Summary
En roman trådløs teknikk for innspilling ekstracellulære nevrale signaler fra hjernen av fritt svømming gullfisk presenteres. Innspillingen enheten består av to tetrodes, en Microdrive, en nevrale data logger, og en vanntett sak. Alle deler er skreddersydd med unntak av data logger og dens kontakt.
Abstract
De nevrale mekanismene som regulerer fiske atferden forblir for det meste ukjent, selv om fisken utgjør flertallet av Alle virveldyr. Evnen å fortegnelse hjerne aktivitet fra fritt flytter fisken ville fremskritt forskning på neural basis av fisken opptreden atskillig. Videre er presis kontroll av innspillingen plassering i hjernen avgjørende for å studere koordinert nevrale aktivitet på tvers av regioner i fisk hjernen. Her presenterer vi en teknikk som registrerer trådløst fra hjernen av fritt svømming fisk mens du kontrollerer dybden på innspillingen plassering. Systemet er basert på en neural logger assosiert med en roman vann-kompatible implantat som kan justere innspillingen plasseringen av Microdrive-kontrollerte tetrodes. Evnene av systemet er belyst igjennom registreringene fra Telencephalon av goldfish.
Introduction
Fisken er det størst og høyst Miscellaneous gruppe av virveldyr, og like annet virveldyr de forevise innviklet Cognitive evnene som navigering, sosialt samvær, sovende, jakten, etc. Likevel er det nevrale mekanismer som regulerer fiske atferden fortsatt for det meste ukjent.
I de siste ti årene har ekstracellulære innspillinger fra immobilisert fisk primært blitt iverksatt for å undersøke ulike aspekter av det nevrale grunnlaget for atferden1,2. Selv om denne teknikken er hensiktsmessig for noen sensoriske systemer, etterforskning av hele spekteret av nevrale grunnlag av atferd er vanskelig om ikke umulig i immobilisert dyr. Den første fremskritt involvert innspillingen fra Mauthner celler av bundet svømming fisk3,4. Men Mauthner celler er uforholdsmessig store og den registrerte handlingen potensielle amplituder, som kan gå så høyt som noen mV, lette innspillingen. Senere, Canfield et al. beskrevet et bevis på konseptet når du bruker et bundet dyr til posten fra Telencephalon av fisk5. En annen nyere teknikk for opptak neural aktivitet fra fisk er kalsium Imaging (se anmeldelser av Orger og de Polavieja6, og Vanwalleghem et al.7). Denne teknikken ble utviklet for bruk med sebrafisk larver fordi huden og skallen er gjennomsiktige under larvestadiet scenen. Imidlertid kan denne teknikken ikke brukes til å studere komplekse atferd i senere stadier av utviklingen.
Her presenterer vi en ny teknikk for innspilling ekstracellulære nevrale aktivitet fra hjernen av fritt svømming fisk. Dette er en modifisert versjon av protokollen som er beskrevet i Vinepinsky et al.8. Den viktigste innovasjonen er tilsetning av en Microdrive som gjør det mulig å kontrollere posisjonen til elektrodene etter operasjonen. Teknikken er beregnet på innspillingen fra Telencephalon av goldfish benytter en sette av tetrodes det er koplet å en nevrale data ført inn i loggbok via en Microdrive. Hele oppsettet er trådløst og forankret til fiske skallen. Den spesifikke vekten av systemet er equalized til vann-spesifikk vekt ved å legge en liten dupp som gjør at fisken å svømme fritt.
Teknikken er basert på bruk av en nevrale data logger som forsterker, digitaliserer, og lagrer signalet i en onboard minneenhet. Den logger telemetri systemet brukes til å starte og stoppe opptakene, og for synkronisering med videokameraet. I denne protokollen, en 16-kanals neural logger brukes, innebygd i en vanntett boks sammen med Microdrive.
Den Microdrive forsamlingen er fabrikkert fra to hovedkomponenter: selve Microdrive og Microdrive huset (figur 1A, B). Huset holder Microdrive og tetrodes, og fungerer også som ankeret mellom skallen og logger boksen (figur 1C). PVC-logger boksen er fabrikkert ved hjelp av en maskin prosess og er forseglet ved hjelp av en O-ring (figur 1E-G, se også supplerende figur 1, supplerende figur 2, og supplerende figur 3 for et tredimensjonalt [3D]-diagram). I den ene enden, er et stykke av polystyren skum festet til logger boksen for å kompensere for vekten av implantatet og gi fisken med en oppdrift-nøytralt implantat. Konstruksjonen av Microdrive som er beskrevet i protokollen følger prosedyren presentert av Vandecasteele et al.9 med en modifikasjon for å feste Microdrive til huset (figur 1a). Alle de viktigste trinnene er presentert.
Prosedyren er beskrevet i protokollen for å forberede fisken skallen ligner den som presenteres i Vinepinsky et al.8 og er beskrevet kort i protokollen. En dag etter operasjonen, er fisken normalt helt utvinnes fra virkningene av anestesi og er klar for atferds eksperimenter. Legg merke til at sperrende plassering kan justeres ved å dreie på Microdrive skruen. Skruen har en avstand på 300 μm per full rotasjon og en avansement på 75 μm anbefales til målet hjernen plasseringen er nådd. En hensiktsmessig hjernen Atlas bør konsulteres for å målrette den spesifikke hjernen regionen av interesse. Det er tilrådelig å teste elektroden impedans hver gang fisken er anesthetized for batteri eller minnekort erstatning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle kirurgiske prosedyrer må godkjennes av lokale etikk komiteer på dyrevelferd (f. eks, IACUC).
1. bygging av Microdrive Housing
- For å konstruere huset, kutt en 1 mm bred messingplate i en 19 mm x 29 mm x 1 mm plate ved hjelp av en SAG. Skjær to 5,5 mm åpninger på hver av de lange sidene vinkelrett på kanten, slik at hver spalte er 6,5 mm unna de smale sidene (figur 2A).
- Ved hjelp av tang, brett området mellom spaltene på de lange sidene innover, og brett den nederste delen innover og den øvre side utover for å få huset (figur 2B, C).
- Bruk en 3 mm bore bit til å lage hull til skruer i Microdrive huset.
Merk: Disse hullene vil bli brukt senere for å feste huset til logger boksen (figur 2D). - Lodde sidene av huset.
- Ved hjelp av en fin sirkulær fil, generere en liten, 1,5 mm i radius, halv sirkulær spalte i bunnen av huset (figur 2E).
Merk: Dette vil bli brukt senere for å sette inn rustfritt stål rør for å veilede elektrodene. - Bruk en 1 mm bore bit til å lage et hull på baksiden av huset til tetrodes (figur 2F).
Merk: En 3D-modell av huset er funnet i supplerende Housing. STL-filen.
2. byggingen av Microdrive
- Ved hjelp av en kutter, bryte en tre-pinners stykke fra en enkelt rad mannlige PIN header stripe (figur 1H). Bruke tang, trekke ut den midterste pinnen.
- Ved hjelp av en kutter, kutt de resterende pinnene til 10 mm i lengde (2 mm mindre enn skruen lengde). En annen mulighet er å bruke en lengre skrue (se trinn 2,4).
- Bor et hull ved hjelp av en #65 borekronen gjennom midten PIN hullet. Drill en tråd ved hjelp av en 00 − 99 trykk.
- Monter Microdrive og messingplatene (7,5 mm x 2,5 mm x 0,6 mm, se supplerende figur 4) slik at messingplatene berører pinnene. Sett inn en skrue (#00-90 rundt hode, 12 mm, messing) gjennom den første messingplate, deretter gjennom PIN header tråden og den andre messingplate. Til slutt plasserer en mutter på skruen og forsiktig stramme den monterte Microdrive.
- Lodde pinnene sammen med messingplatene, og mutteren med spissen av skruen.
- Lodde Microdrive inn i Microdrive huset på fire punkter på sidene av Microdrive messingplater.
- Skjær en rustfritt stål rør 6 mm lang med en indre diameter på 1,5 mm og en annen rustfritt stål rør 3 mm lang med en indre diameter på 1,2 mm. polske endene av rørene for å unngå skarpe endene.
- Lim den 6 mm lange slangen til den lille halv runde spalten på bunnen av Microdrive huset ved hjelp av epoxy. Lim 3 mm lang rustfritt stål til PIN header, lined opp med den 6 mm lange rør på huset.
- Skjær to 5 cm lange silikon rør segmenter med diameter på 0,64 mm og en 5 cm lang Polyimide rør med diameter på 0,250 mm.
- Sett de tre rørene inn i de to rørene i rustfritt stål. Lim rørene til rustfritt stål rør festet til PIN header ved hjelp av Cyanoacrylate lim. Skru Microdrive helt opp og klipp av overflødig slange fra toppen og bunnen av de to stålrør.
Merk: Microdrive med huset er nå klar til bruk (figur 1C).
3. klargjøre sperrende array
- For å dikte opp en to-sperrende implantat med fire elektroder på hver sperrende, forberede åtte ledninger, hver 12 cm lang, formbar isolert, av 25 μm diameter tungsten wire.
Merk: Den samme designen kan romme fire tetrodes. - Plasser en holder for et 16-kanals elektrode grensesnittkort (EIB-16) PCB (se tabell over materialer) under mikroskopet.
- Ved hjelp av en myk tippet TWEEZER og en lighter, fjerne belegget av hver av de åtte ledningene på den ene siden ved hjelp av flammen.
Merk: Dette er for å sikre at ledningen vil være riktig koblet til PCB kontakten senere. - Skyv en ledning inn i et av hullene i EIB-16 med den belagte siden i hullet. Plasser en nål og trykk den med tang. Kontroller tilkoblingen ved å måle motstanden mellom pinnen og den blanke siden av ledningen.
Merk: Motstanden er på rekkefølgen av titalls ohm. - Gjenta trinn 3,4 med alle de åtte ledningene.
- Tape to grupper av fire ledninger sammen ved hjelp av duct tape på slutten av hver ledning.
Merk: Hver gruppe vil limes sammen senere for å danne en sperrende. - Skjær en del av tungsten wire 12 cm lang med en 50 μm diameter. Koble den til en av EIB-16-tilkoblingene.
Merk: Denne ledningen vil fungere som referanse elektroden. - Skjær to nakne sølv ledninger 12 cm lange med en 75 μm diameter som vil tjene som grunnlag for innspillingen logger. Loddetinn de to ledningene til jordforbindelse i EIB-16.
- Hold EIB-16 over en motorisert dreie enhet, og plasser tape enden av en gruppe på fire ledninger på den motoriserte tuning-enheten. Påfør 130 runder med klokken etterfulgt av 20 mot urviseren rotasjoner. Påfør Cyanoacrylate lim for å dekke sperrende.
- Vent til limet å kurere. Skjær sperrende nær duct tape.
- Gjenta trinn 3,9 og 3,10 med den andre sperrende.
Merk: Dette produserer den ferdige to-sperrende array (figur 1D).
4. montering av implantatet
- Skru Microdrive hele veien ned.
- Bruk 1 x 3M Phillips runde hodeskruer, fest EIB-16 til PVC-platen.
- Ved hjelp av myk ende pinsett, trekke alle tetrodes og ledninger gjennom hullet i fronten av logger boksen dekselet.
- Bruke 2 x 6M Phillips flatt hodeskruer, fest PVC plate til logger boksen dekselet. Hold EIB-16-kontakten i riktig retning slik at logger kan monteres på EIB-16. Pass på at EIB-16 er fast på plass for å unngå bevegelses artefakter i det innspilte signalet.
- Forsegle ledningene til boksen ved hjelp av epoxy. Påfør så lite som mulig fordi den primære forsegling vil bli gjort av romtemperatur vulcanizing (RTV) senere.
- Fest Microdrive hus til logger boks dekselet med 2 mm skruer.
- Tre tetrodes og alle ledningene gjennom hullet på baksiden av Microdrive huset. Tre tetrodes gjennom de to silikon rørene i Microdrive. Trekk 50 μm-ledningen gjennom Polyimide røret i Microdrive.
- Lim tetrodes og ledningene til sine rør ved å bruke Cyanoacrylate lim til den øverste enden av rørene, for å sikre at bevegelsen er konsistent med Microdrive. Skru Microdrive hele veien til toppen.
- Påfør Soft Petroleum (se tabell over materialer) på den eksponerte sperrende og ledninger inne i Microdrive huset for å hindre bevegelse.
- Skjær en 12 mm x 14,5 mm Petri parabolen nederste vinduet ved hjelp av et oppvarmet barberblad. Fest vinduet til fronten av Microdrive hus med epoxy. Hold jord ledningene utenfor vinduet.
- Påfør RTV belegg på eksponert tetrodes og ledninger mellom logger boksen dekselet og Microdrive huset.
- Etter at RTV er kurert, lukke boksen med en liten vekt på innsiden, og senk i vann over natten for å sikre at det ikke er vannlekkasje i boksen.
- Skjær tetrodes og referanse ledningen til ønsket lengde ved hjelp av skarpe saks.
- Fest merket ekstrudert polystyren skum (se tabell over materialer) til boksen. Juster størrelsen slik at oppdrift er balansert når den er nedsenket i et vannbad.
- Dypp sperrende tipsene i platina svart løsning og bruk en likestrøm (-0,2 μA) til coat elektrodene og sett elektrodene ' impedans som ønsket. Bruk en multielectrode impedans tester (se tabell over materialer) for belegg og impedans målinger.
Merk: Inne det goldfish pallium, en salgsverdi av 40 kOhm er best. Avhengig av anvendelsen, kan elektroden impedans justeres ved å endre platina Sort belegg10,11.
5. anestesi forberedelse-1% MS-222 Stock løsning
Forsiktig: Anestesi forberedelse inkluderer bruk av pulverisert MS-222, et kreftfremkallende stoff. Derfor må trinn 5,2 og 5,3 gjøres i en kjemisk hette ved hjelp av hansker.
- Tilsett 100 mL vann til et rør som kan inneholde mer enn 100 mL.
- I en kjemisk hette, plasserer en disponibel vekting plate på en skala. Tilsett 1 g MS-222 pulver ved hjelp av en slikkepott, legg deretter pulveret til røret.
- Rist røret godt.
Merk: I flytende form, kan MS-222 brukes utenfor den kjemiske hetten iført hansker, men krever ikke en maske. - Plasser en en gangs vekt plate på en skala. Tilsett 2 g natrium bikarbonat med en slikkepott, legg deretter pulveret til røret. Rist røret godt.
6. klargjøre fisken Skull
Merk: På dette stadiet er fisken klar for implantat kirurgi. Før kirurgi, sørg for at alle komponenter og forsyninger har blitt sterilisert av de riktige prosedyrene. For dette trinnet, en ut av vann U-formet fisken holderen er nødvendig. I denne protokollen, en aluminium holder som passer en 15 cm hode til hale lang gullfisk brukes. Dette systemet holder fisken ute av vannet mens perfusing gjellene med oksygenrikt vann. For detaljer, se Vinepinsky et al.8.
- Plasser fisken i en 0,02% MS-222 vannbad i 20 minutter til fisken sover.
- Bruk sterile hansker, ta fisken ut av vannet og legg den i holderen.
Merk: Det oksygenrikt vann perfusing fisken behersker MULTIPLE SCLEROSIS-222 med ett konsentrasjonen av 0,02%, i den grad at fisken restene anesthetized i løpet av kirurgi. - Ved hjelp av en steril slikkepott, Påfør lidokain 5% lim på huden over utpekt sted for kirurgi i 10 min, og deretter fjerne lidokain.
Merk: Rådfør deg med en passende hjernen Atlas å målrette den spesifikke hjernen regionen. - Ved hjelp av en steril 15 blad skalpell, fjerne huden over skallen i regionen av implantatet.
- Bruk en tannlege Drill med 0,7 mm borekroner, Drill 4 hull i skallen. Sett inn en 1 mm skrue (3 mm lang) i hvert hull og påfør Cyanoacrylate lim på hullene rett før du setter inn skruen.
- Ved hjelp av en tannlege burnisher, gjelder Dental sement på skruene og i periferien av den eksponerte skallen.
- Ved hjelp av Dental Drill, lage en 5 mm diameter hull i skallen over hjernen regionen av interesse. Fjern fettvev mellom skallen og hjernen og utsett hjernen regionen målet ved hjelp av fin pinsett og bløtvev papir. Vær forsiktig så du ikke skader de store blodkarene under skallen.
Merk: Ved slutten av dette stadiet, er fisken forberedt på å implantatet sonden. Bare de viktigste trinnene som er spesifikke for denne protokollen er beskrevet her. Flere postoperative prosedyrer (for eksempel detaljert dokumentasjon på dyrets helse og sterilisering av operasjons redskaper og areal) blir ikke presentert eller diskutert fordi de gjelder for alle operasjoner med fisk eller små dyr.
7. implanting av proben
Merk: For å fullføre det siste trinnet i protokollen, er det nødvendig med en manipulator som kan holde implantatet på plass mens den settes inn i hjernen.
- Bruk manipulator til å holde logger boksen dekke med tetrodes peker ned mot fisken hjernen.
- Bøy referanse elektroden slik at når tetrodes senkes ned i hjernen, forblir referansen utenfor hjernen.
- Skjær den begrunnelse slik at de passer inn i skallen. Alternativt, koble en jordledning til en av hodeskallen skruer.
- Senk implantatet slik at elektrodene er satt inn i hjernen mens den nederste delen av Microdrive huset er nær skallen.
- Start feste implantatet til skallen ved å bruke en liten mengde Dental sement mellom huset og den nærmeste skallen skruen.
- Etter den første delen av Dental sement er kurert, gjelder Dental sement og lukke hullet over skallen og hele eksponert skallen.
Merk: Vanligvis flere runder av Dental sement applikasjoner er nødvendig for å dekke hele eksponert skallen. - Installer logger og batteriet i boksen og forsegle boksen med alle skruene.
- Påfør antibiotika og lokale smertestillende i henhold til den type fisk som brukes for eksperimenter.
- Skyll fiske gjellene med friskt vann til fisken begynner å våkne. Fjern fisken fra holderen og sett den tilbake i hjem tanken.
Merk: Fisken er fullt ut utvinnes innen 60 min etter operasjonen. - Sørg for at fisken er i stand til å svømme fritt med implantatet (Figur 3, supplerende video 1). Om nødvendig, justere størrelsen på ekstrudert polystyren skum over logger boksen slik at fisken kan balansere lett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under en innspillingen samling det goldfish svømte fritt inne en kvadrat vanntank stund det neural aktivitet i sin Telencephalon var registrert. Målet med disse eksperimentene var å studere hvordan neural aktivitet av enkeltceller bestemmer fisken atferd. For å gjøre dette, skyter aktivitet som trengs for å bli identifisert i de registrerte data. Hjernen aktivitet, som samtidig er registrert, ble digitalisert på 31 250 Hz og High-pass filtrert på 300 Hz av data logger. Offline, et band-pass-filter (300 − 5000 Hz) ble brukt på signalene, og de presorted rådata ble delt inn i hver sperrende kanaler og referanse kanalen (Figur 4a). Neste, felles spiker sortering algoritmer12 ble brukt til å karakterisere enkelt celle aktivitet. Først ble hver kanal manuelt filtrert etter minimal amplitude terskel (i forhold til støynivået for hver kanal). Så, fordi tetrodes ' tips er ikke i samme område, og referansen elektroden var utenfor hjernen, pigger som dukket opp i mer enn én sperrende eller i referanse kanalen ble også filtrert. De filtrerte dataene ble deretter manuelt gruppert og filtrert etter form, lengde, mellom Spike intervall (tiden mellom påfølgende handling potensialer må overholde den ildfaste perioden av neurons), og ved hovedkomponent analyse (PCA). Eksempler på enkelt celle klynger kontra multiunit og støy klynger presenteres i Figur 4.
Figur 1: implantat montering. (A) Microdrive, laget av en PIN header, messingplater, og en skrue. (B) Microdrive bolig, laget av en enkelt messingplate ved folding. (C) Microdrive montering laget med Microdrive (A) og huset (B). (D) den sperrende array ble gjort ved hjelp EIB-16, to tetrodes, en referanse elektrode, og begrunnelse koblet til en kontakt (se tabell over materialer). (E) og (F) den Microdrive implantatet forsamlingen er koblet til vanntett logger boksen dekselet. Sperrende monterings kontakt er plassert inne i esken, og tetrodes limes til Microdrive. (G) logger boksen base der logger og batteriet er plassert. O-ringen rundt basen brukes til tetting. (H) enkelt rad mannlig PIN hoder stripe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Microdrive bolig folding teknikk. (A) Start med en 1 mm bred messingplate og lage fire åpninger. (B) brett den midtre delen av siden innover. (C) brett den øvre delen bakover og den nederste delen innover. (D) bor tre 3 mm hull i toppen. (E) gravere 1 mm halvsirkel nederst. (F) bor et 1 mm hull i midten av oversiden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: opptak fra en fritt oppfører gullfisk. (A) tetrodes er implantert i fisken hjernen og forsamlingen er koblet til fisken ' s skallen. (B) boksen er forseglet med logger inne. (C-E) En fisk som svømmer fritt med forsamlingen etter operasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative resultater. (A) innspilling 0,5 s lang fra en fritt svømming fisk 24 h etter operasjonen. Signalet filtreres ved hjelp av et båndpassfilter (300 − 10 000 Hz). Det er ingen høy amplitude støy i referanse elektroden, noe som indikerer mangel på bevegelse gjenstander. Det er ingen handling potensialer i andre sperrende (grønne kanaler). De første elektrode dataene vises i de brune kanalene. Blå og røde stjerner indikerer pigger fra blå og røde klynger vist i henholdsvis paneler B og C. (B) Spike figurer av to forskjellige klynger av enkelt neurons, innspilt fra sperrende 1. (C) projeksjon på de første tre viktigste komponentene av data fra den første sperrende av alle topp kandidater som krysset terskelen. Blå og røde klynger tilsvarer blå og røde Spike figurer fra panel B. grå prikker representerer neural støy eller multiunit aktivitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende video 1: svømming mønstre: eksempel på gullfisk en dag før implantation kirurgi (venstre) og en dag etter (til høyre). Video viser lignende svømming mønstre, noe som indikerer at fisken ikke er hindret av kirurgi. Video hastigheten er x 1.8. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Supplerende figur 1: diagram av logger boksen hoved kammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 2: diagram av logger boksen coveret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 3: diagram av EIB-16 kammer coveret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 4: diagram av messing platen som brukes til Microdrive. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende fil 1: bolig diagram. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen detaljene foranstaltningene involvert inne implanting en sperrende oppstille inn i Telencephalon av fritt svømmer goldfish. Denne teknikken implementerer en neural logger som forsterker og registrerer signalene ervervet fra opptil 16 kanaler sammen med en Microdrive som kan justere sperrende posisjon i hjernen. Microdrive gjør det mulig å justere posisjonen i hjernen for å optimalisere opptaket.
Denne protokollen kan enkelt endres for opptak fra andre hjerneregioner (se Vinepinsky et al.8 for opptak fra optisk tectum ved hjelp av en lignende teknikk) eller andre akvatiske dyr 15 cm lange eller større (omtrent lik en gullfisk hode til hale, ~ 100 gram vekt). I tillegg kan protokollen endres til å fungere med alle data logger så lenge den kommuniserer med en frekvens som kan trenge gjennom vann. Den logger brukes her kommuniserer ved hjelp av en radiofrekvens på 900 MHz og kan kommunisere gjennom ca 20 cm vann. En radiofrekvens på 2,4 GHz kan også trenge gjennom over ~ 15 cm ferskvann. Lavere frekvenser og andre alternativer kan gi enda bedre resultater13,14,15. Protokollen som presenteres her, brukte en to-sperrende array med åtte opptaks kanaler. I tillegg kan protokollen endres for å innlemme andre sonde geometri som en wire array16 eller silikon sonder9.
Det er flere fordeler med å bruke en data logger over en full telemetri opptakssystem eller et bundet system. For det første gir trådløs kommunikasjon støy til opptaket. Derfor vil full overføring av dataene redusere signalkvaliteten. I tillegg sikrer logging av dataene ingen data går tapt hvis kommunikasjonen mislykkes. I tillegg gir trådløse systemer fisken mulighet til å svømme fritt, i motsetning til i et bundet dyr. Til slutt ble denne protokollen utviklet for å registrere handling potensialer, men kan også brukes til å registrere lokale feltet potensialer ved å sette logger analoge High-pass filter til 1 Hz i stedet for 300 Hz. En ulempe med logger er behovet for å fysisk laste ned data og erstatte batteriet når det går ned.
Microdrive som foreslås i protokollen, øker sannsynligheten for å registrere enkelt celle aktivitet betraktelig. Uten den Microdrive enheten plasseres de implantert tetrodes omtrent i samme opptakssted i hjernen for hele tiden fisken testes. Dette begrenser fysisk sannsynligheten for å registrere flere enkelt neurons fra samme fisk, og derfor curtails innspillingen yield per fisk. Det faktum at den spesifikke innspillingen området i hjernen forblir ukjent før etter operasjonen styrker behovet for en bevegelig enhet som gjør det mulig å flytte elektrodene i hjernen etter fiksering også.
En viktig funksjon i denne protokollen som ble utelatt for klarhet er fastsettelse av elektroden impedans. Elektroden impedans kan justeres ved valg av wire diameter (dvs. en høyere diameter fører til lavere impedans), wire sammensetning (f. eks tungsten eller nichrome), og elektrode belegg (f. eks platina svart for tungsten og gull for nichrome) som gir ledninger med lavere diametere og lavere impedans. Fordi alle disse parametrene er avgjørende for suksessen til neuronal innspillinger, oppfordres leseren sterkt til å konsultere den enorme litteraturen om dette temaet, inkludert Harris et al.17.
Legg merke til viktigheten av referanse elektroden når det oppdages mulige eksterne støykilder i systemet. Referansen elektroden er en relativt lav impedans elektroden som er satt inn i skallen, men er utenfor hjernen. Fordi den ikke kommer i kontakt med hjernevev, registrerer den signalet underskrift, som er sammensatt av termisk støy, bevegelse gjenstander, og ekstern støy. De store støykilder i dette systemet er bevegelse gjenstand og kommunikasjon lyder som kan styres og timet av logger. Disse lydene kan lett oppdages av signaturen de pålegge signalet av referanse elektroden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Nachum Ulanovsky og medlemmene av Ulanovsky-laboratoriet for all deres hjelp. I tillegg er vi takknemlige for Tal Novoplansky-Tzur for nyttig teknisk assistanse. Vi takker takknemlig for økonomisk støtte fra ISRAEL SCIENCE FOUNDATION-FIRST program (Grant no. 281/15), og Helmsley veldedige Trust gjennom Agricultural, biologisk og kognitiv Robotics Initiative av Ben-Gurion University of the Negev.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm round drill bits | Compatible with the drill. | ||
| 15 blade Scalpel | Sigma-Aldrich | ||
| 16 channel PCB board | Neurlynx | EIB-16 | |
| 1x3M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 1x3M phillips round head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 27 cm x 19 cm x 1 mm brass plate | See Figure 2 | ||
| 2x6M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 3140 RTV coating | Dow Crowning | 2767996 | |
| 75 µm Silver wire | A-M Systems | ||
| Brass machine screws #00-90 | 947-1006 | ||
| Brass plates 7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm | A 3D drawing is provided. See supplementary 1 | ||
| Coated Tungsten wire 25µm | California Fine Wire Company | 5000160 | Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000) |
| Coated Tungsten wire 50 µm | A-M Systems | 795500 | Can be replaced with any other wire with low impedance |
| Cyanoacrilic glue | |||
| Dental Burnisher | ComDent UK | Any small sterille stainless-still tool will do. | |
| Dental cement - GCFujiPLUS | GC | 431011 | Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other. |
| Dental drill or nail polish drill | Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement. | ||
| Drill bit #65 | 947-65 | ||
| Fast curing epoxy | Any 5 min curing epoxy can be used here. | ||
| Logger box with O-ring sealing | A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger. | ||
| Motorized turning device | Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means. | ||
| Mouselog-16 Neural logger | Deuteron Technologies Ltd | There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam | |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% |
| Nano-Z plating | White Matter LLC | The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics. | |
| PCB pins | Neurlynx | Neuralynx EIB Pins | |
| Polymide tubing 250 µm | A-M Systems | 822000 | |
| Rechargable battery | 3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time. | ||
| Silicone tubing 0.64 mm | A-M Systems | 806100 | |
| Stainless steel 1.5 mm | A-M Systems | 846000 | |
| Sudium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Tap #00-90 | 947-1301 | ||
| Vaseline | Any type of soft petroleum skin protectant can be used here. |
References
- Jacobson, M., Gaze, R. M. Types of visual response from single units in the optic tectum and optic nerve of the goldfish. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 49 (2), 199-209 (1964).
- Ben-Tov, M., Donchin, O., Ben-Shahar, O., Segev, R. Pop-out in visual search of moving targets in the archer fish. Nature Communications. 6, 6476 (2015).
- Zottoli, S. J. Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).
- Canfield, J. G., Rose, G. J. Activation of Mauthner neurons during prey capture. Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. Journal of Neuroscience Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Vanwalleghem, G. C., Ahrens, M. B., Scott, E. K.
- Vinepinsky, E., Donchin, O., Segev, R. Wireless electrophysiology of the brain of freely swimming goldfish. Journal of Neuroscience Methods. 278, 76-86 (2017).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3568 (2012).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators A: Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Arcot Desai, S., Rolston, J. D., Guo, L., Potter, S. M. Improving impedance of implantable microwire multi-electrode arrays by ultrasonic electroplating of durable platinum black. Frontiers in Neuroengineering. 3, 5 (2010).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network: Computation in Neural Systems. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Teixeira, F. B., Freitas, P., Pessoa, L. M., Campos, R. L., Ricardo, M. Evaluation of IEEE 802.11 underwater networks operating at 700 MHz, 2.4 GHz and 5 GHz. Proceedings of the 10th International Conference on Underwater Networks & Systems. , Arlington, VA. (2015).
- Sendra, S., Lloret, J., Rodrigues, J. J., Aguiar, J. M. Underwater wireless communications in freshwater at 2.4 GHz. IEEE Communications Letters. 17 (9), 1794-1797 (2013).
- Lloret, J., Sendra, S., Ardid, M., Rodrigues, J. J. Underwater wireless sensor communications in the 2.4 GHz ISM frequency band. Sensors. 12 (4), 4237-4264 (2012).
- Hoogerwerf, A. C., Wise, K. D. A three-dimensional microelectrode array for chronic neural recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 41 (12), 1136-1146 (1994).
- Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165 (2016).
