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 41 (12), 1136-1146 (1994).
- Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165 (2016).
