A الكمي الفلورية المجهري القائم علي فحص ليبوسوم واحد للكشف عن التجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية الفردية
Summary
يصف هذا البروتوكول تلفيق الجسيمات الشحمية وكيف يمكن ان يتم تعبئتها علي سطح وبشكل فردي بطريقه متوازية ضخمه باستخدام المجهر الفلوري. وهذا يسمح للقياس الكمي للحجم والتجانس التركيبي بين الدهنيات واحد من السكان.
Abstract
معظم البحوث التي توظف الجسيمات الشحمية كما نظم نموذج الغشاء أو ناقلات تسليم المخدرات تعتمد علي تقنيات القراءة السائبة التالي يفترض في جوهرها جميع الشحمية من الفرقة لتكون متطابقة. ومع ذلك ، منصات تجريبية جديده قادره علي مراقبه الجسيمات الشحمية علي مستوي الجزيئات الواحدة جعلت من الممكن لاجراء دراسات عاليه التطور والكمية علي التفاعلات غشاء البروتين أو خصائص الناقل المخدرات علي الجسيمات الشحمية الفردية ، التالي تجنب الأخطاء من المتوسط الفرقة. هنا نقدم بروتوكولا لاعداد وكشف وتحليل الجسيمات الشحمية واحده باستخدام الفحص المجهري القائم علي الفلورية ، وتسهيل هذه القياسات أحاديه الجزيئات. الاعداد يسمح للتصوير الدهنية الفردية بطريقه موازيه ضخمه ويستخدم للكشف عن حجم داخل العينة والتركيبية المتجانسة. بالاضافه إلى ذلك ، يصف البروتوكول مزايا دراسة الجسيمات الشحمية في مستوي الشحمية الواحدة ، وحدود الفحص ، والميزات الهامه التي يجب مراعاتها عند تعديلها لدراسة الاسئله البحثية الأخرى.
Introduction
الدهنية هي الحويصلات القائمة علي فسفوليبيد كرويه التي تستخدم بشكل كبير علي حد سواء في البحوث الاساسيه والتطبيقية. انها تعمل كنظم ممتازة نموذج الغشاء ، لان خصائصها الفيزيائية يمكن التلاعب بها بسهوله عن طريق مختلف مكونات الدهون التي تشكل الشحمية1،2. أيضا ، الجسيمات الشحمية تشكل نظام nanocarrier تسليم المخدرات الأكثر استخداما ، وتقدم تحسين الدوائية و دوائي وكذلك التوافق البيولوجي عاليه3.
لسنوات عديده ، وقد درست الجسيمات الشحمية في المقام الأول باستخدام التقنيات السائبة ، وإعطاء فقط الوصول إلى الفرقة متوسط قيم القراءة المغادرة. وقد ادي هذا الغالبية من هذه الدراسات ان نفترض ان جميع الدهنية في الفرقة متطابقة. ومع ذلك ، فان هذه القيم المتوسطة للفرقة تكون صحيحه فقط إذا كانت مجموعه البيانات الاساسيه موزعه بشكل موحد حول القيمة المتوسطة ، ولكن يمكن ان تمثل استنتاجا زائفا ومتحيزا إذا كانت المجموعة تتضمن مجموعات سكانية مستقله متعددة ، علي سبيل المثال. بالاضافه إلى ذلك ، علي افتراض الفرقة يعني لتمثيل السكان بأكملها يمكن ان نغفل المعلومات بالضجر داخل التجانس بين الدهنية. فقط في الاونه الاخيره قد ظهرت المقايسات الكمية التي هي قادره علي التحقيق الشحمية واحده ، وكشف الجينات الكبيرة بين الدهنية الفردية فيما يتعلق بالخصائص الفيزيائية الكيميائية الهامه بما في ذلك حجم ليبوسوم4، وتكوين الدهون5،6، وكفاءه التغليف7، وتسليط
وقد أظهرت منطقه البحث حيث المتوسطة الفرقة من خصائص الشحمية لنتائج التحيز يدرس الدهنية حجم التفاعلات غشاء البروتين المعتمدة8,9. تقليديا ، تم تقييد الباحثين دراسة مثل هذه العمليات لاعداد الشحمية مع مختلف أقطار الفرقة المتوسطة عن طريق البثق من خلال الفلاتر مع احجام مختلفه المسام9. ومع ذلك ، استخراج قطر الجسيمات الشحمية الفردية باستخدام اختبارات الشحمية واحده وكشفت عن التداخلات السكانية الكبيرة ، مع الجسيمات الشحمية مقذوف باستخدام 100 nm و 200 nm مرشحات عرض ما يصل إلى 70 ٪ تراكب في توزيع حجمها4. وهذا يمكن ان التحيز بشده قياسات السائبة من التفاعلات الدهنية حجم البروتين المعتمدة علي الغشاء10. اجراء دراسات تفاعل البروتين الغشاء باستخدام الفحص الشحمي الواحد ، والباحثين بدلا من ذلك الاستفادة من حجم-المشتتة داخل العينة ، والسماح لهم لدراسة مجموعه واسعه من أقطار الشحمية داخل كل تجربه واحده ، وتسهيل الاكتشافات الجديدة لكيفيه انحناء الغشاء وتكوين يمكن ان تؤثر عليتجنيد البروتينإلى الاغشيه4 حقل آخر حيث تطبيق اختبارات الشحمية واحده أثبتت انها مفيده في الدراسات الميكانيكية من البروتين بوساطة غشاء الانصهار13,14. النسبة لهذه القياسات الحركية ، خففت القدرة علي دراسة احداث الانصهار الفردية من الحاجة إلى التزامن التجريبي لعمليه الانصهار ، مما سمح برؤى ميكانيكيه جديده لولا ذلك لفقدت في المتوسط المكاني الذي اجري في قياسات الفرقة السائبة. بالاضافه إلى ذلك, وقد استخدمت الجسيمات الشحمية واحد كسقالة غشاء, السماح لقياس البروتينات الفردية وتقديم المعرفة الجديدة علي ديناميات البروتين الغشاء المتحول15,16. وعلاوة علي ذلك ، فان هذه الاجهزه القائمة علي البروتينات البروتينية جعلت من الممكن دراسة وظيفة الناقلات الفردية عبر الغشاء17 ومجمعات البروتين التي تشكل المسام18 وكذلك اليه الغشاء النشط بيولوجيا-الذي يتخلل الببتيدات19. وقد استخدمت الجسيمات الشحمية واحد أيضا نانوفلويديكس المواد اللينة مع الجسيمات الشحمية السطحية التي تعمل كغرف لردود الفعل الانزيميه في احجام من 10إلى 19 لتر ، وزيادة الانتاجيه وتعقيد اختبارات الفرز مع استهلاك المنتج الحد الأدنى20.
في الاونه الاخيره ، وقد استخدمت اختبارات الشحمية واحده لتوصيف الجسيمات الشحمية تسليم المخدرات في مستوي لم يسبق له سابقا من التفاصيل. وكان الباحثون قادرين علي تحديد كميات كبيره من التجانس في كميه البوليمر تعلق علي سطح الجسيمات الشحمية21. وسمحت اختبارات الشحمية الواحدة أيضا قياسات الدهنيات تسليم المخدرات في وسائل الاعلام المعقدة ، مثل بلازما الدم ، والكشف عن كيفيه العناصر الراسية إلى سطح الشحمية من خلال المراسي الدهون يمكن ان تكون عرضه للانفصام عندما تتعرض الشحمية للظروف محاكاة تلك التي شهدت خلالالدورةالمجري وبشكل عام ، فان براعة وفائدة اختبارات الشحمية الواحدة مدعمه بمجموعه كبيره من المشاكل التي استخدمت هذه الاجهزه لمعالجتها ، ونحن نتصور ان المنهجية ستستمر في التطوير والبحث عن الاستخدام في المجالات العلمية الجديدة.
هنا نقوم بوصف الفحص المجهري القائم علي المجهر الأحادي الذي يسمح بدراسة الدهنيات الفردية بطريقه عاليه الانتاجيه (الشكل 1). لتوضيح هذه الطريقة ، ونحن نستخدمها لقياس حجم والتجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية داخل الفرقة. الفحص يستخدم التصوير المجهر مضان من الجسيمات الشحمية الوحيدة التي تم تعبئتها علي سطح زجاجي تخليته. ونحن أولا وصف الخطوات الحاسمة في عمليه تصنيع الشحمية التي تضمن السليمة الفلورسنت التسمية الدهنية والتجميد. ثم ، ونحن وصف الاعداد السطحية اللازمة لتسهيل الشفط الشحمي قبل تحديد الاجراء لضمان كثافة سطح الدهنية المناسبة. نناقش المعلمات المجهرية الهامه للحصول علي صور عاليه الجودة وتحديد كيفيه اجراء تحليل البيانات البسيطة ، والسماح لاستخراج حجم الشحمية والتجانس التركيبي. وينبغي لهذا البروتوكول العام ان يوفر أساسا جيدا للباحث المهتم بالأمر لكي يطور الفحص أكثر لفائدته البحثية المحددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
من المهم ان نلاحظ انه في حين اننا وصف بالتفصيل كيف يمكن استخدام المقايسة الشحمية واحده لدراسة التجانس التركيبي بين الدهنية الفردية ، ومنصة متعددة جدا. كما هو مبين سابقا ومناقشتها في المقدمة ، يمكن تكييف البروتوكول بسهوله لدراسة جوانب من الانصهار غشاء غشاء ، والتفاعلات غشاء البروتين ، أو ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد مول هذا العمل المجلس الدانمركي للبحوث المستقلة [المنحة رقم 5054-00165B].
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are “Selected” upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
