Summary
Vi beskriver en utvidet frykt-condition protokoll som produserer overtrening og frykt inkubasjon hos rotter. This protocol entails a single training session with 25 tone-shock pairings (i.e., overtraining) and a comparison of conditioned freezing responses during context and cue tests 48 h (short-term) and 6 weeks (long-term) after training.
Abstract
Følelsesmessig minne har først og fremst blitt studert med frykt-condition paradigmer. Frykt kondisjonering er en form for læring der enkeltpersoner lærer forholdet mellom aversive hendelser og ellers nøytrale stimuli. De mest brukte prosedyrene for å studere følelsesmessige minner medfører frykt kondisjonering hos rotter. I disse oppgavene er den ubetingede stimulansen (US) et fotsjokk presentert en eller flere ganger på tvers av enkle eller flere økter, og den betingede responsen (CR) fryser. I en versjon av disse prosedyrene, kalt cued fear condition, er en tone (betinget stimulans, CS) forbundet med fotskjelv (US) under treningsfasen. Under den første testen blir dyr utsatt for samme kontekst der trening fant sted, og fryseresponser testes i fravær av fotskjelv og toner (det vil si en konteksttest). Under den andre testen måles frysing når konteksten endres (f.eks. ved å manipulere lukten og veggene i det eksperimentelle kammeret) og tonen presenteres i fravær av fotskjelv (det vil vil at en cue test). De fleste cued frykt condition prosedyrer medfører få tone-sjokk sammenkoblinger (f.eks 1-3 studier i en enkelt økt). Det er en økende interesse for mindre vanlige versjoner som involverer et omfattende antall sammenkoblinger (det vil si overtrening) knyttet til den langvarige effekten som kalles fryktinkubasjon (det vil si fryktresponser øker over tid uten ytterligere eksponering for aversive hendelser eller betent stimuli). Utvidede frykt-condition oppgaver har vært nøkkelen til forståelsen av frykt inkubasjon atferdsmessige og nevrobiologiske aspekter, inkludert forholdet til andre psykologiske fenomener (f.eks posttraumatisk stresslidelse). Her beskriver vi en utvidet frykt-condition-protokoll som produserer overtrening og frykt inkubasjon hos rotter. This protocol entails a single training session with 25 tone-shock pairings (i.e., overtraining) and a comparison of conditioned freezing responses during context and cue tests 48 h (short-term) and 6 weeks (long-term) after training.
Introduction
Minne er en psykologisk prosess som omfatter ulike faser: informasjonsinnhenting, konsolidering (muliggjør stabilitet av ervervet informasjon), og gjenfinning (bevis for konsolideringsprosessen)1. I konsolideringsfasen oppstår etablering av nye synaptiske tilkoblinger og endring av eksisterende tilkoblinger. Dette antyder nødvendigheten av en periode der molekylære og fysiologiske hendelser som er ansvarlige for disseendringene, forekommer 1,2. Disse fysiologiske eller molekylære endringene varierer om de hentede hendelsene er følelsesmessig ladet eller ikke (det vil si følelsesmessig minne). For eksempel har forskning vist at sidekjernen og basolateral amygdala-komplekset er spesielt relevant for følelsesmessig minne3,4,5.
Emosjonelle minne fenomener har blitt primært studert med frykt condition paradigmer5,6. Frykt condition er en form for læring der enkeltpersoner lære forholdet mellom aversive hendelser og ellers nøytrale stimuli7. Frykt condition paradigmer produsere molekylære, cellulære, og strukturelle endringer i amygdala. I tillegg endrer frykt kondisjonering tilkobling av hippocampus under konsolidering og gjenfinningsprosesser av følelsesmessig minne.
En av de mest brukte prosedyrene for å studere fryktminner er klassisk (Pavlovian) condition hos rotter. Denne fremgangsmåten bruker vanligvis fotsjokk (US) som aversiv stimulans, som leveres én eller flere ganger på tvers av en eller flere økter. Den betingede responsen (CR) av rotter eksponert for denne prosedyren er frysing (det vil si "generalisert immobilitet forårsaket av en generalisert tonic respons av dyrenes skjelettmuskulatur unntatt de musklene som brukes i pusten"7 ). Dette svaret kan vurderes på to typer tester: kontekst- og køtester. For konteksttesten gjennomgår motivet et gitt antall fotskjelv under treningsøkten, og fjernes deretter fra det eksperimentelle kammeret for en definert tid. Under testen returneres motivet til samme kontekst der treningen fant sted, og ulike tiltak for frysing samles inn i fravær av fotskjelv (f.eks. varighet, prosentandel eller hyppighet av fryseepisoder), og sammenlignet med baselinenivåer etablert i treningsfasen. For den andre typen test, cue test, en stimulans (vanligvis en tone) er forbundet med fotskjelv under treningsfasen (det vil vilå betinget stimulans, CS). Etter at treningen er fullført, fjernes dyret fra treningskonteksten for en definert tid og plasseres deretter i en modifisert sammenheng (f.eks. et annet eksperimentelt kammer som har forskjellige former for vegger og forskjellig lukt). Signalet blir deretter presentert et gitt antall ganger, og frysing svar på signalet måles og sammenlignes med baseline nivåer samlet under trening. Den vanligste versjonen av dette paradigmet bruker 1 til 3 tonesjokksammenkoblinger under en enkelt treningsøkt, etterfulgt av kontekst- og køtester utført en rekke timer eller noen dager senere.
Andre mindre ofte implementert frykt condition prosedyrer innebære et omfattende antall sjokk-cue sammenkoblinger (det vil vil vil at studier), som ofte har blitt kalt overtraining prosedyrer8. En økende interesse for disse oppgavene er knyttet til deres langvarige og økte minneeffekter kalt fryktinkubasjon (det vil si at bevisste fryktresponser øker over tid i fravær av ytterligere eksponering for aversive hendelser eller bevisste stimuli)9,10,11. Et eksempel på slike overtreningsprosedyrer innebærer en treningsfase på 100 tonesjokksammenkoblinger fordelt på 10 økter, etterfulgt av kontekst- og køtester utført 48 timer og 30 dagersenere 11,,12. For å unngå omfattende trening spredt over flere dager, Maren (1998) rapporterte at overtrening kunne etableres og optimaliseres i en enkelt økt med 25sammenkoblinger 8. Inkubasjonseffekten fremgår i signifikant høyere nivåer av betinget frykt hos rotter testet 31 dager etter trening, sammenlignet med rotter testet 48 timer etter. Utvidede frykt-condition oppgaver har vært nøkkelen for forståelsen av atferdsmessige og nevrobiologiske aspekter underliggende frykt inkubasjon, inkludert forholdet til andre psykologiske fenomener (f.eks forsinket utbruddet posttraumatisk stresslidelse)11,12,13.
Her beskriver vi en utvidet frykt-condition-protokoll som induserer overtrening og frykt inkubasjon hos rotter. Forskjellig fra andre paradigmer som krever flere dager medtrening 11,er den nåværende protokollen fokusert på en enkelt treningsøkt8. Vi brukte 25 tonesjokksammenkoblinger for å produsere høyere bevisste fryseresponser under kontekst og cue tester utført 6 uker etter trening, sammenlignet med tester utført 48 timer etter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Fundación Universitaria Konrad Lorenz (IACUC-KL). Den universelle erklæringen om dyrs rettigheter utstedt av International League of Animal Rights, Genève, Sveits (1989), og etiske prinsipper for eksperimentering med dyr utstedt av ICLAS ble respektert.
1. Forberedelse av emne
- Velg mannlige voksne Wistar rotter (n = 12). Hus dem i grupper på fire per bur i tre dager med akklimatisering, før begynnelsen av trenings- og testprotokollen. Gi rotter gratis tilgang til vann gjennom hele eksperimentet. Kontroller romtemperaturen mellom 20 °C og 25 °C, under en 12-timers lys-mørk syklus (lyser på kl. 07:00).
MERK: Rottestammer hadde vist differensialytelse under fryktkondisjonering. For eksempel rapporterte Schaap et al. (2013) at Wistar og Lewis stammer viste lengre varighet av frysing atferd sammenlignet med Fawn Hooded og Brown Norway rotter12. Dermed bør forskjeller i smerte og termisk terskel vurderes for å justere intensiteten og varigheten av sjokk. - Opprettholde rotter på 85% av sine fri-fôring vekter (normal vekt mellom 350-400 g) ved å gi begrenset mat tilgang på samme time hver dag. Vei rotter hver dag på samme time i lyssyklusen. Beregn ad lib vekt (100% vekt) i tre dager før starten av utvidet frykt-condition trening.
MERK: Dyr som brukes i det nåværende eksperimentet ble testet på flere instrumentelle tester som ikke er rapportert her inne. Matmangel var nødvendig for de ekstra testene. Denne prosessuelle variasjonen antas som sannsynlig å utvide omfanget av den nåværende prosedyren, da det antyder potensialet for instrumental-frykt kombinerte tester. Studier som bruker bare frykt kondisjoneringstester, vil imidlertid ikke kreve matmangel. - Tilfeldig tildele til en av følgende grupper: emosjonell testing 6 uker etter trening (n = 6); emosjonell testing 48 timer etter trening (n = 6).
- Utfør trening og tester på lignende tidspunkter, i lysfasen av mørk lyssyklus. Tilordne dyrene til samme eksperimentelle kammer og opprettholde samme rekkefølge av dyr under trening og testing.
MERK: En ekstra kontroll som kan implementeres er å motvirke rekkefølgen på dyr under trening og testing faser. Vi anbefaler at du bruker denne teknikken når multiplergrupper vurderes, eller ulike oppgaver brukes på tvers av eksperimenter, for å redusere en mulig effekt av oppgaverekkefølge på virkemåte.
2. Innstilling av apparater og støtkalibrering
- Rengjør alle de indre overflatene av det eksperimentelle kammeret og rustfritt stålgittergulvet med 10% etanol. Gjenta før du tester hvert dyr.
- Koble utstyret til en datamaskin ved hjelp av en USB-kabel og start det iskalde deteksjonssystemutstyret: CPU, kontrollskapet, det infrarøde lyset, den aversive stimulatoren / scrambleren og kalibratoren med støtintensitet.
MERK: Selv om denne protokollen ble utført ved hjelp av kommersielt tilgjengelige instrumenter (Table of Materials), kan utstyr og programvare av forskjellige merker brukes. Apparatet består av et internt akryl firkantkammer (29,53 cm x 23,5 cm x 20,96 cm, kalt det eksperimentelle kammeret) innebygd i en trekasse dekket med plastformikrofon. De utvendige dørene tillater isolering av lyd, støy eller lys (dempende boksdører). Kameraet er plassert sidealt i den indre delen av den ytre døren. Den interne akrylboksen med gulvmetallgitter (36 stenger i rustfritt stål, hver og en av 3 mm diameter og fordelt 8 mm, midten til midten) tillater fotsjokklevering. I en av de indre sideveggene ligger en høyttaler 6 cm fra gulvet for å presentere et auditivt signal. - Koble de røde og svarte klipsene til kalibratoren med støtintensitet (f.eks. positive og negative kontakter) til to forskjellige stenger på rutenettet. Koble USB-kabelen til den tilsvarende porten på datamaskinen. Pass på at du kobler de røde og svarte klipsene til stolper atskilt med en annen stolpe.
MERK: Denne delen beskriver kalibreringsprosessen for støtintensitet ved hjelp av et bestemt utstyrsmerke som er nevnt i Materials tabell. Kalibreringsprosessen kan imidlertid utføres ved hjelp av ulike merker av utstyr. Det anbefales å kalibrere intensiteten av sjokket i tre sektorer av rutenettet for å bekrefte at det er konsekvent. I tillegg må du alltid fjerne fekale og urinrester fra gittergulvet for å unngå forstyrrelser under levering av sjokket. - Start kalibratorprogramvaren for støtintensitet (Materials tabell). Velg en intensitet på 1,0 mA i programmet ved å klikke på områdepilen. Deretter endrer du Run/Stop-bryteren til Kjør.
MERK: Vi foreslår 1,0 mA basert på våre studier med gnagermodeller i vårt laboratorium og litteratur som rapporterer et område fra 0,75 mA til 1,5 mA som tilstrekkelig for studier av frykt condition33,,34,,35. - Slå på den aversive stimulatoren eller utstyret som brukes til å levere fotskjelvene og se på sjokkintensiteten som vises på panelet av programmet. Juster om nødvendig intensiteten til 1,0 mA ved hjelp av knotten på aversiv stimulatoren.
MERK: Aversive stimulator bør settes til "OUT" for å teste, kalibrere og kjøre eksperimentet på riktig måte.
3. Kalibrering av frysedeteksjonssystemet
- Lukk det eksperimentelle kammeret og lyd-dempende boksdører. Ikke innsett dyret på dette punktet, da det vil bli plassert i kammeret etter at kalibreringen av frysedeteksjonssystemet er fullført. Kontroller at lysintensiteten inne i boksen er mellom 20 og 30 lux.
- Start programvaren for frysegjenkjenningssystemet, og åpne vinduet Dialog for eksperimentoppsett. Angi detaljene for hvert emne (for eksempel emneidentifikasjonsnummer, dato og gruppe) og last inn filen med tittelen "Training protocol VFC.pro" (tilgjengelig http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ).
MERK: Kontekst- og køtester bruker en annen programkonfigurasjon. Dermed må du passe på å bruke riktig fil på hver test. På dette tidspunktet tilsvarer den riktige filen "Training protocol VFC.pro". Husk at i testfasene vil den tilsvarende filen være forskjellig fra treningsøkten. - Velg de tilsvarende kamera(er) og sjekk Lagre video alternativet (om nødvendig). Sett bevegelsesterskelen til 100, og Min Frysevarighet til 30 bilder.
MERK: Denne bevegelsesterskelverdien er basert på størrelsen på artene som brukes (basert på antall piksler). Minimum freeze duration-verdi anbefales av produsenten. Disse verdiene brukes til å sikre riktig anerkjennelse av dyret i kammeret. - Kontroller at strømutmatingen fra de valgte kameraene vises på skjermen, sammen med bevegelsesterskelen og tidslinjen til de forskjellige stimuliene som presenteres under treningen (f.eks. lyd og sjokk).
MERK: Ved hjelp av et annet merke bør utstyrsoppsettet gi mulighet til å måle dyrets bevegelser for å oppdage en "indeks" av bevegelse som skal tillate sammenligninger på hvor lenge dyret beveger seg eller fryser. En annen mulighet er å bruke en programvare som med bare videokilden (under eller etter eksperimentet) kan oppdage hvor lenge dyret er i bevegelse eller frysing, for eksempel fri programvare ImageFZ13, åpen kildekode verktøykasse i Matlab14, eller en gratis klassifikator av dyrs oppførsel som JAABA15. - Klikk alternativet Kalibrer tre ganger, mens du kontrollerer at bevegelsesindeksen forblir under 100 (terskel). Deretter angir du at utstyret skal låses ved å klikke på den tilsvarende knappen på skjermen.
MERK: Denne delen beskriver en kalibreringsprosess for frysedeteksjonssystem ved hjelp av et bestemt utstyr som er oppført i Materialseksjon. Som nevnt tidligere, kan kalibreringsprosessen utføres ved hjelp av ulike merker av utstyr (for en gjennomgang av ulike alternativer i utstyr og programvare se Anagnostaras et al. 2010)16.
4. Utvidet frykt condition trening
- Transporter rottene i deres hjemmebur, dekket med en klut, fra dyrepleieanlegget til atferdstreningsrommet i laboratoriet. Unngå eksponering for støy eller stressgenererende forhold under transport av dyr til atferdstreningsrommet. Hvis flere dyr transporteres samtidig, bare ta dyrene til å bli testet og vedlikeholde andre rotter i et holdingrom for å forbedre eksperimentell kontroll. Håndter dyrene forsiktig i 2 min før du starter treningen.
MERK: I protokollen ble dyrene håndtert hver dag i 2 minutter før atferdstrening. Etter håndtering ble dyr introdusert i det eksperimentelle kammeret. Vi anbefaler å manipulere dyr for å gjøre rotter habituate til forskeren. - Introdder rotten til det eksperimentelle kammeret. Håndter den forsiktig ved foten av halen og plasser den på midten av kammeret. Lukk det eksperimentelle kammeret og lyd-dempende boksdører.
- Start økten ved å klikke på Post-knappen. La rotten akklimatisere seg til kammeret i 3 min. Denne 3 min perioden er standarden anbefalt av utstyrsprodusenten og fungerer som en baseline og habituation tid til kammeret.
- Lever tjuefem tonesjokk-sammenkoblinger (forsøk) med et 60-s Inter-Trial Interval (ITI), som starter på minutt 3 av økten. Presenter tonen (betinget stimulans - CS; 90 dB SPL, 2000 Hz, 50-ms Rise Time) i løpet av de siste 10 årene av hver ITI, og sjokket (ubetinget stimulans - USA) i løpet av de siste 2 s av hver ITI.
MERK: Aktivering av Opptak-knappen er betinget av at kameraene er riktig kalibrert og låst. - Fjern rotten fra det eksperimentelle kammeret når 28 min økten er over. Returner dyr til det respektive hjemmeburet. Transporter rottene i deres hjemmebur dekket med en klut fra det atferdsmessige treningsrommet til dyrepleieanlegget.
- Gjenta kalibreringen av frysesystemet (trinn 3.1-3.5) og frykt kondisjonering (trinn 4.1 og 4.3) for å trene opp alle forsøkspersonene.
MERK: Vi anbefaler på det sterkeste å kalibrere registreringssystemet for hvert dyr for å sikre at programvaren opprettholder de samme parametrene når den behandler informasjon for frysing av deteksjon. - Hvileperiode: I denne perioden har dyrene hvile individuelt i sine hjemmebur. Overvåk dyrenes vekt to ganger per uke i løpet av de 6 ukene av inkubasjonsperioden. Manipuler forsiktig hvert dyr i to minutter mens de vektes.
5. Konteksttest - enkelt 10 min økt
- Etter treningsfasen, utsett dyrene for den første minnetesten kalt konteksttest. I løpet av denne 10 min fasen, utsette rotter til samme sammenheng der trening fant sted, men ikke presentere signaler eller sjokk. Transporter rottene i sine overbygde hjemmebur (f.eks. med en klut) fra dyrepleieanlegget til treningsrommet. Husk at dyr ble delt inn i grupper, og dermed en gruppe er testet 48 timer etter treningfasen og den andre gruppen er testet 6 uker etter trening (se figur 1).
Figur 1: Tidslinjen for eksperimentet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Rengjør alle de indre overflatene av det eksperimentelle kammeret og rustfritt stålgittergulvet med 10% etanol. Gjenta før du tester hvert dyr.
- Gjenta kalibreringen av frysesystemet (trinn 3.1 til 3.5). Åpne vinduet Dialogboksen For eksperimentoppsett, og last inn filen med navnet "Konteksttest protocol.pro", som er tilgjengelig fra http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
MERK: Denne filen inneholder oppsettet for denne eksperimentelle fasen som består av ingen støt eller toner. - Introder dyret til det eksperimentelle kammeret. Håndter den forsiktig ved foten av halen og plasser den på midten av kammeret. Lukk det eksperimentelle kammeret og lyd-dempende boksdører.
- Start økten ved å klikke på Post-knappen. I løpet av denne enkle 10 min kontekst-test økten, ingen stimuli presenteres (sjokk verken lyd).
- Fjern motivet fra det eksperimentelle kammeret når 10 min økten er over. Returner dyrene til sine respektive bur og transporter rottene i deres dekket hjem bur fra atferdstreningsrommet til dyrepleieanlegget. Gjenta trinn 5.2-5.5 for å teste alle fagene.
6. Cue test - enkelt 13 min økt
- En dag etter konteksttesten, har dyr gjennomgå den andre testen av minne kalt cue test. I løpet av denne fasen vil rottene være i en annen sammenheng med trening i løpet av 13 min.; signaler (toner) presenteres, men ingen sjokk er levert. Transporter rottene i deres hjemmebur dekket med et deksel fra dyrepleieanlegget til atferdstreningsrommet. Test en gruppe 72 timer etter frykt kondisjonering trening, og teste en annen gruppe 6 uker og en dag etter trening (Figur 1).
MERK: Et annet transportsystem (fra dyrepleieanlegget til det eksperimentelle rommet) kan implementeres for å skille mer kontekst- og køtester. Siden dyrene ble transportert til treningsøkten og konteksttestøkten i hjemmeburene sine, kunne et annet transportbur, sengetøy og/eller deksel brukes under transport til cue-testøkten. - Rengjør alle de indre overflatene av det eksperimentelle kammeret og rustfritt stålgittergulvet med 10% etanol. Gjenta før du tester hvert dyr.
- For å endre den visuelle konteksten, sett plasten omliggende veggen til det eksperimentelle kammeret.
- For å endre olfaktorisk kontekst, påfør 1% eddiksyre på en bomullstippet vattpinne, og legg den i metallbrettet under rutenettet17,,18,,19.
- Gjenta kalibreringen av frysedeteksjonssystemet (trinn 3.1-3.5). Last inn filen med navnet "Cue test protocol.pro"-filen, som er tilgjengelig fra http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
MERK: Denne filen inneholder oppsettet for denne eksperimentelle fasen, som består av levering av de samme tonene som presenteres under opplæringsfasen (CS), men i fravær av sjokk (US). - Introder dyret til det eksperimentelle kammeret. Håndter den forsiktig ved foten av halen og plasser den på midten av kammeret. Lukk det eksperimentelle kammeret og lyd-dempende boksdører.
- Start økten ved å klikke på Post-knappen. I løpet av den enkle 13 min cue test økten, CS stimulans (tone) presenteres 10 ganger, starter på minutt 3 av økten.
MERK: De første 3 min tilsvarer grunnlinjen for denne økten, etterfulgt av 10 cue test forsøk (det vil si 10 s hver) levert med 50 s ITIer i fravær av sjokk. Levering av toner er automatisk, ved hjelp av den tidligere innlastede filen. - Fjern dyret fra det eksperimentelle kammeret når 13 min økten er over. Returner dyr til det respektive buret og transporter dem dekket til dyrevernsanlegget. Gjenta trinn 6.2 til og med 6.5 for å teste alle forsøkspersonene.
7. Dataanalyse
- Få tak i den generelle aktivitetsindeksen (det vil si bevegelsesindeks) som er avledet fra videostrømmen ved hjelp av programvaren for frysedeteksjonssystemet. Denne programvaren forvandler automatisk bevegelsesindeksen for å gi prosentandelen av frysetid per økt og antall frysing episoder. Sett fryseterskelen til standard innstillingen minimum frysevarighet for systemet (1 s = 30 bilder).
- Bruk det ekstra skreddersydde programmet (fil tilgjengelig fra http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ) for å få:
- Bruk programmet til å bestemme prosentandelen av frysing i løpet av de tre første minuttene av treningsøkten (det vil si grunnlinjefrysing, siden ingen støt eller toner ble presentert før eller i løpet av den 3 min perioden) og i løpet av de første tre minuttene av cue testøkten.
- Bruk programmet til å bestemme prosentandelen av frysing for hver av åtte 3 min hyller av treningsøkten.
- Bruk programmet til å bestemme prosentandelen av frysing under cue presentasjoner (det vil si frysing i toner) og ingen-cue perioder (intertrial intervaller; ITIer), for både trening og cue-test økter.
- Åpne programvaren for frysedeteksjonssystemet for å få tak i disse dataene.
- Velg Fil | Rapporter | Sammendrag av partikomponent .
- Velg filen med filtypen . CMP tilgjengelig fra http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ.
- Gi utdatafilen et navn, og endre bevegelsesterskelen til en 100. Klikk deretter OK.
- Velg filene som skal analyseres (filtypen . RAW). Disse filene genereres automatisk fra frysedeteksjonssystemet når økten er over og tilsvarer rådataene for hver økt. I utgangspunktet lagres filene på skrivebordet på datamaskinen, men de kan lagres i en egendefinert mappe (f.eks. Documents-Fear condition) for å lette deres etterfølgende identifikasjon og åpning når de må analyseres.
- Åpne utdatafilene (filtypen . CSV). De kan redigeres i en regnearkprogramvare for videre analyse. Denne filen inneholder resultatene av frysing under eksperimentell økt.
MERK: For å få den totale prosentandelen av frysing, del tiden motivet brukte immobile over den totale økttiden. Antall frysing episoder kan beregnes telle antall frysing hendelser gjennom økten. I begge tilfeller er det nødvendig å definere en bevegelsesterskel basert på en minimum frysevarighet. Dette er det timelige kriteriet som definerer om en Freeze Episode registreres. Automatiserte systemer for opptak kan bruke visse mengder rammer per sekund (fps) som et mål på minimum frysevarighet. For eksempel, med en samplingsfrekvens på 30 fps, vil en minimum frysevarighet på 15 rammer registrere som frysing av en forekomst av immobilitet som varer i 30 s.
- Beregn den gjennomsnittlige varigheten for hver fryseepisode for hver økt (opplæring og både tester, kontekst og cue) ved å dele den totale frysevarigheten (i sekunder) over det totale antallet fryseepisoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Variasjoner i prosent av frysetiden i ulike stadier av treningsøkten ble analysert for alle forsøkspersoner (n = 12) ved hjelp av en avhengig ttest (tabell 1). Dyrene var aktive og utforsket det eksperimentelle kammeret i løpet av de tre første minuttene av treningsøkten (første dag av protokollen), tid der ingen toner eller sjokk ble levert (det vil si baseline-BL). Som vist i figur 2A, prosentandel av frysetid i løpet av de påfølgende 25 tonesjokk sammenkoblinger (M = 48,88; SE = 4,37) var signifikant høyere enn under BL (M = 14,65; SE = 4,05), som antas som en indikasjon på frykt oppkjøp.
| Statistikk Test | Figur | Faser | ||
| Avhengig t Test | 2A (andre personer) | t (11) = -6,21, p < 0,001, d = 2,34 | ||
| 3 min beholdere | ||||
| Gjentatte tiltak ANOVA | 2B (andre) | F (3,75, 41,32) = 11,19, p < 0,001, ηp2 = 0,50. | ||
| Faser | Gruppe | FaseR X-gruppen | ||
| Blandet ANOVA | 2C (andre) | F(3, 30) = 14,21, p < .001, ηp2 =.58 | F(3, 30) = 4,63, p < 0,05, ηp2 =.31 | F(1, 10) = 2,06, p >.05, ηp2 =.17 |
| Enveis ANOVA | 3A (andre personer) | F(1, 10) = 6,91, p < 0,05, ηp2 =.40 | ||
| Enveis ANOVA | 3B (andre personer) | F(1, 10) = 10,30, p < 0,05, ηp2 =.50 | ||
| Enveis ANOVA | 3C (andre personer) | F(1, 10) = 5,83, p <. 05, ηp2 =.36 | ||
| Blandet ANOVA | 4A (andre personer) | F(2, 20) = 29,28, p < .001, ηp2 =.74 | F(2, 20) = 2,33, p >.05, ηp2 =.18 | F(1, 10) = 2,14, p >.05, ηp2 =.17 |
| Blandet ANOVA | 4B (andre personer) | F(1, 10) = 1,53, p >.05, ηp2 =.13 | F(1, 10) = 3,98, p < 0,05, ηp2 =.28 | F(1, 10) = 0,23, p >.05, ηp2 =.02 |
| Blandet ANOVA | 4C (andre personer) | F(1, 10) = 25,43, p < .001, ηp2 =.71 | F(1, 10) = 6,17, p < 0,05, ηp2 =.38 | F(1, 10) = 0,22, p >.05, ηp2 =.02 |
Tabell 1: Statistikk brukt i dataanalysen. For figur 2Able gjennomsnittlig prosentandel av frysing av alle forsøkspersoner (n = 12) i løpet av de første 3 min av treningsøkten (tilsvarende baseline, BL) sammenlignet med prosentandelen av frysing i løpet av de resterende 25 min av økten (25 tonesjokkforsøk) som viste en betydelig forskjell og en stor effektstørrelse (Cohens d = 2,34). For figur 2Bble det utført en sammenligning på tvers av beholdere på 3 minutter som viste en signifikant forskjell i en ANOVA-test gjentatte tiltak (BL og åtte 3 min hyller). For figur 2Cble sammenligninger mellom gjennomsnittsprosenten for frysing av hver gruppe rotter under baseline (BL, første 3 min av treningsøkten), treningsperioden (25 tonesjokksammenkoblinger), konteksttestøkt og cuetestøkt utført via en blandet ANOVA med mellomfag faktor gruppen (48 timer eller 6 uker) og innenfor faktor fasene (BL, Trening, Context Test og Cue Test). Forskjeller i faser og gruppe, men ikke i samhandlingsfasen*Gruppen ble funnet. Figur 3A – 3B viser data om aktivitet (panel 3A, bevegelsesindeks), frysing (panel 3B, gjennomsnittlig frysing i sekunder) og varigheten av episoder (panel 3C, gjennomsnittlig frysing episoder i sekunder). Disse dataene ble analysert ved hjelp av en enveis ANOVA, som indikerte forskjeller mellom grupper i alle målinger. Til slutt, for figur 4A - 4C ble en blandet ANOVA utført for hvert panel (A, B og C), med som mellomfag faktor gruppen (48 h eller 6 uker) og innenfor faktor fasene (BL, Trening, Context Test og Cue Test).
Figur 2: Treningsfase av en utvidet cued frykt condition protokoll. Data vises som gjennomsnittet (stolpene) og SEM (feilfelt) for fryseresponsen. (A) viser gjennomsnittlig prosentandel av frysing av alle (n = 12) i løpet av de første 3 min av treningsøkten, der ingen sjokk eller toner ble presentert (baseline, BL), og de resterende 25 min av økten (25 tone-sjokk forsøk, med intertrial intervall, ITI, av 60 s); = forskjellig fra BL (p < .001). (B) viser gjennomsnittlig frysetid for alle dyrene (n = 12) i løpet av 3 min baseline periode (BL, ingen støt eller toner levert) og påfølgende 3 min hyller av treningsøkten; = forskjellig fra alle de gjenværende hyllene (p < .001). (C) viser gjennomsnittlig prosentandel av frysing av hver gruppe rotter (testing 48 timer etter trening; testing 6 uker etter trening) under baseline (BL, første 3 min av treningsøkten), treningsperiode (25 tonesjokksammenkoblinger), konteksttestøkt og cue testøkt; * = forskjellig fra testing etter 48 h (gjennomsnittlig diffContext = -34,95, SE = 14,99, p < 0,05, Cohen's d = 1,34); a = forskjellig fra treningsperioden(gjennomsnittlig diffTraining48h = 42,51; SE = 7,28; p < 0,05; Cohen's d = 3,03); b = forskjellig fra treningsperioden(gjennomsnittlig diffTraining6Weeks = 25,94; SE = 7,28; p < 0,05; Cohen's d = 1,77), konteksttest (gjennomsnittlig diffContext6Weeks = 50,36; SE = 10,58; p < .01; Cohen's d = 3,13), og cue test(gjennomsnittlig diffCue6Weeks = 55,86; SE = 10,25; p < .01; Cohen's d = 2,47). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
En analyse av fryseresponsen gjennom oppkjøpet ble utført ved å segmentere treningsøkten i åtte 3 min hyller (figur 2B). Disse dataene viser at gjennomsnittstiden som er allokert til dette svaret, når asymptote nær eller ved 180 s i løpet av de tre første tonesjokkforsøkene (det vil si bin 1). Dette funnet har blitt vurdert i tidligere forskning en indikasjon på overtrening11. Gjentatte tiltak ANOVA viste konsistente signifikante forskjeller mellom baseline og alle påfølgende hyller, med store effektstørrelser (tabell 1 og tabell 2).
| Sammenligning | Gjennomsnittlig forskjell | Standard feil | p verdi | Cohen's d |
| Opprinnelig plan for hylle i forhold til hylle 1 | -60.075* | 12,243 | < 0,05 | 1.95 |
| Opprinnelig plan for hylle i forhold til hylle 2 | -69.053* | 16,220 | < 0,05 | 1.89 |
| Opprinnelig plan for hylle i forhold til hylle 3 | -66.197* | 13,706 | < 0,05 | 1.91 |
| Opprinnelig plan for hylle i forhold til hylle 4 | -68.595* | 11,969 | < 0,05 | 2.08 |
| Opprinnelig plan for hylle i forhold til hylle 5 | -65.475* | 10,991 | < 0,05 | 2.15 |
| Opprinnelig plan for hylle i forhold til hylle 6 | -65.795* | 13,509 | < 0,05 | 2.06 |
| Opprinnelig plan for hylle i forhold til hylle 7 | -72.900* | 12,231 | < 0,05 | 2.53 |
| Opprinnelig plan for hylle i forhold til hylle 8 | -78.633* | 8,692 | < 0,001 | 3.37 |
Tabell 2: Gjennomsnittlig forskjell, standard feil og effektstørrelse for 3 min hyller i figur 2B. Denne tabellen viser sammenligningene mellom den opprinnelige hyllen og hver av de etterfølgende hyllene (figur 2B). Gjennomsnittlig forskjell, standardfeil og p-verdiog Cohens d rapporteres som en indeks over størrelsen på disse forskjellene (effektstørrelse).
En blandet ANOVA ble utført for å teste forskjeller i prosentandel av frysing under oppgaven, med faser (BL, opplæring, konteksttest og cue test) som innenfor-emne faktor og gruppe (48 h og 6 uker) som mellom-fag faktor (Tabell 1). Andelen frysing av alle dyr i opplæringsperioden var betydelig høyere enn i grunnlinjeperioden (se figur 2C). Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom prosent av frysingen under minnetestene og treningsperioden (s> 0,05).
Ingen signifikante forskjeller mellom de to gruppene (48 timer og 6 uker) ble observert i prosent av frysing under BL, opplæring og cue test (s> .115; se figur 2C). Derimot viste dyr testet 6 uker etter trening betydelig høyere prosent av frysing under konteksttesten enn dyr testet ved 48 timer, med stor effektstørrelse (se figur 2C). Samlet sett viser figur 2C at frysing under langvarige forsinkede kontekst- og køtester (det vil si 6 uker etter trening) var samlet sett betydelig høyere enn under treningsøkten. Den motsatte fallende trenden ble observert i gruppen av dyr som ble testet 48 timer etter trening. Disse forskjellene i gruppen på 48 timer var imidlertid ikke statistisk signifikante (ps > .05). Til slutt, selv om frysenivået viste forskjeller på tvers av ulike faser, kunne de betraktes som lave sammenlignet med andre protokoller. En forklaring kan være iboende metodiske forskjeller mellom laboratorier eller bevegelsesindeksterskelen som ble etablert under kalibreringsprosessen, noe som gjør sammenligning av data mellom laboratorier vanskelig.
Den bedede fryseresponsen til de to gruppene av under konteksttesten ble videre utforsket via analyse av andre tiltak, nemlig gjennomsnittlig aktivitet (det vil vil vilør,bevegelsesindeks), total frysetid og frysetid per episode. En enveis ANOVA ble brukt til å teste forskjeller på tvers av disse variablene (tabell 1). Aktiviteten til forsøkspersoner som ble testet 6 uker etter trening var betydelig lavere enn for dyr testet 48 timer etter treningsøkten (figur 3A). Støtende stund var den totale frysetiden for dyr som ble testet kort tid etter trening betydelig lavere enn for dyr som ble testet 6 uker etter (figur 3B). Til slutt indikerte en analyse av den gjennomsnittlige varigheten av hver fryseepisode at dyr testet 6 uker etter trening viste lengre fryseepisoder enn dyr testet 48 timer etter trening (figur 3C). Til sammen indikerer disse funnene en fryktinkubasjonseffekt.
Figur 3: Effekter av en utvidet cued frykt condition protokoll på frysing respons av rotter.
Data vises som gjennomsnittet (stolpene) og SEM (feilfelt) for fryseresponsen. (A) viser aktivitet (det vil vil vil at bevegelsesindeks) for hver gruppe (tester 48 timer etter trening, testing 6 uker etter trening) under konteksttesten; * = forskjellig fra 6 uker. (B) viser gjennomsnittlig total frysetid (i sekunder) for hver gruppe under konteksttesten; * = forskjellig fra 6 uker. (C) viser gjennomsnittlig varighet for hver fryseepisode (i sekunder) for hver gruppe under konteksttesten; * = bare forskjellig fra 6 uker. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
En ytterligere undersøkelse av ytelse under cue test økten ble utført via analyser av (a) prosenter av frysing i baseline perioder (BL Training og BL Cue Test) og under hele 10 min cue test (ti 10 s tone presentasjoner og ti ITIer av 50 s - Figur 4A), (b) gjennomsnittlig frysetid spesielt under 10-tallets presentasjoner av cue (tone), for både treningsøkter og Cue Test-økter (figur 4B) og (c) gjennomsnittlig frysetid (i sekunder) i løpet av 50-tallets intertriale intervaller (ITIer; det vil si bare toneperioder – figur 4C). En blandet ANOVA ble brukt til å analysere hvert av disse avhengige tiltakene, forutsatt faser (BL-trening, BL Cue Test og Cue Test) som innenfor-fag faktor og grupper (48 h og 6 uker) som mellom-fag faktor (Tabell 1). Som vist på figur 4A,gruppen av rotter testet 6 uker etter trening betydelig økt sin prosentandel av frysing under grunnlinjen av Cue Test økten (BL Cue Test; første 3 min av økten) og under 10 min Cue Test, sammenlignet med BL trening (det vil si før noen eksponering for toner og sjokk). Ingen analog forskjell mellom BL-trening og BL Cue ble observert for gruppen rotter som ble testet etter 48 timer (p > .05). For begge grupper av rotter var andelen frysing under 10 min Cue Test høyere enn i den tilsvarende opprinnelige perioden for den samme økten (BL Cue Test), noe som antyder en gjenfinningseffekt. Det ble ikke observert forskjeller mellom gruppene av rotter i prosent av frysing i de ulike periodene (ps > 0,05).
Figur 4B viser en sammenligning av gjennomsnittlig frysetid (i sekunder) spesielt under 10-talls tonepresentasjoner på tvers av trening (tonesjokksammenkoblinger) og Cue Test (bare tonepresentasjoner). Bare rotter testet 6 uker etter trening økte betydelig tiden frysing under signalet.
Til slutt, som vist på figur 4C,bare gruppen av rotter testet 48 timer etter trening reduserte frysetiden betydelig under ITIene fra treningsøkten til Cue Test. Ingen forskjeller i frysetid under ITI-ene ble observert på tvers av de to gruppene av rotter (ps >.05).
Figur 4: Effekter av en utvidet cued frykt condition protokoll på frysing respons under cue test.
Data vises som gjennomsnittet (stolpene) og SEM (feilfelt) for fryseresponsen. (A)viser prosentandelen av frysing av hver gruppe av (testing 48 timer etter trening; testing 6 uker etter trening) i løpet av de første 3 min av treningsøkten (BL, baseline), den første 3 min av cue test økten (BL Cue) og 10 min av cue test (Cue Test); a = forskjellig fra Cue test etter 48 h (gjennomsnittlig diffBLTraining-Cue48h = 32,84; SE = 10,25; p < 0,05; Cohen's d = 1,52); b = forskjellig fra BL Cue Test(gjennomsnittlig diffBLCue-BL6Weeks = 33.98; SE = 8,36; p < 0,05; Cohen's d = 1,59) og Cue Test(gjennomsnittlig diffCue-BL6Weeks = 55,86; SE = 10,25; p < 0,05; Cohen's d = 2,47); c = forskjellig fra Cue Test etter 48 h (gjennomsnittlig diffBLCue-Cue48h = 18,99; SE = 5,17; p < 0,05; Cohen's d = 0,67); d = forskjellig fra Cue Test etter 6 uker (gjennomsnittlig diffBLCue-Cue6Weeks = 21,87; SE = 5,17; p < 0,05; Cohen's d = 0,88). (B) viser gjennomsnittlig frysetid (i sekunder) under cue (tone) for hver gruppe under trening og Cue Test; * = forskjellig fra 6 uker i testperioden for Cue Test(gjennomsnittlig diffTraining-Cue6Weeks = -3,14; SE = 1,37; p < 0,05; Cohen's d = 1,64). (C) viser gjennomsnittlig frysetid (i sekunder) under intertriale intervaller (ITI) av treningsøkten (10 tonesjokksammenkoblinger) og Cue Test (10 tone-bare presentasjoner) på tvers av de to gruppene av rotter (48 timer og 6 uker); = forskjellig fra Trening for gruppe rotter testet 48 timer etter trening(gjennomsnittlig diffTraining-Cue48h = 506.16; SE = 95,08; p < .001; Cohen's d = 2,48). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende utvidede frykt-condition protokollen er en effektiv og gyldig tilnærming til å vurdere følelsesmessig minne på tvers av korte (48 h) og langsiktige perioder (6 uker). Dermed gjør protokollen det mulig å studere overtrening og frykt inkubasjonsfenomener hos rotter. Blant de forskjellige fordelene med denne protokollen er følgende. Det tilbyr to typer minnetester, nemlig kontekst og cue, som tillater å identifisere differensialeffekten av to forsinkelser (48 timer og 6 uker) på tvers av kontekst- og cue-manipulasjoner. For det andre innebærer oppgaven en enkelt 28 min treningsøkt, som igjen gir langsiktige effekter som strekker seg med flere uker. Denne fordelen er bemerkelsesverdig, med tanke på at noen versjoner av utvidet frykt condition trenger minst 100 sjokk over 10 økter med trening11. For det tredje tilbyr protokollen flere målealternativer, som beregnes automatisk. I tillegg er det montering farmakologiske, fysiologiske og anatomiske bevis som støtter gyldigheten av dette paradigmet for å vurdere følelsesmessige minnefenomener15,16.
Sammenlignet med andre frykt-condition paradigmer med korte treningsøkter (det vil si få studier), utvidede protokoller som resulterer i overtrening effekter har fått mindre oppmerksomhet. Imidlertid har utvidede frykt-condition oppgaver vært nøkkelen til forståelsen av frykt inkubasjon underliggende atferds- og nevrobiologiske prosesser, inkludert forholdet til andre psykologiske fenomener (f.eks forsinket utbruddet posttraumatisk stresslidelse)11,12,13. Den nåværende frykt-condition protokollen pålitelig produserer frykt inkubasjon. Dette er demonstrert med høyere frysetider og lavere bevegelsesindekser hos dyr vurdert 6 uker etter trening, sammenlignet med dyr testet 48 timer etter trening. I tillegg kan denne effekten observeres differensialt i hver av testtypene; spesielt, lengre frysing episoder under konteksttesten 6 uker etter trening og intervaller i frysing under cue presentasjoner 6 uker etter trening. Relatert til denne sistnevnte effekten (det vil si trinn i frysing under cue presentasjoner 6 uker etter trening), ser det ut til at nyheten om den eksperimentelle situasjonen (det vil si ny kontekst) kan kastes, siden baseline frysing nivåer i løpet av den samme økten var betydelig lavere enn under de påfølgende cue presentasjoner.
Selv om en trend mot fryktlæring var tydelig i begge gruppene (det vil si forskjeller mellom 3 min baseline og trening), viste dyr som ble testet etter 48 h (kontekst) og 72 h (cue) ikke signifikante forskjeller i frysenivå under begge testene. Dette kan betraktes som en begrensning av protokollen, som synes som et resultat av høy atferdsvariasjon i 48 h-gruppen (se figur 2C). En metodisk endring som kan implementeres for å redusere variasjonen og forbedre prosedyren er å utføre konteksten og cue test 24 h etter trening, noe som er vanlig i noen frykt condition prosedyrer.
Den nåværende protokollen kan brukes i klinisk forskning23. Den sterke minnespor- og inkubasjonseffekten som følge av implementeringen, kan tillate å teste effekten av medisiner som regelmessig brukes til behandling av psykologiske og psykiatriske patologier (f.eks. anxiolytiske eller humørregulatorerbehandlinger 24) på følelsesmessige minnefenomener (f.eks frykt utryddelse)25,26,27. Protokollen kan dermed tillate å måle påvirkning av medisiner på minnespor på tvers av ulike tidsrammer, inkludert biologiske korrelater som nevrotransmittere og molekyler relatert til minnevedlikehold28,29. Protokollen kan også være av relevans for forskning med et translasjonelt perspektiv, som har foreslått at fryktparadigmer kan være nyttige for å teste prekliniske modeller av atferdsterapi30 og komparative studier på frykt på tvers avarter 21,22. Til slutt, fra et nevrobiologisk syn, er den nåværende protokollen en robust modell for å studere hjernemekanismer, kommunikasjon mellom strukturer, nettverk eller nevronale ensembler involvert i langsiktig oppkjøp, konsolidering og lagring av følelsesmessig minne, eller effekter av inkubasjon under utvikling32.
Noen andre aspekter av protokollen er verdt å diskutere. Matmangel ble brukt gjennom hele eksperimentet. Denne beslutningen ble vedtatt fordi andre atferdstester basert på matbelønninger (f.eks. operant eller instrumentelle teknikker)33,34,35 kan integreres med minimumsendringer, noe som gjør den nåværende protokollen til en mer allsidig teknikk. For eksempel har vi med hell integrert denne protokollen med hjulbaserte treningsprotokoller og T-labyrintminneoppgaver. Et annet aspekt er knyttet til gruppestørrelsen (n=6) som er implementert i denne protokollen. Selv om det var en relativt liten prøve, og større prøver er absolutt anbefalt, kompenserer størrelsen på inkubasjonseffekten for denne begrensningen (se tabell 1). Dette kan betraktes som en fordel med denne protokollen, spesielt når det gjelder dyrekomiteenes anbefalinger basert på reduksjonsprinsippet. En begrensning av protokollen var at minimal eller ingen eksponering for fotskjelv og tidsforløpet av frykt inkubasjon ikke ble evaluert. En ekstra kontrollgruppe med før forholdene kan øke påkjenningen av eksperimentell design.
Endelige anbefalinger for best implementering og resultater av denne protokollen inkluderer riktig rengjøring av det eksperimentelle kammeret, spesielt rutenettet, kalibrering av sjokkintensitetene før trening av hvert emne (f.eks. avføring og urin reduserer ofte påliteligheten til sjokkintensiteten på tvers av ulike områder av kammeret) og frysedeteksjonssystemkalibrering (påliteligheten til frysetiltakene avhenger av riktig innstilling av bevegelsesterskel og minimal frysingsvarighet).
Denne protokollen kan testes med andre stammer av rotter eller andre gnagere (f.eks. mus eller mongolske gerbils), noe som utvider omfanget av applikasjoner. I slike tilfeller er det viktig å justere sjokkintensiteten, og bevegelses- og varighetsterskler. Sjokkintensiteten som brukes i frykt condition protokoller med mus vanligvis varierer 0,4 mA til 1,5 mA, med 0,75 mA en ofte rapportert effektivintensitet 16,,36,,37,,38 og 1,5 mA den høyeste rapporterteintensiteten 39. Den mongolske gerbil er en gnagermodell sjeldnere valgt for frykt kondisjoneringsforskning; Mongolske gerbils har imidlertid blitt brukt til å modellere døgnrytmer hos pattedyr40. Ang., den nåværende protokollen kan implementeres for å studere potensielle relasjoner mellom døgnrytmer og følelsesmessig minne, begge relevante i patologier som depresjon, angst eller endring av humør41,42. I tilfelle av gerbils, en effektiv sjokk intensitet rekkevidde for denne og analoge aversive condition protokoller er mellom 1,0 og 4,0 mA43,,44,,45,,46. Til slutt er det viktig å merke seg at bevegelses- og varighetsterskler bør justeres avhengig av arten valgt47. Disse terskler er grensene fastsatt på bevegelsessporing programvare, over hvilke dyret atferd er registrert som bevegelse og under hvilke programvaren registrerer frysing. I aversive kondisjoneringsstudier med mus og gerbils har effektive bevegelses- og varighetsterskler rapportert vært henholdsvis 25 og 30 bps (det vil vil vil at minimum 1 s immobilitet)henholdsvis 30,35.
For å sikre tilstrekkelig kontroll over aversiv stimulering (fotskjelv), må alle sektorer i rutenettet levere samme intensitet. Det anbefales å kalibrere intensiteten av sjokket i tre sektorer av rutenettet for å bekrefte at det er konsekvent. Dette hindrer dyr i å lære å redusere eksponeringen for sjokkene ved å flytte til et sted i boksen som avgir en lavere intensitet. Hvis kalibreringen viser at metallgitteret ikke leverer samme intensitet i alle sektorer, fjern rutenettet fra gulvet, rengjør stengene og skift ut gitteret i kammeret. Gittergulvet må settes riktig inn i kammeret for å sikre den beste elektriske overføringen fra den aversive stimuleringsenheten til rutenettet.
Fokuset og blenderåpningen til det iskalde registreringssystemkameraet kalibrert av produsenten. Hvis det imidlertid er behov for ytterligere kalibrering, løsner du setttrekkeren på fokusringen, justerer til et klart bilde oppnås og strammer deretter setttrekkeren på fokusringen. Produsenten anbefaler å låse linseåpningen i maksimal åpen stilling. For å oppnå denne innstillingen må du kontrollere at det hvite punktet på åpningsringen er på linje med tallet 1,4 på linsefatet. Det anbefales å se produsentens håndbok. Vær oppmerksom på at hvis kameraets fokus ble justert, må kalibrering av kameraet ved hjelp av den tilsvarende programvaren også forekomme. Kamerakalibrering krever justering av lysstyrke, forsterkning og lukker. Det anbefales å se produsentens håndbok for nøyaktige instruksjoner om kamerakalibreringsprosessen.
Til slutt gjør protokollen det mulig å teste følelsesmessig minne på tvers av korte og langsiktige perioder og produserer langsiktig frykt inkubasjon. Denne fryktinkubasjonseffekten genereres via en overtrening med én økt, som viser effekter 6 uker senere i kontekst- og køtester. Dette antyder et sterkt følelsesmessig minnespor. Den nåværende protokollen er en effektiv og gyldig tilnærming for å utforske komponentene i følelsesmessig minne hos rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Økonomisk støtte til denne forskningen ble gitt av Fundación Universitaria Konrad Lorenz - tilskudd nummer 9IN15151. Forfatterne vil gjerne takke kommunikasjonsavdelingen ved Konrad Lorenz University for deres hjelp med å spille inn og redigere videoen, spesielt Natalia Rivera og Andrés Serrano (Produsenter). Også Nicole Pfaller-Sadovsky og Lucia Medina for deres kommentarer til manuskriptet, og Johanna Barrero, Dean ved Corporacion Universitaria Iberoamericana, for institusjonelt samarbeid. Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid (ethanoic acid) | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid | ||
| Aversive Stimulation Current Package | MED Associates Inc | ENV-420 | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Contextual test protocol.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Cue test protocol.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Curved Wall Insert | MED Associates Inc | VFC-008-CWI | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Data processing.zip | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| NIR/White Light Control Box | MED Associates Inc | NIR-100 | |
| Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse | MED Associates Inc | ENV-005FPU-M | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Small Tabletop Cabinet and Power Supply | MED Associates Inc | SG-6080D | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) | MED Associates Inc | ENV-414S | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Standard Fear Conditioning Chamber | MED Associates Inc | VFC-008 | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Training protocol VFC.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Video Fear Conditioning Package for Rat | MED Associates Inc | MED-VFC-SCT-R | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
References
- Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nature Reviews Neuroscience. 6 (2), 119-130 (2005).
- Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, P. W., Kida, S. Activation of LVGCCs and CB1 receptors required for destabilization of reactivated contextual fear memories. Learning & Memory. 15 (6), 426-433 (2008).
- Hermans, E. J., et al. How the amygdala affects emotional memory by altering brain network properties. Neurobiology of Learning and Memory. 112, 2-16 (2014).
- Moryś, J., Berdel, B., Jagalska-Majewska, H., ŁUczyńSka, A. The basolateral amygdaloid complex -its development, morphology and functions. Folia Morphologica. 58 (3), 29-46 (1998).
- LeDoux, J. E. Emotional memory systems in the brain. Behavioural Brain Research. 58 (1-2), 69-79 (1993).
- Labar, K. S. Beyond fear: Emotional memory mechanisms in the human brain. Current Directions in Psychological Science. 16 (4), 173-177 (2007).
- Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
- Maren, S. Overtraining Does Not Mitigate Contextual Fear Conditioning Deficits Produced by Neurotoxic Lesions of the Basolateral Amygdala. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 3097-3097 (1998).
- Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, Unit-6.27 (2013).
- Morrow, J. D., Saunders, B. T., Maren, S., Robinson, T. E. Sign-tracking to an appetitive cue predicts incubation of conditioned fear in rats. Behavioural Brain Research. 276, 59-66 (2015).
- Pickens, C. L., Golden, S. A., Adams-Deutsch, T., Nair, S. G., Shaham, Y. Long-lasting incubation of conditioned fear in rats. Biological Psychiatry. 65 (10), 881-886 (2009).
- Schaap, M. W. H., et al. Nociception and Conditioned Fear in Rats: Strains Matter. PLoS ONE. 8 (12), 83339 (2013).
- Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871 (2014).
- Patel, T. P., et al. An open-source toolbox for automated phenotyping of mice in behavioral tasks. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 349 (2014).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: Interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
- Anagnostaras, S. G. Automated assessment of Pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the VideoFreeze system. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 4 (58), (2010).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Impaired Trace and Contextual Fear Conditioning in Aged Rats. Behavioral Neuroscience. 120 (3), 612-624 (2006).
- Schuette, S. R., Hobson, S. Conditioned contextual fear memory to assess natural forgetting and cognitive enhancement in rats. Journal of Biological Methods. 5 (3), 99 (2018).
- Chang, C. H., et al. Fear extinction in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 (SUPPL. 47) (2009).
- Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G. Incubation of fear. Current Protocols in Neuroscience. 64, 1-18 (2013).
- Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C. Fear Memory. Physiological Reviews. 96 (2), 695-750 (2016).
- Vetere, G., et al. Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice Article Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice. Neuron. 94 (2), 363-374 (2017).
- Koob, G. F., Zimmer, A. Chapter 9 - Animal models of psychiatric disorders. Neurobiology of Psychiatric Disorders. 106, 137-166 (2012).
- Bourin, M. Animal models for screening anxiolytic-like drugs: a perspective. Dialogues in clinical neuroscience. 17 (3), 295-303 (2015).
- Murray, S. B., et al. Fear as a translational mechanism in the psychopathology of anorexia nervosa. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 95, 383-395 (2018).
- Pamplona, F. A., et al. Prolonged fear incubation leads to generalized avoidance behavior in mice. Journal of Psychiatric Research. 45 (3), 354-360 (2011).
- Török, B., Sipos, E., Pivac, N., Zelena, D. Modelling posttraumatic stress disorders in animals. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 90, 117-133 (2019).
- Bhakta, A., Gavini, K., Yang, E., Lyman-Henley, L., Parameshwaran, K. Chronic traumatic stress impairs memory in mice: Potential roles of acetylcholine, neuroinflammation and corticotropin releasing factor expression in the hippocampus. Behavioural Brain Research. 335, 32-40 (2017).
- Uniyal, A., et al. Pharmacological rewriting of fear memories: A beacon for post-traumatic stress disorder. European Journal of Pharmacology. , 172824 (2019).
- Barad, M. Fear extinction in rodents: basic insight to clinical promise. Current Opinion in Neurobiology. 15 (6), 710-715 (2005).
- Haaker, J., et al. Making translation work: Harmonizing cross-species methodology in the behavioural neuroscience of Pavlovian fear conditioning. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 107, 329-345 (2019).
- Heroux, N. A., Horgan, C. J., Pinizzotto, C. C., Rosen, J. B., Stanton, M. E. Medial prefrontal and ventral hippocampal contributions to incidental context learning and memory in adolescent rats. Neurobiology of Learning and Memory. 166, 107091 (2019).
- Rossi, M. A., Yin, H. H. Methods for Studying Habitual Behavior in Mice. Current Protocols in Neuroscience. 60 (1), 8-29 (2012).
- Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant Procedures for Assessing Behavioral Flexibility in Rats. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Zoccolan, D., Di Filippo, A. Methodological Approaches to the Behavioural Investigation of Visual Perception in Rodents. Handbook of Behavioral Neuroscience. , Elsevier B.V. (2018).
- Lguensat, A., Bentefour, Y., Bennis, M., Ba-M'hamed, S., Garcia, R. Susceptibility and Resilience to PTSD-Like Symptoms in Mice Are Associated with Opposite Dendritic Changes in the Prelimbic and Infralimbic Cortices Following Trauma. Neuroscience. 418, 166-176 (2019).
- Li, Q., et al. N-Acetyl Serotonin Protects Neural Progenitor Cells Against Oxidative Stress-Induced Apoptosis and Improves Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus Following Traumatic Brain Injury. Journal of Molecular Neuroscience. 67 (4), 574-588 (2019).
- Pantoni, M. M., Carmack, S. A., Hammam, L., Anagnostaras, S. G. Dopamine and norepinephrine transporter inhibition for long-term fear memory enhancement. Behavioural Brain Research. 378 (112266), 112266 (2020).
- Smith, K. L., et al. Microglial cell hyper-ramification and neuronal dendritic spine loss in the hippocampus and medial prefrontal cortex in a mouse model of PTSD. Brain, Behavior, and Immunity. 80, 889-899 (2019).
- Liu, X., Zheng, X., Liu, Y., Du, X., Chen, Z. Effects of adaptation to handling on the circadian rhythmicity of blood solutes in Mongolian gerbils. Animal Models and Experimental. 2 (2), 127-131 (2019).
- Landgraf, D., McCarthy, M. J., Welsh, D. K. The role of the circadian clock in animal models of mood disorders. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 344-359 (2014).
- Refinetti, R., Kenagy, G. J. Diurnally active rodents for laboratory research. Laboratory annimals. 52 (6), 577-587 (2018).
- Hurtado-Parrado, C., et al. Assessing Mongolian gerbil emotional behavior: effects of two shock intensities and response-independent shocks during an extended inhibitory-avoidance task. PeerJ. 5, (2017).
- Frey, P., Eng, S., Gavinf, W. Conditioned suppression in the gerbil. Behavior Research Methods & Instrumentation. 4 (5), 245-249 (1972).
- Woolley, M. L., Haman, M., Higgins, G. A., Ballard, T. M. Investigating the effect of bilateral amygdala lesions on fear conditioning and social interaction in the male Mongolian gerbil. Brain Research. 1078 (1), 151-158 (2006).
- Ballard, T. M., Sänger, S., Higgins, G. a Inhibition of shock-induced foot tapping behaviour in the gerbil by a tachykinin NK1 receptor antagonist. European Journal of Pharmacology. 412 (3), 255-264 (2001).
- Luyten, L., Schroyens, N., Hermans, D., Beckers, T. Parameter optimization for automated behavior assessment: plug-and-play or trial-and-error. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8 (28), (2014).
