Summary
このプロトコルは、リポソームの作製と、蛍光顕微鏡を用いて表面上に固定化し、個々に画像化する方法について説明します。これにより、集団の単一リポソーム間のサイズおよび組成不均一性の定量が可能になる。
Abstract
膜モデルシステムまたは薬物送達キャリアとしてリポソームを採用するほとんどの研究は、バルク読み出し技術に依存しているため、本質的にアンサンブルのすべてのリポソームが同一であると仮定します。しかし、単粒子レベルでリポソームを観察できる新しい実験プラットフォームにより、個々のリポソームに対するタンパク質膜相互作用または薬物担体特性に関する高度かつ定量的な研究を行うことが可能となり、したがって、アンサンブル平均からエラーを回避します。ここでは、蛍光ベースの顕微鏡アッセイを用いて単一リポソームを調製、検出、分析し、単粒子測定などを容易にするプロトコルを紹介する。セットアップは、大規模な並列方法で個々のリポソームをイメージングすることを可能にし、サンプル内のサイズと組成の不均一性を明らかにするために使用されます。さらに、このプロトコルは、単一のリポソームレベルでリポソームを研究することの利点、アッセイの限界、および他の研究問題を研究するためにそれを変更する際に考慮すべき重要な特徴を記述する。
Introduction
リポソームは、基礎研究と応用研究の両方で頻繁に使用されている球状リン脂質ベースの小胞です。それらは優れた膜モデルシステムとして機能し、その生理化学的性質は、リポソーム1、2を構成する脂質成分を変化させることによって容易に操作することができるのでである。また、リポソームは、最も使用される薬物送達ナノキャリアシステムを構成し、改善された薬物動態および薬力学ならびに高い生体適合性3を提供する。
長年にわたり、リポソームは主にバルク技術を使用して研究され、アンサンブル平均読み出し値にのみアクセスを与えてきました。これは、アンサンブル内のすべてのリポソームが同一であると仮定するために、これらの研究の大半を導いています。ただし、このようなアンサンブル平均値は、基になるデータセットが平均値の周りに均一に分布している場合にのみ正しいですが、データセットに複数の独立した母集団が含まれている場合など、誤った偏った結論を表すことができます。さらに、集団全体を表すアンサンブル平均を仮定すると、リポソーム間の不均一性の中で収容される情報を見落とすことができます。最近になってようやく単一のリポソームをプローブできる定量アッセイが出現し、リポソームサイズ4、脂質組成5、6、および封入効率7を含む重要な物理化学的性質に関して個々のリポソーム間の大きな不均一性を明らかにし、単一のリポソームレベルでリポソームを研究することの重要性を強調した。
リポソーム特性のアンサンブル平均がバイアス結果に示されている研究領域は、リポソームサイズ依存性タンパク質膜相互作用8、9を研究している。伝統的に、このようなプロセスを研究している研究者は、異なる細孔サイズ9を有するフィルターを通して押し出すことによって、異なるアンサンブル平均直径を有するリポソームを調製することに制限されてきました。しかしながら、単一リポソームアッセイを用いて個々のリポソームの直径を抽出すると、大きな集団の重複が明らかになり、リポソームは100nmおよび200nmフィルタを用いて押し出され、そのサイズ分布4において最大70%の重なりを示す。これは、リポソームサイズ依存性タンパク質膜相互作用10のバルク測定に大きく偏る可能性がある。単一のリポソームアッセイを用いて膜タンパク質相互作用研究を行い、研究者は代わりにサンプル内のサイズ多分散性を利用し、各実験内で広範囲のリポソーム直径を研究することができ、膜曲率および組成物が膜4、11、12にタンパク質のリクルートにどのように影響するかを新たに発見することを容易にした。単一リポソームアッセイの適用が実証された別の分野は、タンパク質媒介膜融合13、14の機械的研究である。このような運動学的測定では、個々の融合イベントを研究する能力により、融合プロセスの実験的同期の必要性が緩和され、バルクアンサンブル測定で行われた時空間平均で失われた新しい機械的洞察が可能になります。さらに、単一のリポソームは、膜足場として使用され、個々のタンパク質の測定を可能にし、膜貫通タンパク質構造ダイナミクス15、16に関する新しい知識を提供する。さらに、このようなプロテオオリポソームベースのセットアップにより、個々の膜貫通トランスポーター17および細孔形成タンパク質複合体18の機能ならびに生理活性膜透過性ペプチド19の機構を研究することができた。単一リポソームはまた、10−19Lの容積における酵素反応のためのチャンバーとして機能する表面固定化単一リポソームを有する軟質物質ナノ流体剤として使用されており、最小限の製品消費量20でスクリーニングアッセイのスループットおよび複雑さを増加させる。
近年、単一のリポソームアッセイは、以前は先行した詳細レベルでの薬物送達リポソームの特徴付けに用いられている。研究者は、個々のリポソーム21の表面に付着したポリマーの量において有意な不均一性を定量することができた。単一のリポソームアッセイはまた、血漿などの複雑な媒体における薬物送達リポソームの測定を可能にし、脂質アンカーを介してリポソーム表面に固定された元素が生体内循環22中に経験したものを模倣する条件にさらされると解離しやすいことを明らかにした。全体として、単一のリポソームアッセイの汎用性と有用性は、これらのセットアップが取り組むために採用されてきた多種多様な問題によって実証されており、方法論は引き続き開発され、新しい科学分野での使用を見つけることを想定しています。
ここでは、個々のリポソームを高スループットで研究することを可能にする蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイについて説明する(図1)。この方法を説明するために、アンサンブル内の個々のリポソーム間のサイズと組成の不均一性を定量化するために使用します。アッセイは、不動態ガラス表面に固定化された単一リポソームの蛍光顕微鏡イメージングを採用している。まず、適切な蛍光リポソーム標識と固定化を保証するリポソーム製造プロセスにおける重要なステップについて説明します。次に、適切なリポソーム表面密度を確保するための手順を概説する前に、リポソーム固定化を容易にするために必要な表面調製物について説明する。高品質の画像を取得するために重要な顕微鏡パラメータについて議論し、簡単なデータ分析を行う方法を説明し、リポソームサイズと組成不均一性の抽出を可能にします。この一般的なプロトコルは、興味のある研究者が彼または彼女の特定の研究の関心のためにさらにアッセイを開発するための良い基礎を提供する必要があります。
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Protocol
1. リポソーム製剤
注:簡単に言えば、リポソームの調製は、通常、3つの重要なステップを含む:1)所望の脂質組成物の乾燥脂質フィルムの調製;2)リポソームの形成のための脂質の水分補給;3)リポソーム集団の大きさおよびラメラリティを制御する。
- 脂質を計量し、tert-ブタノールに溶かす:水(9:1)ガラスバイアル。
- 溶解 POPC (1-パルミトイル-2-オレオイルグリセロ-3-ホスホコリン;MW = 760 g/mol) ~ 50 mM です。
- コレステロール(MW = 387 g/mol)を25mMに溶解する。
- 溶解 DOPE-Atto488 (1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-アトト488;MW = 1,316 g/mol) ~ 0.1 mM。
- 溶解 DOPE-Atto655 (1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-アトト655;MW = 1,368 g/mol) ~ 0.1 mM。
- DSPE-PEG2000-ビオチンを溶解する (1,2-ジステアリル-スングリセロ-3-リン酸タノラミン-N-ビオチニル(ポリエチレングリコール)-2000];MW = 3,017 g/mol) ~ 0.1 mM。
注:脂質を55°Cに加熱し、脂質の完全な溶解を確実にするために磁気攪拌を使用します。または、超音波処理浴を使用してください。未使用の脂質ストックは、-20°Cで数ヶ月間保存することができます。
- ステップ1.1で調製した脂質ストックをPOPCのモル比に混合する:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-ビオチン68.95:30:0.5:0.5:0.05を加えて、138μLのPOPC、120μLのコレステロール、500μLの蛍光新鮮なガラスバイアルにDSPE-PEG-ビオチン。
注:正確なリポソーム組成物は、関心のある特定の質問に対処するために簡単に変更することができます。詳細については、ディスカッションを参照してください。 - ガラスバイアルの蓋を緩め、液体窒素中のバイアルをスナップ凍結します。
- 凍結脂質混合物を一晩凍結乾燥する。
- 乾燥した脂質に200 mM D-ソルビトールバッファー (ソルビトール バッファー) の 1 mL を追加します。
- 混合物を45°Cに加熱し、少なくとも1時間磁気攪拌にさらす。
注:バッファーは、対処されている特定の質問(例えば、膜タンパク質相互作用を研究するための生理学的条件、または薬物送達リポソームを研究するための特定の臨床的に承認されたバッファー)を反映する必要があります。しかし、研究に特定の緩衝液が必要ない場合は、リポソームの多層性を低下させるために、イオンのない緩衝液を水分補給のために適用することができる。 - 液体窒素にバイアルを浸して脂質懸濁液を凍結し、懸濁液が完全に凍結するまで待つ。
- 冷凍懸濁液を55°Cの加熱浴に浸し、混合物が完全に解凍されるまで冷やします。
- リポソーム懸濁液が合計11個の凍結/融解サイクルにさらされるまで、手順1.7と1.8を繰り返します。
注:繰り返し凍結/融解サイクルは、単一のリポソームアッセイの精度に最も重要なリポソーム多層23を減少させることが示されており、多層リポソームはリポソームの蛍光強度対リポソームサイズ比を歪める。多層性は、通常、製剤中に0.5%以上のペズル化脂質(薬物送達のためのリポソームで一般的に行われるような)24を含む場合には本質的に低い。 - リポソームサスペンションをミニ押し出しキットを使用して、800 nmポリカーボネートフィルターを通して一度押し出します。押し出しキットの組み立てについては、製造元の指示に従います(「材料表」を参照)。
- リポソームは4°Cで一晩保管してください。
2. イメージングチャンバーの表面準備
- ウシ血清アルブミン(BSA; 1 mg/mL)、BSA-ビオチン(1mg/mL)、ストレプトアビジン(0.025 mg/mL)を10mM HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジネタンエタンエチル酸)95m NaCl緩衝液(HEPES緩衝液)で調製する。
注:リポソームバーストを防ぐために、水分補給に使用されるソルビトールバッファーと表面調製に使用されるHEPESバッファは等張である必要があります。したがって、実験の前にバッファーの浸透性を確認することをお勧めします。 - BSAの1,200 μLと120 μLのBSA-ビオチンを混合し、顕微鏡検査用の8ウェルスライドで各ウェルに300μLの混合物を加えます。
注:ここでは、ガラス底を持つ市販の8ウェル顕微鏡スライドを使用していますが(材料表を参照)、プロトコルはカスタマイズされた顕微鏡室に容易に適合させることができます。 - スライドを室温(RT)で20分間インキュベートします。
- 300 μL の HEPES バッファーでスライド 8x を洗浄します。
メモ:表面を乾燥すると損傷を受けるので、数秒以上バッファなしで井戸を残さないように注意してください。さらに、ピペット先端で表面に傷を付けないように注意してください。したがって、井戸からバッファを吸引する場合は、エッジまたはコーナーから実行します。 - ストレプトアビジンを250μL加え、RTで10分間インキュベートします。
- 手順 2.4 で説明した 8 つのワッシュを繰り返します。
- 顕微鏡スライドに300μLのソルビトール緩衝液を4°Cで各ウェルに保管してください。溶剤の蒸発は表面にダメージを与えるので、顕微鏡スライドをペトリ皿に入れ、準備したスライドがすぐに使用されない限りパラフィルムで密封してください。
3. リポソーム固定化
- リポソーム懸濁液をソルビトール緩衝液中の総脂質約20μMに希釈する。セクション1の手順は、約10 mMの総脂質のリポソーム懸濁液を生じさせる。
- スライドを顕微鏡に置き、ガラス/バッファーインターフェースからの増加したレーザー反射信号をガイドとして使用してチャンバーの表面に焦点を当てます。
- 新鮮なHEPESバッファーの300°Lでチャンバー4xを洗浄します。
- 10 μL の希釈リポソームストック(全脂質20μM)をマイクロ遠心管に加えます。
- チャンバから100μLの緩衝液を取り出し、ステップ3.4で調製したマイクロ遠心管に加え、適切に混合し、110μLをチャンバに戻します。
- 試料を顕微鏡下に置き、リポソーム蛍光体からの信号を検出できる初歩的な顕微鏡設定を用いて、表面に固定化されているリポソームを観察する。
- 個々のリポソームを示すのに十分な同時に疎で、高スループットの測定を容易にするほど密度の高いリポソーム表面密度を目指します。通常、50 μm x 50 μm の視野を使用すると、フレームあたり 300 ~400 個のリポソームが最適です (図 2)。これは通常5-10分以内に達成することができます。
注:急速に移動する蛍光粒子のみが視野内で検出される場合、固定化プロセスに重要な成分(BSA-ビオチン、ストレプトアビジン、DOPE-PEG-ビオチン)のいずれかが存在しないか、または低濃度である可能性があります。リポソームが検出されない場合は、リポソームの低濃度、蛍光検出のための不適切な設定、またはガラス表面にない焦点面でのイメージングの可能性があります。 - 適切なリポソーム表面密度に達したら、200μLのHEPES緩衝液でチャンバー3xを洗浄します。
注:固定化動態はまた、サイズや電荷などのリポソーム特性に依存するため、常に各リポソーム製剤に最適化されるべきであることに注意してください。
4. 画像取得
注:このセクションは、実験を行う研究者が利用できる顕微鏡システムに大きく依存します。したがって、イメージングを実行する方法に関する全体的なガイドラインについて説明する。ただし、正確な設定とそれらを適用する方法は、顕微鏡の設定によって異なります。たとえば、一部のシステムでは、必要な放出フィルタの組み合わせを選択できますが、他の顕微鏡には特定のプリセットフィルタが装備されています。
- 単一のリポソームをイメージングするための顕微鏡を設定します。最適な画質とその後のデータ分析を確保するには、高いグレースケール解像度と、個々のリポソームをオーバーサンプリングできるピクセルスキームを使用します。ビット深度は 16 で、50 μm x 50 μm の領域では少なくとも 1,024 x 1,024 ピクセルを使用することをお勧めします。可能な場合、ライン平均化は、ノイズを低減するために有益に適用できます(例えば、1行あたり3回のスキャン)。
- 両方が非重要なフレームからフレームへの漂白を保証し、背景から個々のリポソームを明確に区別するのに十分な強い信号を確保する励起レーザーパワーを選択します。最適な設定は、使用される特定の顕微鏡と蛍光体の組み合わせによって異なります。これはバイアス強度の定量化を行うので、検出器が飽和していないことを確認します。
- リポソーム中のDOPE-Atto488およびDOPE-Atto655フルオロフォアの両方をイメージングするには、複数のチャネルをイメージングする必要があります。したがって、クロス励起を避けるために、各チャンネルが順番に画像化されていることを確認してください。たとえば、最初に 488 nm でエキサイティングで 1 つのイメージを取り、495-560 nm で放出を読み取ります。その後、633 nmでエキサイティングに別の画像を撮りますが、660−710 nmでのみ放出を読み取ります。詳細は、利用可能な顕微鏡システム(例えば、レーザーおよびフィルター)に依存する。
- 表面の異なる領域をカバーし、サンプルの少なくとも10枚の画像を取得し、したがって、少なくとも3,000個の個々のリポソームをイメージングしてください。サーフェス密度が 300 リポソーム/フレームより低い場合は、より多くの画像を取得します。すべての新しい画像の顕微鏡に再焦点を合わせます。
注:2チャンネルイメージングの場合は、異なる蛍光チャネルで同じリポソームを持つ画像のペアをデータ分析中に簡単に識別できるように、画像ファイルに名前を付けるようにしてください。 - 組成不均一性の測定に関する実験的不確実性を定量化するために、再焦点化の前後に同じ領域のリポソームを画像化する(図3および説明を参照)。
- 顕微鏡ソフトウェアから画像を .tiff ファイルとしてエクスポートします。同じリポソームの2つのチャンネルを個別にエクスポートします。
5. データ分析
注:特別に開発された自動2Dガウスフィッティングルーチンは、以前に6、11、12を採用してきました。しかしながら、この方法の適用性を高めるために、全ての研究室で容易に実施できるデータ分析処理について説明する。
- 同じイメージングフィールド内の2つの異なる蛍光チャネルの対応する.tiff画像のペアをFIJI(FIJI Is Just ImageJ)ソフトウェアにロードします。
- [イメージ] メニューの [色]をクリックし、[チャネルのマージ] 機能を使用して 2 つのチャネルのコンポジットを作成します。
- 2つの異なるチャネルで画像化されたリポソームが良好な共生を示しているか、または目に見えるドリフトが発生したかどうかを観察します。
注:2つの蛍光チャンネル間のドリフト(2つのチャンネルの信号間の系統的かつ等しいX-Yオフセットとして認識)の場合、フレームの1つはFIJIのイメージメニューの変形/変換機能を使用して変換できます。ただし、このような画像操作には注意が必要です。したがって、リポソームをイメージングする際には、可能な限りドリフトを避けることをお勧めします。 - ComDet プラグイン (v.0.3.6.1 以降) がインストールされていることを確認するか、プラグインメニューでこれを行います。
- ComDet プラグインを開き、「プラグイン」メニューに移動し、「ComDet v.0.3.6.1」>「パーティクルを検出」を選択して、パーティクルを検出します。
- ComDet では、両方のチャネルのパーティクルを個別に検出する機能を選択してください。[近似パーティクル サイズ] に似たコローカライズされたスポット間の最大距離を設定します。通常、ここで説明する設定には 4 ピクセルが適しています。
- 信号対雑音比は、蛍光量の少ない薄暗い粒子の検出を可能にする必要があります。ComDet では、両方のチャネルの検出感度を非常に薄暗いパーティクル(SNR = 3)に設定して、この比率を 3 に設定します。
注: 通常、この SNR 値は適切ですが、より高く設定する必要がある場合があります (例えば、リポソームとして識別され、誤検知につながる可能性のある画像ノイズが多い場合)。 - [OK]を押す前に、[両方のチャネルでコライクを計算]ボックスと[検出されたパーティクルをプロット]がオンになっていることを確認します。
- 解析を実行すると、[結果] と [概要] を含む 2 つのポップアップ ウィンドウが表示されます。テーブルを .txt ファイルとして保存し、ソフトウェアにインポートすることにより、コローカリゼーション データ(検出された各パーティクルのパーティクル座標と統合強度)を含む結果を、選択したデータ処理ソフトウェアにエクスポートします。
- 各リポソームがデータセットに 1 回だけ含まれ、channel1/channel2 と channel2/channel1 の比率の両方が含まれていないことを確認します。したがって、手順5.11でAbs_frame = 1 のみがプロットされるようにデータをフィルター処理します。
注: [共領域化= 1]を選択すると、画像内のノイズから誤検知を解析から削除できます。ただし、2 つの蛍光成分のうちの 1 つだけが存在するリポソームも分析から除外されるため、重要なデータ ポイントが分析から削除される可能性があります。 - 検出された各リポソームの強度比を含むデータを使用して、カラムのヒストグラムをプロットします。
- 研究されたリポソーム系に対する組成不均一性の程度は、強度比分布の幅で表される。不均一性を定量化するには、強度比ヒストグラムをガウス関数に適合させ、平均(μ)と標準偏差(σ)を抽出します。「代表的な結果」セクションを参照してください。
- DI =σ/μとして定義された変動係数を使用して、不均一性の度数(DI)の値を計算できるようになりました。
6. リポソームサイズキャリブレーション
- リポソームストックの一部を取り出し、ステップ1.10に記載の50nmポリカーボネートフィルターを介して21xを押し出す。
- リポソーム懸濁液をマイクロ遠心管に800μLのソルビトール緩衝液に加えてリポソームを希釈する。
- 希釈したリポソーム試料をポリプロピレン単独使用キュベットに移す。
- 動的光散乱(DLS)を使用してサイズを測定します。少なくとも3つの独立した実行を実行して、リポソーム懸濁液のサイズと多分散性を測定します。
メモ:必要に応じて、測定のためにより濃縮されたリポソーム懸濁液を使用してください。DLSに代わるもの(例えば、ナノ粒子追跡解析)は、リポソームのサイズを測定するためにも適用することができる。このような粒度決定を実行する方法の説明は、このプロトコルの範囲を超えています。 - 手順4.1および4.2で定義したのとまったく同じ実験設定を使用して、顕微鏡上のキャリブレーションリポソームを画像化します。
- キャリブレーション画像の各キャリブレーションリポソームの統合強度を抽出する:ステップ5.1-5.10で説明するように、リポソーム蛍光強度を含む濾過結果シートを抽出します。結果テーブルから、「統合イント」列を抽出します。
- その膜に標識されたリポソームの総統合強度はリポソームの表面積に比例し、したがってその直径の2乗に比例するので、蛍光強度の平方根強度ヒストグラムをプロットするキャリブレーションリポソーム。
- ステップ6.7で生成された統合強度ヒストグラムを対数正規分布に適合させ、キャリブレーションリポソームの平均蛍光強度を抽出する。
- 平方根強度(IntSqrt)とリポソームサイズとの関係を決定するには、DLS測定値から得られた数値で計量した平均リポソーム直径(Dia)を用いて補正係数(C)を算出する:Dia=C IntSqrtはC=Dia/IntSqrtと同等である。
- 組成不均一性実験でリポソームのIntSqrt値を計算し、補正係数を掛けて直径に変換します。
- 組成不均一性リポソームの直径の関数として強度比値をプロットし、従って約50nm−800nmにわたるリポソームの集団に対するリポソームサイズの関数として不均一性を達成する。
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Representative Results
説明したプロトコルに従うと、単一のリポソームを大規模な並列的に画像化することが可能になります(図1)。リポソームの表面固定化が成功すると、リポソーム溶液をチャンバに添加した直後に明らかにされるべきである(プロトコルではステップ3.6)、回折限りの強度スポットが画像に現れるはずです(図1Bおよび図1C)。
良好な統計を達成し、アッセイの高スループット能力を利用するために、数千のリポソームを画像化する必要があります。合理的な数の画像でこれを行うには、フレームあたり300-400リポソームの密度を達成するのに十分なリポソームを固定化することをお勧めします。密度を低くするとデータ解析に時間がかかり、密度が高いほど画像解析ソフトウェアで単一のリポソームを区別するのが難しくなります。300-400 リポソームの外観を視覚的に確認するには、図2Aを参照してください。ただし、一部の用途(例えば、BSA表面への強いバックグラウンド結合を誘発する傾向があるタンパク質との膜タンパク質相互作用)では、右上の図2Aのような少し低い密度を使用することをお勧めします。
場合によっては、図2Bに示すように、画像を取得するときに適切なフォーカスを持つ視野全体を取得することは困難です。このような問題は、サンプルプレートが傾いていることを示している可能性があり、これはプレートが顕微鏡上の標本ホルダーに適切に配置されていないことから発生する可能性があります。また、リポソームが大きくぼやけているように見える場合は、チャンバー内のバッファーが蒸発し、表面が乾燥している可能性があります。長期間イメージングを行う場合や、RTよりも高い温度で測定を行う場合は、この問題を念頭に置いておくことが特に重要です。適切に貯蔵されたリポソームと乾燥したリポソームとの違いを例示するために、チャンバーを乾燥させる前後の同じ試料の画像を図2Cに示す。
最適な画質を確保した後、2つの撮像チャネルにおける各リポソームの統合強度を、このプロトコルのセクション5のステップに従って抽出することができる。これにより、一意の強度値のリストが作成され、個々のリポソームの強度比を計算できます。組成不均一性は強度比ヒストグラムから評価され、典型的には平均比値を中心としたガウス分布を明らかにする(図3A)。ガウス分布からの強い偏差が観察された場合(図3B)、少なくとも1つの撮像チャネルに対する検出感度の問題を示し、弱いシグナルを示すリポソームのサブセットが除外されたことを示唆している。これは、イメージングシステムの検出限界、またはデータ分析におけるリポソームの両方が原因である可能性がある(例えば、特定の最小閾値を適用する場合、ステップ5.7を参照)。
プロトコルにおけるステップ5.11−5.13で説明されているようにDI値を計算すると、調製物の個々のリポソーム間の組成不均一性の定量的尺度が提供されるであろう。ここで研究したリポソーム系については、DI = 0.23 ± 0.01 (図 3C)この値は、リポソーム特性または調製方法の変化が組成不均一性にどのように影響するかを体系的に比較するために使用できます。DI値の意味を概念化するために、強度比ヒストグラムによって表示される正規分布を参照し、経験的な68-95-99.7規則に従うことを意味します。このルールは、平均値の周囲の 1、2、および 3 つの標準偏差内にある母集団のパーセンテージを表します。ここで見られる0.23±0.01のDI値の場合、集団中のリポソームの32%が、アンサンブルの平均モル比と23%以上異なる強度比を有することを意味する(図3D)。
再焦点化前後に同じリポソームを撮像する対照実験(セクション4.6)では、実際の実験と同じデータ解析と結果プロットが行われる。これにより、DI値の実験的不確実性の定量化が可能となり、DI不確実性=0.10±0.01であることが判明した(図3E)。DIの不確実性値は、採用されたイメージングシステムに依存するが、共焦点顕微鏡のセットアップは一貫して約0.105、6のDI不確実性値を生じることがわかった。ここでリポソーム系に見られるDI=0.23±0.01のDI値は、実験上の不確実性の2倍以上であり、調製物の個々のリポソーム間に有意な組成不均一性の存在を示唆している。
セクション6に記載のサイズ較正実験を行うと、任意のリポソーム強度値をナノメートルの物理直径に変換できるようになります。この方法は、ナノメートルサイズのリポソームを光学的に解決する能力を有する極低温電子顕微鏡などの他の撮像技術25に対して検証されているが、スループットははるかに低い。実際の実験に用いたものとまったく同じ顕微鏡設定を用いて対照試料を撮像し、DLSで求められる平均リポソーム径と平均リポソーム強度を相関させることが可能になった(図4A)。次のステップは、極めて小さなリポソームを作成することに対する物理的な制約に基づいて、通常は対数正規分布を表示するリポソーム強度分布を示すことです(図4B)。分布が対数正規分布(最も多くの場合、強度の低いリポソームの欠損によるもの)によって十分に記述されていない場合は、リポソーム集団の一部が、データ分析中に低い顕微鏡検出感度または過度に厳密なパラメータのために除外されたことを意味します(図4C)。公平なデータ解釈を確実にするためには、これらの問題をキャッチして対処することが重要です。次に、図4Bの個々のリポソームの強度値を、図4Aで決定した補正係数を用いて実際の直径に変換することができる(図4D)。各リポソームの大きさを決定した後、直径の関数としてのDIを、個々のリポソームの強度比対直径をプロットすることによって調べることができる(図4E)。このじょうごのようなデータ構造は、リポソームサイズが6を減少させるとDI値が増加するという以前の知見を裏付けます。重要なことに、平均値の周りの強度比の広がりの対称的な増加は、リポソームの平均組成に系統的なサイズ依存的な変動がないことを示唆している。
図1:単一のリポソームアッセイ。(A)リポソームは、蛍光標識脂質DOPE-Atto488およびDOPE-Atto655の等モル含有量を配合し、ビオチン/ストレプトアビジンリンケージを用いてBSA表面に固定化される。(B)固定化されたリポソームを共焦点顕微鏡で画像化し、単一リポソームからの蛍光強度の検出を可能にする。スケールバー=8μm及び(C)2つのチャネル間の反転蛍光シグナルを示す2つの隣接するリポソームの表面強度プロットとして描かれた(B)における緑色領域のズームは、組成不均一性の概念を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 最適化と落とし穴(A) 左上は、50μm x 50μmフレームに固定化された29個のリポソームを示す。これらは、リポソーム不均一性の高スループット調査の可能性を利用するには、フレームあたりのリポソームが少なすぎます。右上はフレームあたり123個のリポソームを示しています。これは最適でない密度ですが、多くの画像が取得されている場合に使用できます。左下は、フレームあたり 300 ~400 のリポソームを示しています。これは、ここで説明するプロトコルに最適です。右下はフレームあたり1,500個以上のリポソームを示しており、個々のリポソームを区別するには多すぎます。単一のスポットが実際には同じ回折限られたスポット内に固定された2つのリポソームになる危険性が高い。(B) チャンバーが検体ホルダーに適切に配置されていない場合、適切な焦点で視野全体を得ることは不可能です。左の顕微鏡写真では、プレートがトラバース軸の周りに傾き、左下隅が焦点を合わせていない。右の顕微鏡写真では、プレートは縦軸の周りに傾き、より重い傾きを生み出します。左下隅と右上隅の両方がフォーカスを外しています。(C)長期間または高温でのイメージングの場合、緩衝液が蒸発し、チャンバから乾燥することにつながる。ここでは、チャンバーの前後にリポソームを撮像して3分間乾燥させ、チャンバーに新鮮な緩衝液を加えてリウェットした。得られたリポソームは、より大きく、ぼやけ、より低い蛍光強度を有し、プレート上に広がっているように見える。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:リポソーム組成不均一性を定量するための強度比ヒストグラム。(A)ヒストグラムとしてプロットされた個々のリポソームに対するDOPE-Atto488およびDOPE-Atto655蛍光の強度比。(B) イメージング中またはデータ処理工程における潜在的な感度の問題を示す切り捨てられたガウス分布。(C)ガウス関数を持つ強度ヒストグラムをフィッティングすると、DI値の計算に使用される平均値と標準偏差を抽出できます。(D) DI値0.23は、アンサンブルの平均モル比から23%以上異なる母集団の32%に換算することができる。(E)再焦点化前後に同じリポソームを撮像し、実際の実験と同様のデータ処理手順を行う制御実験。これにより、DI定量の実験誤差が決定される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:リポソーム強度をnmの物理直径に変換する。(A)キャリブレーション因子を決定するためにDLSデータと比較した50nm押出キャリブレーションリポソームの強度ヒストグラム。(B) 実験リポソームからの IntSqrt値のヒストグラムは、通常、非常に小さなリポソームの作成に対する物理的な制約のために対数正規分布を生成します。(C) 非対数正規の IntSqrt値ヒストグラムは、検出感度の問題またはデータ処理中に小さなリポソームが除外されたことを示します。(D)(B)におけるリポソーム強度は、補正係数を用いて実際のリポソーム径に変換される。(E)リポソーム径の関数としてプロットされた各リポソームの強度比を表示できるようになり、リポソームサイズの関数としての組成不均一性の調査が可能になりました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
単一のリポソームアッセイを使用して個々のリポソーム間の組成不均質性を研究する方法を詳細に説明することは重要ですが、プラットフォームは非常に汎用性があります。導入で既に示したように、このプロトコルは、膜膜融合、タンパク質膜相互作用、またはリポソーム薬物担体特性評価の側面を研究するために容易に適応することができる。取り組まれている科学的な質問については、単一のリポソームアッセイの力は、アンサンブルの個々の成分を検出する能力にあり、したがって、アンサンブル平均効果によって偏らない定量的な読み出しを有する。
単一リポソームアッセイは、全内部反射や共焦点顕微鏡などの表面イメージングモダリティに最適に適し、Z方向の断面により、リポソーム層の上の溶液から不要な背景蛍光を排除できます。しかし、この側面は、ペプチド、タンパク質、または他のリポソームなどの蛍光標識化合物が溶液に添加され、イメージング中にそこに残る研究において最も重要です。例えば、ここで詳しく説明する形式でアッセイを使用する場合、蛍光色素が固定化されたリポソームに制限されている場合、アッセイは原則として、より広く利用可能な広視野顕微鏡を用いて行うことができ、検出を提供するシステムは十分に敏感です。
プライオリティは、アッセイに使用されるリポソームを調製するために使用される方法に関して制限はありません。ここでは、凍結乾燥技術の使用について詳細に説明する。しかしながら、以前はクロロホルム系脂質再水補給又はエタノール注入ベースの技術が、アッセイ5、6で用いられるリポソームを作製するために用いられてきた。重要なパラメータは、固定化を確実にするために脂質混合物にビオチン化脂質の分の一部を含めることです(0.05モル%推奨)。もう一つの必要な元素は、少量の蛍光標識脂質を含むすることである。全体的に、添加する脂質染料の量は、焼入れ効果を回避し、脂質染料がリポソームの物理化学的性質を著しく変化させるのを避けるために、できるだけ低く保つべきである。脂質色素の量の下限は濃度によって設定され、リポソーム当たりの個々の脂質染料数の確率変動は、脂質染料の平均量と比較して有意になる(詳細な議論についてはLarsen etal.6を参照)。この制限を下回ると、抽出された強度に大きな不確実性が生じるでしょう。最後に、脂質色素の量は、良好なシグナル対雑音比を有する単一のリポソームの正確な検出に十分な高さである必要があります。この基準はもちろんイメージングシステムに大きく依存しますが、0.05~0.5モル%の脂質色素濃度が大多数の症例でうまく機能することがわかりました。
リポソームに含める脂質色素を選択するには、第1の前提条件は、励起および発光特性がイメージングシステムの照明および検出能力と一致することである。第2に、量子収率と光安定性の両方で染料を用いることをお勧めする方法の感度と精度を高めるために、我々は以前に異なる励起波長6、11の異なる染料を使用することに成功した。脂質分配が人工的に高い不均一性につながらないように、同様の物理化学的性質を持つ脂質アンカーを選択する際には注意が必要です。例えば、このプロトコルでは、DOPEを用いて両方の蛍光体を固定し、DOPEに1つの蛍光体を持ち、DPPEに別のフルオロフォアを持つと、リポソーム集団における固有の不均一性に関連しない蛍光性分布不均一性につながる可能性があります。特にデュアルカラーイメージングでは、狭い励起および発光スペクトルを持つ染料と、最も小さなスペクトルの重なりを持つ染料を選択して、染料とチャネル間の重大なブリードスルー、クロストーク、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を回避することが重要です。蛍光色素環境の変動に関連するアーティファクトを避けるために、我々は、ヒューズら26によって決定される非常に低い膜相互作用傾向を示すために実験的に証明されている染料を扱うことを好む。最後に、特定のリポソーム脂質組成物が実験計画の難しい要件でない場合、個々のリポソームが互いに反発し、単一リポソーム12として効率的に固定化されることを確実にするために、負の荷電脂質の最大10モル%を含むことは有益であり得る。
単一リポソームアッセイの利点は、実験量が少ないことだが、これは実験ごとに使用される高価または希少な化合物の量を大幅に減らすことができる。ここでは、150〜300°Lの間の実験容積を有する標準および市販のチャンバーの使用について説明する。しかし、50〜80°Lの範囲に体積を減らすことができるカスタムメイドの顕微鏡室を使用することができます。また、リポソーム消費量は非常に低く、最終濃度は約2μM総脂質である。
単一リポソームアッセイの欠点は、上述した固定化傾向の変動に起因するチャンバ内の脂質濃度を制御することが困難であるという点である。さらに、膜タンパク質相互作用を研究するためのアッセイを適用することに関しては、蛍光強度から直接結合タンパク質の濃度または数を決定することは困難である。
アッセイ中のリポソームを膜モデルシステムとして使用する場合(例えば、蛍光化合物、ペプチド、またはタンパク質の膜相互作用を研究するためには、促進するタンパク質成分への非特異的結合が低いことを保証することが重要である。固定。そうでない場合は、リポソームへの特異的結合の検出を妨げる可能性のある高いバックグラウンド信号を検出することができる。高い非特異的背景が検出された場合、我々は以前にストレプトアビジンからノイトラビジンまたはアビジンに変更することによって背景を正常に減少させました.
フローサイトメトリーのような他の技術を用いて単一のリポソーム検出を行うことは、顕微鏡ベースのアッセイと比較して検出スループットを向上させる可能性がある。しかし、フローサイトメーターは、細胞のようなはるかに大きく、より明るいサンプルを研究するために最適化されていることを考えると、ほとんどの検出システムは、個々のリポソームから比較的弱い蛍光を検出するのに十分に敏感ではありません。したがって、新しく、より敏感なフローサイトメトリーが開発されている間、顕微鏡ベースのアッセイは、効率的に行われたときにリポソームの不均一性を解明し、実験ごとに何千ものリポソームを監視するための最良のソリューションを提供します。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
この作品はデンマーク独立研究評議会(補助金番号5054-00165B)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
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