Summary
يتم تقديم تقنيه لاسلكيه جديده لتسجيل الإشارات العصبية خارج الخلية من الدماغ من السباحة بحريه ذهبيه. يتكون جهاز التسجيل من اثنين من tetrodes ، ميكرودرايف ، مسجل البيانات العصبية ، وحاله للماء. جميع أجزاء هي مخصصه الصنع باستثناء مسجل البيانات وموصل لها.
Abstract
أليات العصبية التي تحكم سلوك الأسماك لا تزال غير معروفه في معظمها ، علي الرغم من ان الأسماك تشكل غالبيه جميع الفقاريات. القدرة علي تسجيل نشاط الدماغ من الأسماك تتحرك بحريه من شانه ان يدفع البحوث علي الأساس العصبي للسلوك الأسماك إلى حد كبير. وعلاوة علي ذلك ، فان التحكم الدقيق في موقع التسجيل في الدماغ أمر بالغ الاهميه لدراسة النشاط العصبي المنسق عبر المناطق في دماغ السمك. هنا ، نقدم تقنيه التي تسجل لاسلكيا من الدماغ من الأسماك السباحة بحريه في حين السيطرة علي عمق موقع التسجيل. ويستند النظام علي مسجل العصبية المرتبطة بزرع جديده متوافقة مع المياه التي يمكن ضبط موقع التسجيل بواسطة tetrodes التي تسيطر عليها microdrive. وتتجلى قدرات النظام من خلال تسجيلات من الدماغ الذهبي.
Introduction
الأسماك هي المجموعة الأكبر والأكثر تنوعا من الفقاريات ، ومثل الفقاريات الأخرى انها تظهر القدرات المعرفية المعقدة مثل التنقل ، والتنشئة الجماعية ، والنوم ، والصيد ، الخ. ومع ذلك ، تبقي أليات العصبية التي تحكم سلوك الأسماك بالنسبة للجزء الأكبر غير معروف.
في العقود القليلة الماضية ، تم تنفيذ التسجيلات خارج الخلية من الأسماك المعباه في المقام الأول للتحقيق في جوانب مختلفه من الأساس العصبي للسلوك1،2. علي الرغم من ان هذا الأسلوب هو المناسب لبعض النظم الحسية ، والتحقيق في الطيف الكامل للأساس العصبي للسلوك من الصعب ان لم يكن من المستحيل في الحيوانية المعباه. وشملت التطورات الاولي تسجيل من الخلايا mauthner من السباحة المربوطة الأسماك3,4. مهما, [موتنر] خلايا بشكل غير متناسب كبيره وال يسجل عمل احتمال اتساع, اي يستطيع ذهبت مثل عال بما ان قليل من [مف], يسهل تسجيل. وفي وقت لاحق ، وصف كانفيلد وآخرون دليلا علي المفهوم عند استخدام الحيوانية المربوطة لتسجيل من الدماغ الدماغي من الأسماك5. آخر تقنيه حديثه لتسجيل النشاط العصبي من الأسماك هو تصوير الكالسيوم (راجع التعليقات من قبل Orger و de Polavieja6، و Vanwalleghem et al.7). تم تطوير هذه التقنية للاستخدام مع اليرقات الزكية لان الجلد والجمجمة شفافة خلال مرحله اليرقات. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة السلوكيات المعقدة في مراحل لاحقه من التطوير.
هنا ، نقدم تقنيه جديده لتسجيل النشاط العصبي خارج الخلية من أدمغه اسماك السباحة بحريه. وهذه صيغه معدله للبروتوكول الموصوف في فينيبينسكي وآخرون8. الابتكار الرئيسي هو أضافه microdrive الذي يجعل من الممكن للسيطرة علي موقف الأقطاب بعد الجراحة. تم تصميم هذه التقنية للتسجيل من الدماغ من السمك الذهبي باستخدام مجموعه من tetrodes التي ترتبط بمسجل البيانات العصبية عبر microdrive. الاعداد بأكمله هو لاسلكيه والراسية إلى جمجمة السمكة. الوزن النوعي للنظام يعادل الوزن الخاص بالماء عن طريق أضافه تعويم صغير يسمح للأسماك بالسباحة بحريه.
وتستند هذه التقنية علي استخدام مسجل البيانات العصبية التي تضخيم ، digitizes ، ويخزن الاشاره في جهاز الذاكرة علي متن الطائرة. يتم استخدام نظام القياس عن بعد المسجل لبدء ووقف التسجيلات ، وللمزامنة مع كاميرا الفيديو. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام مسجل العصبية 16 قناه ، وجزءا لا يتجزا من مربع للماء مع ميكرودرايف.
يتم تصنيع التجمع microdrive من اثنين من المكونات الرئيسية: microdrive نفسها والإسكان microdrive (الشكل 1ا ، ب). السكن يحمل microdrive و tetrodes ، وأيضا بمثابه مرساه بين الجمجمة وصندوق المسجل (الشكل 1ج). هو ملفقه مربع المسجل PVC باستخدام عمليه اله ومختومه باستخدام O-حلقه (الشكل 1E-G، انظر أيضا الشكل التكميلي 1، الشكل التكميلي 2، والشكل التكميلي 3 لرسم تخطيطي ثلاثي الابعاد [3d]). في نهاية واحده ، يتم إرفاق قطعه من رغوة البوليسترين إلى مربع المسجل للتعويض عن وزن الزرع وتوفير الأسماك مع زرع الطفو محايده. بناء microdrive الموصوفة في البروتوكول يتبع الاجراء الذي قدمه Vandecasteele et al.9 مع تعديل لإرفاق microdrive إلى السكن (الشكل 1ا). وتقدم جميع الخطوات الرئيسية.
والاجراء الموصوف في البروتوكول لاعداد جمجمة السمكة مماثل للاجراء الوارد في فينيبينسكي وآخرون8 ويرد وصفه بإيجاز في البروتوكول. بعد يوم واحد من الجراحة ، يتم استرداد الأسماك بشكل كامل من اثار التخدير وتكون جاهزه للتجارب السلوكية. لاحظ انه يمكن تعديل الموقع تيركب عن طريق تحويل المسمار microdrive. المسمار لديه تباعد من 300 μm لكل دوران كامل والتقدم من 75 μm ينصح حتى يتم الوصول إلى موقع الدماغ المستهدف. وينبغي استشاره أطلس الدماغ المناسبة لاستهداف منطقه الدماغ محدده من الفائدة. فانه من المستحسن لاختبار معاوقه القطب في كل مره يتم تخدير الأسماك للبطارية أو استبدال بطاقة الذاكرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب ان تتم الموافقة علي جميع إجراءات الجراحة من قبل لجان الأخلاق المحلية بشان رعاية الماشية (مثل IACUC).
1. بناء المساكن الميكرودرايف
- لبناء المساكن ، وقطع 1 مم لوحه نحاسية واسعه في 19 مم × 29 مم × 1 ملم لوحه باستخدام منشار. قطع اثنين من الشقوق 5.5 ملم علي كل من الجانبين طويلة عمودي علي الحافة ، مثل ان كل شق هو 6.5 ملم بعيدا عن الجانبين الضيقة (الشكل 2ا).
- باستخدام كماشة ، اضعاف المنطقة بين الشقوق علي الجانبين طويلة إلى الداخل ، ثم اضعاف الجزء السفلي الداخل والجانب العلوي إلى الخارج للحصول علي السكن (الشكل 2ب ، ج).
- باستخدام بت مثقاب 3 ملم ، وجعل ثقوب لمسامير في الإسكان microdrive.
ملاحظه: سيتم استخدام هذه الثقوب في وقت لاحق لإرفاق السكن إلى مربع المسجل (الشكل 2د). - لحام الجانبين من السكن.
- باستخدام ملف دائري غرامه ، وتوليد صغيره ، 1.5 ملم في نصف قطرها ، وشق نصف دائري في الجزء السفلي من السكن (الشكل 2ه).
ملاحظه: سيتم استخدام هذا في وقت لاحق لادراج أنبوب الفولاذ المقاوم للصدا لتوجيه الأقطاب الكهربائية. - استخدام مثقاب 1 ملم لجعل ثقب في الجزء الخلفي من السكن لل tetrodes (الشكل 2و).
ملاحظه: تم العثور علي نموذج ثلاثي الابعاد للسكن في ملف السكن التكميلي. stl.
2. بناء ميكرودرايف
- باستخدام القاطع ، وقطع قطعه ثلاثه دبوس من صف واحد الذكور راس دبوس قطاع (الشكل 1ح). باستخدام كماشة ، وسحب دبوس الأوسط.
- باستخدام قطع ، وقطع الدبابيس المتبقية إلى 10 ملم في الطول (2 ملم اقل من طول المسمار). احتمال آخر هو استخدام المسمار أطول (انظر الخطوة 2.4).
- حفر حفره باستخدام مثقاب ال#65 من خلال ثقب دبوس الأوسط. حفر مؤشر ترابط باستخدام الصنبور 00 − 99.
- تجميع microdrive وألواح النحاسية (7.5 مم × 2.5 مم × 0.6 مم ، راجع الشكل التكميلي 4) بحيث تلامس اللوحات النحاسية الدبابيس. ادراج المسمار (#00-90 رئيس جولة ، 12 ملم ، والنحاس) من خلال لوحه النحاس الأول ، ثم من خلال الموضوع راس دبوس ولوحه النحاس الثاني. وأخيرا ، ضع الجوز علي المسمار وتشديد بلطف علي microdrive تجميعها.
- لحام دبابيس مع لوحات من النحاس الأصفر ، والجوز مع غيض من المسمار.
- جندي ميكرودرايف في السكن microdrive في أربع نقاط علي جانبي لوحات النحاس microdrive.
- قطع أنبوب الفولاذ المقاوم للصدا واحد 6 ملم طويلة مع القطر الداخلي من 1.5 مم واخر أنبوب الفولاذ المقاوم للصدا 3 ملم طويلة مع القطر الداخلي من 1.2 مم. البولندية نهايات الأنابيب لتجنب نهايات حاده.
- الغراء أنبوب طويل مم 6 إلى شق نصف دائري صغير في الجزء السفلي من الإسكان microdrive باستخدام الايبوكسي. الغراء 3 مم الفولاذ المقاوم للصدا طويلة إلى راس دبوس ، اصطف مع أنبوب 6 ملم طويلة علي السكن.
- قطع قطعتين أنبوب سيليكون طويلة 5 سم مع قطر 0.64 ملم وأنبوب بوليميد طويلة واحده 5 سم مع قطر 0.250 مم.
- ادراج الأنابيب الثلاثة في أنابيب الفولاذ المقاوم للصدا اثنين. الغراء الأنابيب إلى أنبوب الفولاذ المقاوم للصدا تعلق علي راس دبوس باستخدام الغراء سيانوكريلات. برغي المحرك الصغير علي طول الطريق حتى وقطع الأنابيب الزائدة من اعلي وأسفل أنابيب الصلب اثنين.
ملاحظه: القرص الصغير مع السكن جاهز الآن للاستخدام (الشكل 1ج).
3. اعداد صفيف التيرود
- لتلفيق زرع اثنين من tetrode مع أربعه أقطاب علي كل tetrode ، واعداد ثمانيه أسلاك ، كل 12 سم طويل ، Formvar معزولة ، من 25 ميكرون قطرها أسلاك التنغستن.
ملاحظه: نفس التصميم يمكن ان تستوعب أربعه tetrodes. - وضع حامل للوحه واجهه القطب الكهربائي 16 قناه (بنك الامارات المتوسط-16) PCB (انظر جدول المواد) تحت المجهر.
- باستخدام ملقط لينه يميل وأخف وزنا ، وأزاله طلاء قباله كل من الأسلاك الثمانية علي جانب واحد باستخدام اللهب.
ملاحظه: هذا هو لضمان ان السلك سوف تكون متصلة بشكل صحيح إلى موصل PCB في وقت لاحق. - دفع سلك في واحده من الثقوب في بنك الامارات المصرفية-16 مع الجانب المغلفة في الحفرة. ضع دبوس واضغط عليه باستخدام كماشة. تحقق من الاتصال عن طريق قياس المقاومة بين دبوس والجانب غير المصقول من السلك.
ملاحظه: المقاومة علي ترتيب عشرات أوم. - كرر الخطوة 3.4 مع كل ثمانيه أسلاك.
- الشريط مجموعتين من أربعه أسلاك معا باستخدام شريط لاصق في نهاية كل سلك.
ملاحظه: سيتم لصق كل مجموعه معا في وقت لاحق لتشكيل تيركب. - قطع قطعه واحده من الأسلاك التنغستن 12 سم طويلة مع قطر 50 μm. قم بتوصيله بأحدي اتصالات بنك الامارات المفتوحة 16.
ملاحظه: هذا السلك سيكون بمثابه القطب المرجعي. - قطع اثنين من الأسلاك الفضية العارية 12 سم طويلة مع قطر 75 μm التي ستكون بمثابه أسباب للتسجيل مسجل. حام السلكين إلى الاتصال الأرضي في بنك الامارات المتوسط-16.
- عقد المصرف الكتروني للاستثمار-16 أعلاه جهاز تحول الميكانيكية ووضع نهاية شريط لاصق من مجموعه واحده من أربعه أسلاك علي جهاز ضبط بمحركات. تطبيق 130 جولات في اتجاه عقارب الدورة تليها 20 تناوب عكس اتجاه عقارب الدقيقة. تطبيق الغراء سيانوكريلات لتغطيه التيرود.
- انتظر الغراء لعلاج. اقطع الشريط اللاصق
- كرر الخطوات 3.9 و 3.10 مع التيركب الثاني.
ملاحظه: ينتج هذا الانتهاء من صفيف اثنين-tetrode (الشكل 1D).
4. تجميع الزرع
- برغي المحرك الصغير علي طول الطريق إلى أسفل.
- باستخدام 1 × 3 متر فيليبس جولة مسامير الراس ، ونعلق علي المصرف الخاص-16 إلى لوحه PVC.
- باستخدام ملاقط نهاية لينه ، وسحب كل tetrodes والأسلاك من خلال ثقب في الجبهة من غطاء مربع المسجل.
- باستخدام 2 × 6 متر فيليبس مسامير الراس المسطحة ، ونعلق لوحه PVC إلى غطاء مربع المسجل. الحفاظ علي موصل بنك الامارات المتوسط-16 في الاتجاه الصحيح بحيث يمكن تركيبها علي المسجل في بنك الصحة العام-16. تاكد من ان مصرف الامارات-16 ثابت في مكانه لتجنب التحف المتحركة في الاشاره المسجلة.
- ختم الأسلاك إلى مربع باستخدام الايبوكسي. تطبيق اقل قدر ممكن لان الختم الأساسي سيتم عن طريق درجه حرارة الغرفة مبركن (تليفزيون) في وقت لاحق.
- نعلق الإسكان microdrive إلى غطاء مربع المسجل باستخدام مسامير 2 مم.
- الموضوع tetrodes وجميع الأسلاك من خلال ثقب في الظهر من الإسكان microdrive. الموضوع tetrodes من خلال أنابيب السيليكون اثنين في microdrive. الموضوع الأسلاك التنغستن 50 μm من خلال أنبوب بوليميد في microdrive.
- الغراء tetrodes والأسلاك إلى أنابيبها عن طريق تطبيق الغراء سيانوكريلات إلى الطرف العلوي من الأنابيب ، لضمان الحركة يتسق مع microdrive. برغي المحرك الصغير علي طول الطريق إلى الأعلى.
- تطبيق النفط الناعمة (انظر جدول المواد) علي التيرود المكشوفة والأسلاك داخل الإسكان microdrive لمنع الحركة.
- قطع النافذة السفلية لطبق بيتري بحجم 12 مم × 14.5 ملم باستخدام شفره حلاقه ساخنه. نعلق النافذة علي الجبهة من السكن microdrive مع الايبوكسي. الحفاظ علي الأسلاك الارضيه خارج النافذة.
- تطبيق طلاء التليفزيون علي التيروديس المكشوفة والأسلاك بين غطاء صندوق المسجل والإسكان microdrive.
- بعد الشفاء من التليفزيون ، اغلق الصندوق بوزن صغير في الداخل ، وأدمجه في الماء بين عشيه وضحيها لضمان عدم تسرب الماء إلى الصندوق.
- قطع tetrodes والأسلاك المرجعية إلى الطول المطلوب باستخدام مقص حاد.
- إرفاق رغوة البوليسترين ملحوظ مقذوف (انظر جدول المواد) إلى المربع. اضبط حجمه بحيث يكون الطفو متوازنا عند غمره في حمام مائي.
- تراجع النصائح التيركب في محلول البلاتين الأسود واستخدام التيار المباشر (-0.2 μA) لمعطف الأقطاب الكهربائية وضبط مقاومه الأقطاب حسب الرغبة. استخدم اختبار مقاومه متعدد الأقطاب (انظر جدول المواد) لقياسات الطلاء والمقاومة.
ملاحظه: في الشاحب ذهبيه ، قيمه 40 kOhm هو أفضل. اعتمادا علي التطبيق ، يمكن تعديل مقاومه القطب عن طريق تعديل طلاء البلاتين الأسود10،11.
5. اعداد التخدير — 1% MS-222 حل الأسهم
تحذير: ويشمل اعداد التخدير استخدام مسحوق MS-222 ، وهو مسرطن. التالي ، يجب ان يتم الخطوات 5.2 و 5.3 في غطاء المحرك الكيميائي باستخدام القفازات.
- أضافه 100 mL من الماء إلى أنبوب التي يمكن ان تحتوي علي أكثر من 100 mL.
- في غطاء المحرك الكيميائي ، ضع لوحه ترجيح يمكن التخلص منها علي مقياس. أضف 1 غرام من مسحوق MS-222 باستخدام ملعقة ، ثم أضف البودرة إلى الأنبوب.
- هز الأنبوب جيدا.
ملاحظه: في شكل سائل ، يمكن استخدام MS-222 خارج غطاء المحرك الكيميائي يرتدي قفازات ولكن لا يتطلب قناع. - وضع لوحه الترجيح القابل للتصرف علي نطاق. أضف 2 غ من بيكربونات الصوديوم باستخدام ملعقة ، ثم أضف البودرة إلى الأنبوب. هز الأنبوب جيدا.
6. اعداد جمجمة السمكة
ملاحظه: في هذه المرحلة ، والأسماك جاهزه لجراحه زرع. قبل الجراحة ، تاكد من ان جميع المكونات والإمدادات قد تم تعقيمها من قبل الإجراءات المناسبة. لهذه الخطوة ، وهناك حاجه للخروج من المياه علي شكل حرف U حامل السمك. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام حامل ألمنيوم الذي يناسب راس 15 سم لذيل سمكه ذهبيه طويلة. هذا النظام يحمل الأسماك من الماء في حين النبض الخياشيم مع الماء المؤكسد. لمزيد من التفاصيل انظر Vinepinsky وآخرون8.
- وضع الأسماك في 0.02 ٪ MS-222 حمام المياه لمده 20 دقيقه حتى الأسماك نائما.
- باستخدام قفازات معقمه ، وإخراج الأسماك من الماء ووضعها في حامل.
ملاحظه: المياه المؤكسدة النبض الأسماك يحتوي علي MS-222 بتركيز 0.02 ٪ ، بحيث تبقي الأسماك تخدير اثناء الجراحة. - باستخدام ملعقة معقمه ، ضع ليدوكائين 5% معجون علي الجلد فوق المكان المخصص للجراحة لمده 10 دقائق ، ثم قم بازاله ليدوكائين.
ملاحظه: استشر أطلس الدماغ المناسب لاستهداف منطقه الدماغ المحددة. - باستخدام مشرط معقم بشفره 15 ، قم بازاله الجلد فوق الجمجمة في منطقه الزرع.
- باستخدام الحفر الأسنان مع 0.7 mm لقم الحفر ، حفر 4 ثقوب في الجمجمة. ادراج 1 مم المسمار (3 ملم طويلة) في كل حفره وتطبيق الغراء السيانولات علي الثقوب الحق قبل ادراج المسمار.
- باستخدام الملمع الأسنان ، وتطبيق الاسمنت الأسنان علي مسامير وعلي هامش الجمجمة المكشوفة.
- باستخدام الحفر الأسنان ، وجعل ثقب قطرها 5 ملم في الجمجمة فوق منطقه الدماغ من الفائدة. أزاله الانسجه الدهنية بين الجمجمة والدماغ وفضح الهدف منطقه الدماغ باستخدام ملاقط غرامه والمناديل الورقية الناعمة. يجب الحرص علي عدم الاضرار الاوعيه الدموية الكبيرة تحت الجمجمة.
ملاحظه: في نهاية هذه المرحلة ، والأسماك مستعدة لزرع المسبار. يتم وصف الخطوات الرئيسية الخاصة بهذا البروتوكول فقط هنا. العديد من الإجراءات بعد العملية الجراحية (مثل الوثائق المفصلة عن صحة الحيوانية وتعقيم أدوات الجراحة والمنطقة) لا يتم عرضها أو مناقشتها لأنها تنطبق علي جميع الجراحات مع الأسماك أو الكائنات الصغيرة.
7. زرع المسبار
ملاحظه: لإكمال الخطوة الاخيره في البروتوكول ، هناك حاجه إلى المتلاعب الذي يمكنه الاحتفاظ بالغرس في مكانه اثناء إدخاله إلى المخ.
- استخدام مناور لعقد غطاء مربع المسجل مع tetrodes مشيرا إلى أسفل نحو الدماغ الأسماك.
- ثني القطب المرجعي بحيث عندما يتم خفض tetrodes في الدماغ ، والمرجع يبقي خارج الدماغ.
- قطع الأراضي بحيث انها تناسب في الجمجمة. بشكل اختياري ، قم بتوصيل سلك ارضي واحد بأحد مسامير الجمجمة.
- خفض الزرع بحيث يتم ادراج الأقطاب الكهربائية في الدماغ في حين ان الجزء السفلي من السكن microdrive بالقرب من الجمجمة.
- بدء ربط زرع إلى الجمجمة عن طريق تطبيق كميه صغيره من الاسمنت الأسنان بين السكن وأقرب المسمار الجمجمة.
- بعد الشفاء من الجزء الأول من الاسمنت الأسنان ، وتطبيق الاسمنت الأسنان وإغلاق الحفرة فوق الجمجمة والجمجمة المكشوفة بأكملها.
ملاحظه: عاده ما تكون هناك حاجه إلى عده جولات من تطبيقات الاسمنت الأسنان من أجل تغطيه كامل الجمجمة المكشوفة. - تثبيت المسجل والبطارية في المربع وختم مربع مع جميع البراغي.
- تطبيق المضادات الحيوية والمسكنات المحلية وفقا لنوع من الأسماك المستخدمة للتجارب.
- اغسل خياشيم السمكة بالماء العذب حتى تبدا السمكة في الاستيقاظ. أزاله الأسماك من حامل ووضعه مره أخرى في خزان المنزل.
ملاحظه: يتم استرداد الأسماك بالبالكامل في غضون 60 دقيقه بعد الجراحة. - تاكد من ان الأسماك قادره علي السباحة بحريه مع زرع (الشكل 3، الفيديو التكميلية 1). إذا لزم الأمر ، وأعاده ضبط حجم رغوة البوليسترين مقذوف فوق مربع المسجل بحيث يمكن للأسماك التوازن بسهوله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اثناء جلسة التسجيل ، سبحت السمكة الذهبية بحريه في خزان مياه مربع بينما تم تسجيل النشاط العصبي في الدماغ. وكان الهدف من هذه التجارب لدراسة كيفيه النشاط العصبي للخلايا واحده يحدد سلوك الأسماك. وللقيام بذلك ، يلزم تحديد النشاط الشائك في البيانات المسجلة. النشاط الدماغ ، في حين يجري تسجيلها ، وكانت رقميه في 31,250 هرتز وعاليه تمريره تصفيتها في 300 هرتز من قبل مسجل البيانات. ثم ، دون اتصال ، تم تطبيق فلتر تمرير الفرقة (300 − 5000 هرتز) علي الإشارات ، وتم فصل البيانات الخام ترد إلى كل قنوات tetrode وقناه مرجعيه (الشكل 4ا). بعد ذلك ، استخدمت خوارزميات الفرز الشائعة12 لتوصيف نشاط خليه واحده. أولا ، تمت تصفيه كل قناه يدويا بالحد الأدنى لعتبه السعه القصوى (بالنسبة لمستويات الضجيج لكل قناه). ثم ، لان نصائح tetrodes ' ليست في نفس الموقع ، والقطب المرجعي كان خارج الدماغ ، وتم أيضا تصفيه المسامير التي ظهرت في أكثر من تيركب أو في القناة المرجعية. ثم تم تجميع البيانات المصفاة يدويا وتصفيتها حسب الشكل ، والطول ، والفاصل بين السبايك (الوقت بين إمكانيات العمل اللاحقة يجب ان تلتزم بالفترة الحرارية للخلايا العصبية) ، وتحليل المكون الرئيسي (PCA). وترد في الشكل 4أمثله لتجميع الخلايا المفردة مقابل مجموعات الوحدات المتعددة والضوضاء.
الشكل 1: تجميع الغرس. (ا) microdrive ، مصنوعة من راس دبوس ، لوحات من النحاس الأصفر ، والمسمار. (ب) الإسكان microdrive ، مصنوعة من لوحه نحاسية واحده عن طريق الطي. (ج) الجمعية المصغرة المصنوعة من المحرك المجهري (ا) والإسكان (ب). (د) تم صنع صفيف التيرود باستخدام المصرف الكتروني للاستثمار-16 ، واثنين من التيروديس ، وقطب مرجعي ، والأسباب المتصلة بالموصل (انظر جدول المواد). (ه) و (و) ترتبط جمعيه غرسه microdrive بغطاء صندوق المسجل المقاوم للماء. ويقع موصل التجميع صمام رباعي داخل المربع ويتم لصقها في tetrodes إلى microdrive. (ز) قاعده مربع المسجل حيث يقع المسجل والبطارية. يتم استخدام حلقه يا حول القاعدة لختم. (H) صف واحد ذكر دبوس رؤوس الشريط. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تقنيه للطي الإسكان Microdrive. (ا) تبدا بلوحه نحاسية عريضة بحجم 1 مم وتصنع أربعه شقوق. (ب) اضعاف الجزء الأوسط من الجانب إلى الداخل. (ج) اضعاف الجزء العلوي إلى الوراء والجزء السفلي إلى الداخل. (د) حفر ثلاثه ثقوب 3 ملم في الأعلى. (ه) نقش نصف دائري 1 مم في الجزء السفلي. (F) حفر ثقب 1 ملم في منتصف الجانب العلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التسجيل من سمكه ذهبيه تتصرف بحريه. (ا) يتم زرع التيروديس في دماغ السمكة ويرتبط التجمع بجمجمة السمكة. (B) مختومه مربع مع المسجل في الداخل. (جيم-هاء) سمكه تسبح بحريه مع الجمعية بعد الجراحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية. (ا) تسجيل 0.5 s طويلة من السباحة بحريه الأسماك 24 ساعة بعد الجراحة. تتم تصفيه الاشاره باستخدام فلتر تمرير النطاق (300 − 10000 هرتز). لا يوجد ضجيج السعه العالية في القطب المرجعي ، مما يدل علي عدم وجود التحف الحركة. هناك ما من عمل إمكانيات في الثانية [تيركب] (قنوات خضراء). يتم عرض البيانات القطب الأول في القناات البني. تشير النجوم الزرقاء والحمراء إلى طفرات من الكتل الزرقاء والحمراء المعروضة في اللوحتين B و C علي التوالي. (ب) ارتفاع الاشكال من مجموعتين مختلفتين من الخلايا العصبية واحده ، المسجلة من صمام رباعي 1. (ج) إسقاط المكونات الرئيسية الثلاثة الاولي للبيانات المستمدة من المستوي الأول لجميع المرشحين الذين اجتازوا العتبة. تتوافق الكتل الزرقاء والحمراء مع الاشكال الزرقاء والحمراء من اللوحة b. وتمثل النقاط الرمادية الضوضاء العصبية أو النشاط المتعدد الوحدات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
فيديو تكميلي 1: أنماط السباحة: مثال لسمكه ذهبيه قبل يوم من عمليه الزرع (يسار) وبعد يوم واحد (يمين). يظهر الفيديو أنماط سباحه مشابهه ، مما يشير إلى ان السمكة لا تعيقها الجراحة. سرعه الفيديو هي x 1.8. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
الشكل التكميلي 1: رسم تخطيطي للغرفة الرئيسية مربع المسجل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: رسم تخطيطي لغطاء صندوق المسجل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3: رسم بياني لغطاء الغرفة 16. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 4: رسم تخطيطي لصفيحه النحاس المستخدمة في المحرك المجهري. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: مخطط الإسكان. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويفصل هذا البروتوكول الخطوات التي ينطوي عليها غرس صفيف التيركب في الدماغ الذهبي للسباحة بحريه. هذه التقنية تنفذ المسجل العصبي الذي يضخم ويسجل الإشارات المكتسبة من ما يصل إلى 16 قنوات جنبا إلى جنب مع microdrive التي يمكن ضبط موقف تيركب في الدماغ. Microdrive يجعل من الممكن لضبط الموقف في الدماغ لتحسين التسجيل.
يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهوله للتسجيل من مناطق الدماغ الأخرى (انظر Vinepinsky et al.8 للتسجيل من التكنولوجيا البصرية باستخدام تقنيه مماثله) أو اي الحيوانية المائية الأخرى 15 سم طويلة أو أكبر (تقريبا مساويه لراس سمكه ذهبيه إلى الذيل ، ~ 100 جرام الوزن). الاضافه إلى ذلك ، يمكن تعديل البروتوكول للعمل مع اي مسجل البيانات طالما انه يتصل بتردد التي يمكن ان تخترق المياه. المسجل المستخدمة هنا يتصل باستخدام تردد الراديو من 900 ميغاهيرتز ويمكن التواصل من خلال حوالي 20 سم من الماء. تردد الراديو 2.4 GHz يمكن ان تخترق أيضا من خلال ~ 15 سم من المياه العذبة. الترددات المنخفضة والبدائل الأخرى قد تعطي نتائج أفضل حتى13,14,15. استخدم البروتوكول المعروض هنا صفيف ثنائي القناات مع ثماني قنوات تسجيل. [أين ديايشن], البروتوكول يستطيع كنت عدلت ان يدمج أخرى تحقيق هندسي مثل سلك مجموعه16 أو سليكون مجسات9.
هناك العديد من المزايا لاستخدام مسجل البيانات عبر نظام تسجيل القياس عن بعد كامل أو نظام المربوطة. أولا ، الاتصالات لاسلكيه تضيف ضجيجا إلى التسجيل. ولذلك ، فان الإرسال الكامل للبيانات يقلل من جوده الاشاره. بالاضافه إلى ذلك ، فان تسجيل البيانات يضمن عدم فقدان اي بيانات في حاله فشل الاتصال. وعلاوة علي ذلك ، تسمح الانظمه لاسلكيه للأسماك بالسباحة بحريه ، خلافا للحيوانات المربوطة. وأخيرا ، تم تطوير هذا البروتوكول لتسجيل إمكانات العمل ولكن يمكن أيضا ان تستخدم لتسجيل الإمكانات الميدانية المحلية عن طريق وضع المسجل التناظرية عاليه تمرير مرشح إلى 1 هرتز بدلا من 300 هرتز. عيب واحد من المسجل هو الحاجة إلى تحميل البيانات جسديا واستبدال البطارية عند تشغيله إلى أسفل.
المحرك المصغر المقترح في البروتوكول يزيد بشكل كبير من احتمال تسجيل نشاط خليه واحده. بدون جهاز microdrive ، يتم وضع tetrodes مزروع تقريبا في نفس موقع التسجيل في الدماغ لكامل الوقت يتم اختبار الأسماك. هذا يحد فعليا من احتمال تسجيل الخلايا العصبية واحده متعددة من نفس الأسماك ، التالي المنحنيات العائد تسجيل لكل سمكه. حقيقة ان موقع تسجيل معين في الدماغ لا يزال مجهولا حتى بعد الجراحة يقوي الحاجة إلى جهاز المنقولة التي تجعل من الممكن لتحريك الأقطاب في الدماغ بعد التثبيت كذلك.
ومن السمات الهامه لهذا البروتوكول الذي تم حذفه للتوضيح هو تحديد معاوقه القطب. ويمكن تعديل مقاومه القطب من خلال اختيار قطر السلك (اي ان القطر الأعلى يؤدي إلى انخفاض المقاومة) ، وتركيب الأسلاك (مثل التنغستن أو nichrome) ، وطلاء القطب (علي سبيل المثال ، البلاتين الأسود لالتنغستن والذهب ل nichrome) الذي يعطي الأسلاك مع أقطار اقل ومقاومه اقل. لان كل هذه المعلمات هي حاسمه لنجاح التسجيلات العصبية ، ويشجع القارئ بقوة علي الاطلاع علي الأدبيات الواسعة حول هذا الموضوع ، بما في ذلك هاريس وآخرون17.
لاحظ اهميه القطب المرجعي في الكشف عن مصادر الضوضاء الخارجية المحتملة في النظام. القطب المرجعي هو قطب مقاومه منخفضه نسبيا التي يتم ادراجها في الجمجمة ولكن خارج الدماغ. لأنه لا ياتي في اتصال مع انسجه المخ ، فانه يسجل توقيع اشاره ، والذي يتكون من الضوضاء الحرارية ، والتحف الحركة ، والضوضاء الخارجية. مصادر الضوضاء الرئيسية في هذا النظام هي الحركة الاثريه والضوضاء الاتصالات التي يمكن السيطرة عليها وتوقيتها من قبل المسجل. ويمكن بسهوله الكشف عن هذه الضوضاء بالتوقيع انها تفرض علي اشاره من القطب المرجعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ونحن ممتنون ل ناشوم اولانوفسكي وأعضاء مختبر اولانوفسكي لكل مساعدتهم. الاضافه إلى ذلك ، ونحن ممتنون لتل نوفوبلانسكي-Tzur للمساعدة التقنية المفيدة. ونحن نعترف بامتنان بالدعم المالي من البرنامج الأول للمؤسسة العلمية الاسرائيليه (المنحة رقم 281/15) ، وصندوق هيلمسلي الخيري من خلال مبادرة الروبوتات الزراعية والبيولوجية والمعرفية لجامعه بن غوريون في النقب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm round drill bits | Compatible with the drill. | ||
| 15 blade Scalpel | Sigma-Aldrich | ||
| 16 channel PCB board | Neurlynx | EIB-16 | |
| 1x3M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 1x3M phillips round head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 27 cm x 19 cm x 1 mm brass plate | See Figure 2 | ||
| 2x6M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 3140 RTV coating | Dow Crowning | 2767996 | |
| 75 µm Silver wire | A-M Systems | ||
| Brass machine screws #00-90 | 947-1006 | ||
| Brass plates 7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm | A 3D drawing is provided. See supplementary 1 | ||
| Coated Tungsten wire 25µm | California Fine Wire Company | 5000160 | Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000) |
| Coated Tungsten wire 50 µm | A-M Systems | 795500 | Can be replaced with any other wire with low impedance |
| Cyanoacrilic glue | |||
| Dental Burnisher | ComDent UK | Any small sterille stainless-still tool will do. | |
| Dental cement - GCFujiPLUS | GC | 431011 | Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other. |
| Dental drill or nail polish drill | Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement. | ||
| Drill bit #65 | 947-65 | ||
| Fast curing epoxy | Any 5 min curing epoxy can be used here. | ||
| Logger box with O-ring sealing | A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger. | ||
| Motorized turning device | Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means. | ||
| Mouselog-16 Neural logger | Deuteron Technologies Ltd | There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam | |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% |
| Nano-Z plating | White Matter LLC | The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics. | |
| PCB pins | Neurlynx | Neuralynx EIB Pins | |
| Polymide tubing 250 µm | A-M Systems | 822000 | |
| Rechargable battery | 3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time. | ||
| Silicone tubing 0.64 mm | A-M Systems | 806100 | |
| Stainless steel 1.5 mm | A-M Systems | 846000 | |
| Sudium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Tap #00-90 | 947-1301 | ||
| Vaseline | Any type of soft petroleum skin protectant can be used here. |
References
- Jacobson, M., Gaze, R. M. Types of visual response from single units in the optic tectum and optic nerve of the goldfish. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 49 (2), 199-209 (1964).
- Ben-Tov, M., Donchin, O., Ben-Shahar, O., Segev, R. Pop-out in visual search of moving targets in the archer fish. Nature Communications. 6, 6476 (2015).
- Zottoli, S. J. Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).
- Canfield, J. G., Rose, G. J. Activation of Mauthner neurons during prey capture. Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. Journal of Neuroscience Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Vanwalleghem, G. C., Ahrens, M. B., Scott, E. K. Integrative whole-brain neuroscience in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 50, 136-145 (2018).
- Vinepinsky, E., Donchin, O., Segev, R. Wireless electrophysiology of the brain of freely swimming goldfish. Journal of Neuroscience Methods. 278, 76-86 (2017).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3568 (2012).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators A: Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Arcot Desai, S., Rolston, J. D., Guo, L., Potter, S. M. Improving impedance of implantable microwire multi-electrode arrays by ultrasonic electroplating of durable platinum black. Frontiers in Neuroengineering. 3, 5 (2010).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network: Computation in Neural Systems. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Teixeira, F. B., Freitas, P., Pessoa, L. M., Campos, R. L., Ricardo, M. Evaluation of IEEE 802.11 underwater networks operating at 700 MHz, 2.4 GHz and 5 GHz. Proceedings of the 10th International Conference on Underwater Networks & Systems. , Arlington, VA. (2015).
- Sendra, S., Lloret, J., Rodrigues, J. J., Aguiar, J. M. Underwater wireless communications in freshwater at 2.4 GHz. IEEE Communications Letters. 17 (9), 1794-1797 (2013).
- Lloret, J., Sendra, S., Ardid, M., Rodrigues, J. J. Underwater wireless sensor communications in the 2.4 GHz ISM frequency band. Sensors. 12 (4), 4237-4264 (2012).
- Hoogerwerf, A. C., Wise, K. D. A three-dimensional microelectrode array for chronic neural recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 41 (12), 1136-1146 (1994).
- Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165 (2016).
