Trådlös Elektrofysiologisk inspelning av neuroner genom rörliga Tetroder i fritt simning fisk

Summary

En roman trådlös teknik för inspelning extracellulära neurala signaler från hjärnan av fritt simning guldfisk presenteras. Inspelningsenheten består av två tetroder, en Microdrive, en neural datalogger och ett vattentätt fodral. Alla delar är skräddarsydda med undantag för datalogger och dess koppling.

Abstract

De neurala mekanismerna som styr fisk beteendet är fortfarande mest okända, även om fisken utgör majoriteten av alla ryggradsdjur. Förmågan att spela in hjärnans aktivitet från fritt rörliga fisken skulle främja forskning om den neurala grunden för fisk beteende avsevärt. Dessutom är exakt kontroll av inspelningsplatsen i hjärnan avgörande för att studera koordinerad neurala aktivitet mellan regioner i Fish Brain. Här presenterar vi en teknik som registrerar trådlöst från hjärnan av fritt simning fisk samtidigt kontrollera för djupet av inspelningsplatsen. Systemet är baserat på en neural logger i samband med ett nytt vatten-kompatibelt implantat som kan justera inspelningsplatsen genom Microdrive-kontrollerade tetrodes. Funktionerna i systemet illustreras genom inspelningar från telencephalon av Goldfish.

Introduction

Fisk är den största och mest skiftande grupp av ryggradsdjur, och liksom andra ryggradsdjur de uppvisar komplexa kognitiva förmågor såsom navigering, umgänge, sova, jakt, etc. Icke desto mindre, de neurala mekanismerna styr fisk beteende kvar för det mesta okända.

Under de senaste decennierna, extracellulära inspelningar från immobiliserad fisk har i första hand genomförts för att undersöka olika aspekter av den neurala grunden för beteende^1,2. Även om denna teknik är lämplig för vissa sensoriska system, är utredning av hela spektrumet av den neurala grunden för beteende svårt om inte omöjligt i immobiliserade djur. De första framstegen innebar inspelning från Mauthner celler av tjudrad simning fisk^3,4. Men Mauthner celler är oproportionerligt stora och den inspelade åtgärden potentiella amplituder, som kan gå så högt som några mV, underlätta inspelningen. Senare, Canfield et al. beskrev ett konceptbevis när du använder en tjudrad djur att spela in från telencephalon av Fish⁵. En annan ny teknik för inspelning Neural aktivitet från fisk är kalcium avbildning (se recensioner av orger och de Polavieja⁶, och Vanwalleghem et al.⁷). Denna teknik utvecklades för användning med zebrafiskar larver eftersom huden och skallen är transparenta under den larv skede. Denna teknik kan dock inte användas för att studera komplexa beteenden i senare utvecklingsstadier.

Här presenterar vi en ny teknik för att spela in extracellulär neurala aktivitet från hjärnan av fritt simning fisk. Detta är en modifierad version av protokollet som beskrivs i Vinepinsky et al.⁸. Den viktigaste nyheten är tillägget av en Microdrive som gör det möjligt att kontrollera positionen av elektroderna efter operationen. Tekniken är utformad för inspelning från telencephalon av guldfisk med hjälp av en uppsättning tetrodes som är anslutna till en neural data logger via en Microdrive. Hela installationen är trådlös och förankrad i fiskens skalle. Den specifika vikten av systemet utjämnade till den vattenspecifika vikt genom att lägga till en liten flottör som gör att fisken att simma fritt.

Tekniken bygger på användning av en neural datalogger som förstärker, digitaliserar och lagrar signalen i en onboard-minnesenhet. Logger-telemetrisystemet används för att starta och stoppa inspelningarna och för synkronisering med videokameran. I detta protokoll, en 16-kanals neurala logger används, inbäddad i en vattentät låda tillsammans med Microdrive.

Microdrive-enheten är tillverkad av två huvudkomponenter: själva Microdrive och Microdrive-höljet (figur 1A, B). Huset rymmer Microdrive och tetrodes, och fungerar även som ankare mellan skallen och logger Box (figur 1C). PVC logger Box är tillverkad med en maskin process och förseglas med hjälp av en O-ring (figur 1E-G, se även kompletterande figur 1, kompletterande figur 2, och kompletterande figur 3 för ett tredimensionellt [3D] diagram). I ena änden är en bit polystyrenskum fäst vid logger box för att kompensera för vikten av implantatet och förse fisken med ett flyt-neutralt implantat. Byggandet av Microdrive som beskrivs i protokollet följer det förfarande som presenteras av Vandecasteele et al.⁹ med en modifiering för att fästa Microdrive till huset (figur 1a). Alla större steg presenteras.

Det förfarande som beskrivs i protokollet för att förbereda fisk skallen liknar den som presenteras i Vinepinsky et al.⁸ och beskrivs kortfattat i protokollet. En dag efter operationen, fisken är normalt helt återhämtat sig från effekterna av anestesi och är redo för beteendemässiga experiment. Observera att tetrode-platsen kan justeras genom att vrida på Microdrive-skruven. Skruven har ett mellanrum på 300 μm per full rotation och en befordran av 75 μm rekommenderas tills mål hjärn platsen nås. En lämplig hjärna Atlas bör konsulteras för att rikta den specifika hjärnregionen av intresse. Det är tillrådligt att testa elektroden impedansen varje gång fisken är sövda för batteri eller minneskort ersättning.

Protocol

Alla kirurgiska ingrepp måste godkännas av de lokala Etikkommittéerna för djurens välbefinnande (t. ex. IACUC). 1. konstruktion av Microdrive-huset För att konstruera huset, skär en 1 mm bred mässingsplåt i en 19 mm x 29 mm x 1 mm plåt med en såg. Skär två 5,5 mm slits på varje långsida vinkelrätt mot kanten, så att varje slits är 6,5 mm bort från de smala sidorna (figur 2a). Med hjälp av tång, vik området…

Representative Results

Under en inspelnings session guldfisk simmat fritt i en kvadrat vattentank medan neurala aktiviteten i dess telencephalon spelades in. Målet med dessa experiment var att studera hur den neurala aktiviteten hos enstaka celler bestämmer fiskens beteende. För att göra detta, behövde tillsatta verksamhet identifieras i de inspelade data. Hjärnaktiviteten, samtidigt som den registreras, var digitaliserad på 31 250 Hz och High-pass filtreras på 300 Hz av datalogger. Sedan, offline, till…

Discussion

Detta protokoll specificerar de steg som ingår i att implantera en tetrode array i telencephalon av fritt simning guldfisk. Denna teknik implementerar en neural logger som förstärker och registrerar de signaler som förvärvats från upp till 16 kanaler tillsammans med en Microdrive som kan justera tetrode position i hjärnan. Microdrive gör det möjligt att justera positionen i hjärnan för att optimera inspelningen.

Detta protokoll kan lätt ändras för inspelning från andra hjärnreg…

Materials

0.7 mm round drill bits			Compatible with the drill.
15-blade Scalpel	Sigma-Aldrich
16 channel PCB board	Neurlynx	EIB-16
1X3M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
1X3M phillips round head screws			Stainless steel. Any type.
27 cm X 19 cm X 1 mm brass plate			See Figure 2
2X6M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
3140 RTV coating	Dow Crowning	2767996
75 µm Silver wire	A-M Systems
Brass machine screws #00-90		947-1006
Brass plates 7.5mm X 2.5mm X 0.6mm			A 3D drawing is provided. See supplementary 1
Coated Tungsten wire 25µm	California Fine Wire Company	5000160	Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000)
Coated Tungsten wire 50µm	A-M Systems	795500	Can be replaced with any other wire with low impedance
Cyanoacrilic glue
Dental Burnisher	ComDent UK		Any small sterille stainless-still tool will do.
Dental cement – GCFujiPLUS	GC	431011	Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other.
Dental drill or nail polish drill			Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement.
Drill bit #65		947-65
Fast curing epoxy			Any 5 minutes curing epoxy can be used here.
Logger box with O-ring sealing			A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger.
Motorized turning device			Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means.
Mouselog-16 Neural logger	Deuteron Technologies Ltd		There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98%
Nano-Z plating	White Matter LLC		The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics.
PCB pins	Neurlynx	Neuralynx EIB Pins
Polymide tubing 250µm	A-M Systems	822000
Rechargable battery			3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time.
Silicone tubing 0.64 mm	A-M Systems	806100
Stainless steel 1.5 mm	A-M Systems	846000
Sudium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S9625
Tap #00-90		947-1301
Vaseline			Any type of soft petroleum skin protectant can be used here.