Summary
En roman trådlös teknik för inspelning extracellulära neurala signaler från hjärnan av fritt simning guldfisk presenteras. Inspelningsenheten består av två tetroder, en Microdrive, en neural datalogger och ett vattentätt fodral. Alla delar är skräddarsydda med undantag för datalogger och dess koppling.
Abstract
De neurala mekanismerna som styr fisk beteendet är fortfarande mest okända, även om fisken utgör majoriteten av alla ryggradsdjur. Förmågan att spela in hjärnans aktivitet från fritt rörliga fisken skulle främja forskning om den neurala grunden för fisk beteende avsevärt. Dessutom är exakt kontroll av inspelningsplatsen i hjärnan avgörande för att studera koordinerad neurala aktivitet mellan regioner i Fish Brain. Här presenterar vi en teknik som registrerar trådlöst från hjärnan av fritt simning fisk samtidigt kontrollera för djupet av inspelningsplatsen. Systemet är baserat på en neural logger i samband med ett nytt vatten-kompatibelt implantat som kan justera inspelningsplatsen genom Microdrive-kontrollerade tetrodes. Funktionerna i systemet illustreras genom inspelningar från telencephalon av Goldfish.
Introduction
Fisk är den största och mest skiftande grupp av ryggradsdjur, och liksom andra ryggradsdjur de uppvisar komplexa kognitiva förmågor såsom navigering, umgänge, sova, jakt, etc. Icke desto mindre, de neurala mekanismerna styr fisk beteende kvar för det mesta okända.
Under de senaste decennierna, extracellulära inspelningar från immobiliserad fisk har i första hand genomförts för att undersöka olika aspekter av den neurala grunden för beteende1,2. Även om denna teknik är lämplig för vissa sensoriska system, är utredning av hela spektrumet av den neurala grunden för beteende svårt om inte omöjligt i immobiliserade djur. De första framstegen innebar inspelning från Mauthner celler av tjudrad simning fisk3,4. Men Mauthner celler är oproportionerligt stora och den inspelade åtgärden potentiella amplituder, som kan gå så högt som några mV, underlätta inspelningen. Senare, Canfield et al. beskrev ett konceptbevis när du använder en tjudrad djur att spela in från telencephalon av Fish5. En annan ny teknik för inspelning Neural aktivitet från fisk är kalcium avbildning (se recensioner av orger och de Polavieja6, och Vanwalleghem et al.7). Denna teknik utvecklades för användning med zebrafiskar larver eftersom huden och skallen är transparenta under den larv skede. Denna teknik kan dock inte användas för att studera komplexa beteenden i senare utvecklingsstadier.
Här presenterar vi en ny teknik för att spela in extracellulär neurala aktivitet från hjärnan av fritt simning fisk. Detta är en modifierad version av protokollet som beskrivs i Vinepinsky et al.8. Den viktigaste nyheten är tillägget av en Microdrive som gör det möjligt att kontrollera positionen av elektroderna efter operationen. Tekniken är utformad för inspelning från telencephalon av guldfisk med hjälp av en uppsättning tetrodes som är anslutna till en neural data logger via en Microdrive. Hela installationen är trådlös och förankrad i fiskens skalle. Den specifika vikten av systemet utjämnade till den vattenspecifika vikt genom att lägga till en liten flottör som gör att fisken att simma fritt.
Tekniken bygger på användning av en neural datalogger som förstärker, digitaliserar och lagrar signalen i en onboard-minnesenhet. Logger-telemetrisystemet används för att starta och stoppa inspelningarna och för synkronisering med videokameran. I detta protokoll, en 16-kanals neurala logger används, inbäddad i en vattentät låda tillsammans med Microdrive.
Microdrive-enheten är tillverkad av två huvudkomponenter: själva Microdrive och Microdrive-höljet (figur 1A, B). Huset rymmer Microdrive och tetrodes, och fungerar även som ankare mellan skallen och logger Box (figur 1C). PVC logger Box är tillverkad med en maskin process och förseglas med hjälp av en O-ring (figur 1E-G, se även kompletterande figur 1, kompletterande figur 2, och kompletterande figur 3 för ett tredimensionellt [3D] diagram). I ena änden är en bit polystyrenskum fäst vid logger box för att kompensera för vikten av implantatet och förse fisken med ett flyt-neutralt implantat. Byggandet av Microdrive som beskrivs i protokollet följer det förfarande som presenteras av Vandecasteele et al.9 med en modifiering för att fästa Microdrive till huset (figur 1a). Alla större steg presenteras.
Det förfarande som beskrivs i protokollet för att förbereda fisk skallen liknar den som presenteras i Vinepinsky et al.8 och beskrivs kortfattat i protokollet. En dag efter operationen, fisken är normalt helt återhämtat sig från effekterna av anestesi och är redo för beteendemässiga experiment. Observera att tetrode-platsen kan justeras genom att vrida på Microdrive-skruven. Skruven har ett mellanrum på 300 μm per full rotation och en befordran av 75 μm rekommenderas tills mål hjärn platsen nås. En lämplig hjärna Atlas bör konsulteras för att rikta den specifika hjärnregionen av intresse. Det är tillrådligt att testa elektroden impedansen varje gång fisken är sövda för batteri eller minneskort ersättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla kirurgiska ingrepp måste godkännas av de lokala Etikkommittéerna för djurens välbefinnande (t. ex. IACUC).
1. konstruktion av Microdrive-huset
- För att konstruera huset, skär en 1 mm bred mässingsplåt i en 19 mm x 29 mm x 1 mm plåt med en såg. Skär två 5,5 mm slits på varje långsida vinkelrätt mot kanten, så att varje slits är 6,5 mm bort från de smala sidorna (figur 2a).
- Med hjälp av tång, vik området mellan slitsar på långsidorna inåt, sedan vika den nedre delen inåt och den övre sidan utåt för att få huset (figur 2B, C).
- Använd en 3 mm borr bit för att göra hål för skruvar i mikrodrivhuset.
Anmärkning: Dessa hål kommer att användas senare för att fästa höljet till logger Box (figur 2D). - Lödtenn på sidorna av höljet.
- Med en fin cirkulär fil, generera en liten, 1,5 mm i radie, halvcirkelformade slits i botten av höljet (figur 2E).
Anmärkning: Detta kommer att användas senare för att sätta in rostfrittstål röret för att vägleda elektroderna. - Använd en borrspets på 1 mm för att göra ett hål i husets bakstycke för tetroderna (figur 2F).
Anmärkning: En 3D-modell av huset finns i den kompletterande Housing. stl-filen.
2. konstruktion av Microdrive
- Med en fräs, Bryt av en tre-stifts pjäs från en enda rad manliga stift header Strip (figur 1H). Med hjälp av tänger, dra ut mittstiftet.
- Skär de resterande stiften med en fräs med en längd på 10 mm (2 mm mindre än skruvlängden). En annan möjlighet är att använda en längre skruv (se steg 2,4).
- Borra ett hål med hjälp av en #65 borr bit genom mitten stift hålet. Borra en tråd med en 00 − 99 kran.
- Montera mikroenheten och mässings plattorna (7,5 mm x 2,5 mm x 0,6 mm, se kompletterande figur 4) så att mässings plattorna vidrör stiften. Sätt i en skruv (#00-90 runt huvud, 12 mm, mässing) genom den första mässings plattan, sedan genom stift huvudet tråden och den andra mässings plattan. Slutligen, placera en mutter på skruven och försiktigt dra den monterade Microdrive.
- Lödtenn stiften tillsammans med mässing plåtar, och muttern med spetsen på skruven.
- Lödtenn Microdrive i Microdrive bostäder på fyra punkter på sidorna av Microdrive mässing plattor.
- Skär ett rostfritt stålrör 6 mm lång med en innerdiameter på 1,5 mm och ett annat rostfritt stålrör 3 mm lång med en innerdiameter på 1,2 mm. polera ändarna på rören för att undvika vassa ändar.
- Limma 6 mm långa röret till den lilla halvcirkelformade slit på botten av Microdrive bostäder med epoxi. Limma den 3 mm långa rostfria stål till stiftet huvudet, uppradade med 6 mm långa röret på höljet.
- Skär två 5 cm långa Silikonrör segment med diametern 0,64 mm och en 5 cm lång polyimid rör med diametern 0,250 mm.
- Sätt in de tre rören i de två rostfria stålrören. Limma rören till rostfrittstål röret fäst på stiftet huvudet med hjälp av cyanoakrylat lim. Skruva Microdrive hela vägen upp och skära av överflödig slang från toppen och botten av de två stålrör.
Anmärkning: Mikroenheten med höljet är nu klar för användning (figur 1C).
3. förberedelse av tetrode array
- För att fabricera en två-tetrode implantat med fyra elektroder på varje tetrode, förbereda åtta trådar, varje 12 cm lång, formvar isolerad, av 25 μm diameter volfram tråd.
Anmärkning: Samma design rymmer fyra tetroder. - Placera en hållare för ett 16-kanals elektrod gränssnittskort (EIB-16) PCB (se tabell över material) under mikroskopet.
- Med hjälp av en mjuk tippad pincett och en tändare, ta bort beläggningen av var och en av de åtta trådarna på ena sidan med hjälp av lågan.
Anmärkning: Detta för att säkerställa att tråden kommer att vara korrekt ansluten till PCB-kontakten senare. - Skjut in en tråd i ett av hålen i EIB-16 med den belagda sidan i hålet. Placera en nål och tryck på den med en tång. Kontrollera anslutningen genom att mäta motståndet mellan stiftet och den obestrukna sidan av tråden.
Anmärkning: Motståndet är på order av tiotals ohms. - Upprepa steg 3,4 med alla åtta ledningar.
- Tejpa två grupper av fyra trådar tillsammans med silvertejp i slutet av varje tråd.
Anmärkning: Varje grupp kommer att limmas samman senare för att bilda en tetrod. - Skär en bit volframtråd 12 cm lång med en 50 μm diameter. Anslut den till en av EIB-16-anslutningarna.
Anmärkning: Denna tråd kommer att fungera som referenselektrod. - Skär två kala silvertrådar 12 cm långa med en 75 μm diameter som kommer att fungera som grund för inspelningen Logger. Lödtenn de två trådarna till marken anslutning i EIB-16.
- Håll EIB-16 över en motoriserad svarv anordning och placera silvertejp slutet av en grupp av fyra trådar på den motoriserade tuning anordningen. Applicera 130 omgångar medurs följt av 20 motsols rotationer. Applicera cyanoakrylatlim för att täcka tetrode.
- Vänta tills limmet att bota. Skär tetrode nära silvertejp.
- Upprepa steg 3,9 och 3,10 med den andra tetrode.
Anmärkning: Detta ger den färdiga två-tetrode matrisen (figur 1D).
4. montering av implantatet
- Skruva på Microdrive hela vägen ner.
- Med hjälp av 1 x 3M Phillips skruvar runt huvudet, bifoga EIB-16 till PVC-plattan.
- Använda mjuka änden pincett, dra alla tetrodes och ledningar genom hålet i framsidan av logger Box Cover.
- Med hjälp av 2 x 6M Phillips platt huvudskruvar, bifoga PVC plattan till logger Box Cover. Håll EIB-16-kontakten i rätt riktning så att logger kan monteras på EIB-16. Se till att EIB-16 är fast på plats för att undvika rörelse artefakter i den inspelade signalen.
- Täta kablarna till boxen med epoxi. Applicera så lite som möjligt eftersom den primära tätningen kommer att göras genom rumstemperatur vulkaniserade (RTV) senare.
- Anslut Microdrive-höljet till logger Box Cover med 2 mm-skruvar.
- Trä tetrodes och alla ledningar genom hålet på bak platsen av Microdrive bostäder. Trä tetrodes genom de två silikon rören i Microdrive. Trä 50 μm volfram tråd genom polyimid röret i Microdrive.
- Limma tetroderna och trådarna till deras rör genom att tillämpa cyanoakrylatlim på den övre änden av rören, för att säkerställa att rörelsen är förenlig med Microdrive. Skruva på Microdrive hela vägen till toppen.
- Applicera Soft Petroleum (se tabell över material) på utsatt tetrode och ledningar inuti Microdrive bostäder för att förhindra rörelse.
- Skär en 12 mm x 14,5 mm petriskål botten fönster med en uppvärmd rakblad. Fäst fönstret på framsidan av Microdrive bostäder med epoxi. Håll Jordledningarna utanför fönstret.
- Applicera RTV beläggning på utsatta tetrodes och ledningar mellan logger Box Cover och Microdrive bostäder.
- Efter RTV är botad, Stäng lådan med en liten vikt inuti, och dränkar i vatten över natten för att säkerställa att det inte finns någon vattenläckage i lådan.
- Skär tetroderna och referens tråden till önskad längd med vassa saxar.
- Fäst den markerade extruderade polystyren skum (se tabell över material) till boxen. Justera dess storlek så dess bärighet är balanserad när nedsänkt i ett vattenbad.
- Doppa tetrode tips i platina svart lösning och använda en likström (-0,2 μA) för att belägga elektroderna och ställa in elektrodernas impedans som önskas. Använd en impedanstestare för multielektrod (se tabell över material) för mätning av beläggning och impedans.
Anmärkning: I guldfisk pallium, ett värde av 40 kOhm är bäst. Beroende på applikation kan elektrodanimpedansen justeras genom att platina-svart beläggningen ändras till10,11.
5. anestesi beredning — 1% MS-222 stamlösning
Försiktighet: Anestesi beredning omfattar användning av pulveriserad MS-222, en carcinogen. Därför måste steg 5,2 och 5,3 göras i en kemisk huva med handskar.
- Tillsätt 100 mL vatten till ett rör som kan innehålla mer än 100 mL.
- I en kemisk huva, placera en disponibel viktnings skylt på en skala. Tillsätt 1 g MS-222 pulver med en spatel, tillsätt sedan pulvret till röret.
- Skaka röret väl.
Anmärkning: I flytande form, MS-222 kan användas utanför den kemiska huven bär handskar men kräver inte en mask. - Placera en engångsviktningsplattan på en skala. Tillsätt 2 g natriumbikarbonat med hjälp av en spatel, tillsätt sedan pulvret till röret. Skaka röret väl.
6. förbereda fisk skallen
Anmärkning: I detta skede är fisken redo för implantatkirurgi. Före operationen, se till att alla komponenter och tillbehör har steriliserats genom lämpliga förfaranden. För detta steg, en out of Water U-formad fisk hållare behövs. I detta protokoll, en aluminium hållare som passar en 15 cm huvud till svans lång guldfisk används. Detta system håller fisken ur vattnet och parfymera gälarna med syrat vatten. För mer information se Vinepinsky et al.8.
- Placera fisken i ett 0,02% MS-222 vattenbad i 20 min tills fisken är sovande.
- Använd sterila handskar, ta fisken ur vattnet och placera den i hållaren.
Anmärkning: Den syrade vatten parfymerade fisken innehåller MS-222 vid en koncentration av 0,02%, så att fisken förblir sövda under operationen. - Med hjälp av en steril spatel, applicera lidokain 5% pasta på huden ovanför den utsedda platsen för kirurgi för 10 min, ta sedan bort lidokain.
Anmärkning: Konsultera en lämplig hjärn Atlas för att rikta in sig på den specifika hjärnregionen. - Med en steril 15 blad skalpell, ta bort huden ovanför skallen i regionen av implantatet.
- Borra 4 hål i skallen med hjälp av en tandborr med 0,7 mm borrkronor. Sätt in en 1 mm skruv (3 mm lång) i varje hål och applicera cyanoakrylatlim på hålen precis innan du sätter i skruven.
- Använd en Dental burnisher, applicera tandcement på skruvarna och på periferin av den exponerade skallen.
- Med hjälp av tandborren, göra en 5 mm diameter hål i skallen ovanför hjärnan regionen av intresse. Ta bort fettvävnaden mellan skallen och hjärnan och exponera hjärnan regionen målet med hjälp av fina pincett och mjuk vävnad papper. Var noga med att inte skada de stora blodkärlen under skallen.
Anmärkning: I slutet av detta skede är fisken beredd att implantatet sonden. Här beskrivs endast de viktigaste stegen som är specifika för detta protokoll. Flera postoperativa procedurer (såsom detaljerad dokumentation om djurens hälsa och sterilisering av kirurgi verktyg och område) presenteras inte eller diskuteras eftersom de är tillämpliga på alla operationer med fisk eller små djur.
7. implantera sonden
Anmärkning: För att slutföra det sista steget i protokollet, en manipulator som kan hålla implantatet på plats när den sätts in i hjärnan behövs.
- Använd manipulatorn för att hålla logger Box Cover med tetrodes pekar ner mot fisken hjärnan.
- Böj referenselektroden så att när tetroderna sänks ner i hjärnan stannar referensen utanför hjärnan.
- Skär grunderna så att de passar in i skallen. Alternativt kan du ansluta en jordkabel till en av skallskruvarna.
- Sänk implantatet så att elektroderna sätts in i hjärnan medan den nedre delen av Microdrive bostäder är nära skallen.
- Börja fästa implantatet på skallen genom att applicera en liten mängd tandcement mellan höljet och närmaste skallskruv.
- Efter den första delen av tandcement är botad, applicera tandcement och Stäng hålet ovanför skallen och hela den exponerade skallen.
Anmärkning: Vanligtvis behövs flera omgångar av tandcement applikationer för att täcka hela den exponerade skallen. - Installera logger och batteriet i lådan och täta lådan med alla skruvar.
- Applicera antibiotika och lokala smärtstillande medel beroende på vilken typ av fisk som används för experimenten.
- Spola fiskens gälar med friskt vatten tills fisken börjar vakna. Ta bort fisken från hållaren och sätt tillbaka den i sin hem tank.
Anmärkning: Fisken är helt återställd inom 60 min efter operationen. - Se till att fisken kan simma fritt med implantatet (figur 3, kompletterande video 1). Om det behövs, justera storleken på extruderade polystyren skum ovanför logger rutan så att fisken kan balansera lätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under en inspelnings session guldfisk simmat fritt i en kvadrat vattentank medan neurala aktiviteten i dess telencephalon spelades in. Målet med dessa experiment var att studera hur den neurala aktiviteten hos enstaka celler bestämmer fiskens beteende. För att göra detta, behövde tillsatta verksamhet identifieras i de inspelade data. Hjärnaktiviteten, samtidigt som den registreras, var digitaliserad på 31 250 Hz och High-pass filtreras på 300 Hz av datalogger. Sedan, offline, tillämpades ett band-pass filter (300 − 5000 Hz) på signalerna, och de försorterade rådata var separerade i varje tetrode kanaler och referens kanal (figur 4a). Nästa, gemensamma Spike sortering algoritmer12 användes för att karakterisera enstaka cell aktivitet. Först filtrerades varje kanal manuellt av tröskelvärdet för minimal överföringskamplitud (i förhållande till ljudnivåerna för varje kanal). Sedan, eftersom tetrodes tips är inte på samma plats, och referenselektroden var utanför hjärnan, spikar som dök upp i mer än en tetrod eller i referens kanalen var också filtreras. Den filtrerade data sedan manuellt klustrade och filtreras efter form, längd, Inter-Spike intervall (tiden mellan efterföljande åtgärder potentialer måste följa den refraktära perioden av nervceller), och genom huvudsaklig komponent analys (PCA). Exempel på enkel cells kluster jämfört med bokades-och Noise-kluster presenteras i figur 4.
Figur 1: implantat montering. (A) Microdrive, gjord av ett stift huvud, mässing plattor, och en skruv. (B) Microdrive-hölje, tillverkat av en enda mässingsplåt genom vikning. (C) Microdrive-aggregat som tillverkats med Microdrive (a) och höljet (B). D) tetrode-arrayen gjordes med hjälp av EIB-16, två tetroder, en referenselektrod och grunder för anslutning till en kontakt (se tabell över material). (E) och (F) Microdrive implantat församling är ansluten till den vattentäta logger Box Cover. Den tetrode Assembly Connector är placerad inuti lådan och tetrodes är limmade till Microdrive. (G) logger Box Base där logger och batteriet är placerade. O-ringen runt basen används för tätning. (H) enstaka rad manliga stift huvuden remsa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: teknik för bostads vikning i Microdrive. (A) börja med en 1 mm bred mässingsplåt och gör fyra slitsar. (B) vik den mellersta delen av sidan inåt. (C) vik den övre delen bakåt och den nedre delen inåt. (D) borra tre 3 mm hål i toppen. (E) gravera en 1 mm halvcirkel på botten. (F) borra ett hål på 1 mm mitt på ovansidan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: inspelning från en fritt beter Goldfish. (A) tetroderna implanteras i fisk hjärnan och församlingen är ansluten till fiskens skalle. (B) boxen är förseglad med logger inuti. (C-E) En fisk simmar fritt med församlingen efter operationen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat. (A) inspelning 0,5 s lång från en fritt simning fisk 24 h efter operationen. Signalen filtreras med ett bandpassfilter (300 − 10000 Hz). Det finns ingen hög amplitud brus i referenselektroden, vilket indikerar en brist på rörelse artefakter. Det finns inga actionpotentialer i den andra tetrode (gröna kanaler). De första elektrod data visas i de bruna kanalerna. Blå och röda stjärnor indikerar spikar från blått och rött kluster som visas i panelerna B respektive C. (B) spik former av två olika kluster av enstaka nervceller, inspelade från tetrode 1. C) projektion av de första tre huvudkomponenterna i uppgifterna från den första tetrode av alla toppkandidater som passerat tröskeln. Blå och röda kluster motsvarar blå och röda spik former från panel B. grå prickar representerar neurala brus eller bokades aktivitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video 1: simning mönster: exempel på guldfisk en dag före implantation kirurgi (vänster) och en dag efter (höger). Video visar liknande simning mönster, vilket indikerar att fisken inte hindras av kirurgi. Video hastigheten är x 1.8. Vänligen klicka här för att se denna video (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande figur 1: diagram över logger Box huvud kammare. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: diagram över logger Box Cover. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3: diagram över EIB-16-avdelningens omslag. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 4: diagram över mässings plattan som används för Microdrive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsfil 1: bostads diagram. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll specificerar de steg som ingår i att implantera en tetrode array i telencephalon av fritt simning guldfisk. Denna teknik implementerar en neural logger som förstärker och registrerar de signaler som förvärvats från upp till 16 kanaler tillsammans med en Microdrive som kan justera tetrode position i hjärnan. Microdrive gör det möjligt att justera positionen i hjärnan för att optimera inspelningen.
Detta protokoll kan lätt ändras för inspelning från andra hjärnregioner (se Vinepinsky et al.8 för inspelning från Optic tectum med en liknande teknik) eller någon annan vattenlevande djur 15 cm lång eller större (ungefär lika med en guldfisk huvud till svans, ~ 100 gram vikt). Dessutom kan protokollet ändras så att det fungerar med alla datalogger så länge det kommunicerar med en frekvens som kan tränga in i vattnet. Logger används här kommunicerar med hjälp av en radiofrekvens på 900 MHz och kan kommunicera genom ca 20 cm vatten. En radiofrekvens på 2,4 GHz kan också tränga igenom ~ 15 cm färskvatten. Lägre frekvenser och andra alternativ kan ge ännu bättre resultat13,14,15. Det protokoll som presenteras här används en två-tetrode array med åtta inspelnings kanaler. Dessutom kan protokollet ändras för att införliva andra sond geometrier såsom en tråd array16 eller silikon sonder9.
Det finns flera fördelar med att använda en datalogger över en fullständig telemetri inspelningssystem eller ett system med ansluten. För det första ger trådlös kommunikation brus till inspelningen. Därför kommer fullständig överföring av data att minska signalkvaliteten. Loggning av data säkerställer dessutom att inga data förloras om kommunikationen misslyckas. Dessutom tillåter trådlösa system fisken att simma fritt, till skillnad från i tjudrade djur. Slutligen, detta protokoll har utvecklats för att spela in åtgärder potentialer men kan också användas för att spela in lokala fält potentialer genom att ställa logger analog High-pass filter till 1 Hz istället för 300 Hz. En nackdel med logger är behovet av att fysiskt Ladda ner data och byta ut batteriet när det rinner ner.
Microdrive föreslås i protokollet avsevärt ökar sannolikheten för inspelning av enstaka cell aktivitet. Utan Microdrive enheten, de implanterade tetrodes placeras ungefär i samma inspelningsplats i hjärnan för hela tiden fisken testas. Detta begränsar fysiskt sannolikheten för att spela in flera enstaka nervceller från samma fisk, och därför begränsar inspelningen avkastningen per fisk. Det faktum att den specifika inspelningsplatsen i hjärnan förblir okänd tills efter operationen stärker behovet av en rörlig anordning som gör det möjligt att flytta elektroderna i hjärnan efter fixering också.
Ett viktigt inslag i detta protokoll som utelämnades för tydlighetens skull är bestämningen av elektrodens impedans. Elektroden impedansen kan justeras genom val av tråddiameter (dvs. en högre diameter leder till lägre impedans), tråd sammansättning (t. ex., volfram eller nikrom), och elektrod beläggning (t. ex. platina svart för volfram och guld för Nichrome) som ger ledningar med lägre diametrar och lägre impedans. Eftersom alla dessa parametrar är avgörande för framgången för neuronala inspelningar, är läsaren starkt uppmuntras att konsultera den stora litteraturen om detta ämne, inklusive Harris et al.17.
Notera vikten av referenselektroden för att upptäcka eventuella externa bullerkällor i systemet. Referenselektroden är en relativt låg impedanselektrod som sätts in i skallen men är utanför hjärnan. Eftersom det inte kommer i kontakt med hjärnvävnad, det registrerar signalens signatur, som består av termiskt brus, rörelse artefakter, och yttre buller. De stora bullerkällorna i detta system är rörelse artefakt och kommunikations ljud som kan styras och tidsinställda av Logger. Dessa ljud kan lätt upptäckas av signaturen de ålägger på signalen från referenselektroden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Nachum Ulanovsky och medlemmarna i Ulanovsky Lab för all deras hjälp. Dessutom är vi tacksamma för tal Novoplansky-Tzur för hjälpsam teknisk assistans. Vi erkänner tacksamt finansiellt stöd från ISRAEL SCIENCE FOUNDATION-första programmet (Grant nr 281/15), och Helmsley välgörenhets förtroende genom jordbruk, biologisk och kognitiv Robotics initiativ av Ben-Gurion University of the Negev.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm round drill bits | Compatible with the drill. | ||
| 15 blade Scalpel | Sigma-Aldrich | ||
| 16 channel PCB board | Neurlynx | EIB-16 | |
| 1x3M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 1x3M phillips round head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 27 cm x 19 cm x 1 mm brass plate | See Figure 2 | ||
| 2x6M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 3140 RTV coating | Dow Crowning | 2767996 | |
| 75 µm Silver wire | A-M Systems | ||
| Brass machine screws #00-90 | 947-1006 | ||
| Brass plates 7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm | A 3D drawing is provided. See supplementary 1 | ||
| Coated Tungsten wire 25µm | California Fine Wire Company | 5000160 | Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000) |
| Coated Tungsten wire 50 µm | A-M Systems | 795500 | Can be replaced with any other wire with low impedance |
| Cyanoacrilic glue | |||
| Dental Burnisher | ComDent UK | Any small sterille stainless-still tool will do. | |
| Dental cement - GCFujiPLUS | GC | 431011 | Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other. |
| Dental drill or nail polish drill | Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement. | ||
| Drill bit #65 | 947-65 | ||
| Fast curing epoxy | Any 5 min curing epoxy can be used here. | ||
| Logger box with O-ring sealing | A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger. | ||
| Motorized turning device | Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means. | ||
| Mouselog-16 Neural logger | Deuteron Technologies Ltd | There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam | |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% |
| Nano-Z plating | White Matter LLC | The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics. | |
| PCB pins | Neurlynx | Neuralynx EIB Pins | |
| Polymide tubing 250 µm | A-M Systems | 822000 | |
| Rechargable battery | 3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time. | ||
| Silicone tubing 0.64 mm | A-M Systems | 806100 | |
| Stainless steel 1.5 mm | A-M Systems | 846000 | |
| Sudium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Tap #00-90 | 947-1301 | ||
| Vaseline | Any type of soft petroleum skin protectant can be used here. |
References
- Jacobson, M., Gaze, R. M. Types of visual response from single units in the optic tectum and optic nerve of the goldfish. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 49 (2), 199-209 (1964).
- Ben-Tov, M., Donchin, O., Ben-Shahar, O., Segev, R. Pop-out in visual search of moving targets in the archer fish. Nature Communications. 6, 6476 (2015).
- Zottoli, S. J. Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).
- Canfield, J. G., Rose, G. J. Activation of Mauthner neurons during prey capture. Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. Journal of Neuroscience Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Vanwalleghem, G. C., Ahrens, M. B., Scott, E. K.
- Vinepinsky, E., Donchin, O., Segev, R. Wireless electrophysiology of the brain of freely swimming goldfish. Journal of Neuroscience Methods. 278, 76-86 (2017).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3568 (2012).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators A: Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Arcot Desai, S., Rolston, J. D., Guo, L., Potter, S. M. Improving impedance of implantable microwire multi-electrode arrays by ultrasonic electroplating of durable platinum black. Frontiers in Neuroengineering. 3, 5 (2010).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network: Computation in Neural Systems. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Teixeira, F. B., Freitas, P., Pessoa, L. M., Campos, R. L., Ricardo, M. Evaluation of IEEE 802.11 underwater networks operating at 700 MHz, 2.4 GHz and 5 GHz. Proceedings of the 10th International Conference on Underwater Networks & Systems. , Arlington, VA. (2015).
- Sendra, S., Lloret, J., Rodrigues, J. J., Aguiar, J. M. Underwater wireless communications in freshwater at 2.4 GHz. IEEE Communications Letters. 17 (9), 1794-1797 (2013).
- Lloret, J., Sendra, S., Ardid, M., Rodrigues, J. J. Underwater wireless sensor communications in the 2.4 GHz ISM frequency band. Sensors. 12 (4), 4237-4264 (2012).
- Hoogerwerf, A. C., Wise, K. D. A three-dimensional microelectrode array for chronic neural recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 41 (12), 1136-1146 (1994).
- Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165 (2016).
