Summary
Este protocolo descreve a fabricação de lipossomas e como estes podem ser imobilizados em uma superfície e imagemindividualmente de uma forma paralela maciça usando microscopia de fluorescência. Isso permite a quantificação do tamanho e inhomogeneidade composicional entre os lipossomos únicos da população.
Abstract
A maioria das pesquisas que empregam lipossomas como sistemas de modelo de membrana ou portadores de entrega de drogas depende de técnicas de leitura em massa e, portanto, assume intrinsecamente todos os lipossomas do conjunto para ser idêntico. No entanto, novas plataformas experimentais capazes de observar lipossomos no nível de partículaúnica tornaram possível realizar estudos altamente sofisticados e quantitativos sobre interações de membrana proteica ou propriedades de portadores de drogas em lipossomos individuais, evitando assim erros da média do ensemble. Aqui apresentamos um protocolo para preparar, detectar e analisar lipossomos individuais usando um ensaio microscopia à base de fluorescência, facilitando tais medições de partículas únicas. A configuração permite a imagem de lipossomos individuais de forma paralela maciça e é empregada para revelar o tamanho intra-amostral e inhomogeneidades composicionais. Além disso, o protocolo descreve as vantagens de estudar lipossomas no nível único de lipossoma, as limitações do ensaio e as características importantes a serem consideradas ao modificá-lo para estudar outras questões de pesquisa.
Introduction
Os lipossomas são vesículas à base de fosfolípido esféricas que são fortemente utilizadas tanto na pesquisa básica quanto aplicada. Funcionam como sistemas excelentes do modelo da membrana, porque suas propriedades physiochemical podem facilmente ser manipuladas variando os componentes lipídicos que compõem o liposome1,2. Além disso, os lipossomas constituem o sistema de nanocarrier de entrega de medicamentos mais utilizado, oferecendo farmacocinética melhorada e farmacodinâmica, bem como alta biocompatibilidade3.
Por muitos anos, os lipossomas têm sido estudados principalmente usando técnicas a granel, dando apenas acesso a valores médios de leitura do conjunto. Isso levou a maioria desses estudos a assumir que todos os lipossomas do conjunto são idênticos. No entanto, esses valores medianos pelo conjunto só estão corretos se o conjunto de dados subjacente for distribuído uniformemente em torno do valor médio, mas pode representar uma conclusão falsa e tendenciosa se o conjunto de dados incluir várias populações independentes, por exemplo. Além disso, assumindo que o conjunto significa representar toda a população pode ignorar as informações abrigadas dentro da inhomogeneidade entre os lipossomas. Só recentemente surgiram ensaios quantitativos que são capazes de sondar lipossomos individuais, revelando grandes inhomogeneidades entre os lipossomos individuais no que diz respeito a importantes propriedades fisicoquímicas, incluindo o tamanho lipossoma4,composição lipídica5,6, e eficiência de encapsulamento7, destacando a importância de estudar liosomos no nível lipossoma único.
Uma área de pesquisa onde a média do conjunto de propriedades lipossoma tem sido mostrado para os resultados viés está estudando lipossoma tamanho dependente de interações de membrana de proteína8,9. Tradicionalmente, os pesquisadores que estudam tais processos têm sido restritos a preparar lipossomas com diferentes diâmetros médios conjunto por extrusão através de filtros com diferentes tamanhos de poros9. No entanto, extrair o diâmetro dos lipossomos individuais usando ensaios lipososos únicos revelou grandes sobreposições populacionais, com lipossomos extrudados usando filtros de 100 nm e 200 nm exibindo até 70% de sobreposição em sua distribuição de tamanho4. Isso poderia influenciar severamente as medições em massa de interações de membrana de proteína dependentes do tamanho dos lipososos10. Realizando os estudos de interação membrana-proteína usando o único ensaio lipossoma, os pesquisadores aproveitaram a polidispersão de tamanho dentro da amostra, permitindo-lhes estudar uma ampla gama de diâmetros lilíticos dentro de cada experimento, facilitando novas descobertas de como a curvatura e a composição da membrana podem afetar o recrutamento de proteínas nas membranas4,11,12. Outro campo onde a aplicação de ensaios lipososos únicos tem provado instrumental está em estudos mecanicistas de fusão de membrana mediada porproteínas 13,14. Para tais medições cinéticas, a capacidade de estudar eventos de fusão individuais aliviou a necessidade de sincronização experimental do processo de fusão, permitindo novos insights mecanicistas que de outra forma teriam sido perdidos na média spatiotemporal feita em medições de conjuntos a granel. Além disso, os lipossomos individuais têm sido utilizados como andaime de membrana, permitindo a medição de proteínas individuais e oferecendo novos conhecimentos sobre a dinâmica estrutural da proteína transmembrana15,16. Além disso, tais configurações à base de proteolipossoma tornaram possível estudar a função dos transportadores transmembranaindividuais17 e complexos proteicos formadores de poros18, bem como o mecanismo de peptídeos bioativos de membrana permeabilizante19. Os únicos lipossomos também têm sido usados como nanofluídicos de matéria macia com lipossomos únicos imobilizados pela superfície servindo como câmaras para reações enzimáticas em volumes de10-19 L, aumentando a fonte e a complexidade dos ensaios de triagem com consumo mínimo de produtos20.
Recentemente, os únicos ensaios lipossoma foram usados caracterizando lipossomos da entrega da droga em um nível previamente unprecendented de detalhe. Os pesquisadores foram capazes de quantificar inhomogeneidades significativas na quantidade de polímero ligado à superfície dos lipossomos individuais21. Os únicos ensaios lipossoma também permitiram medições de lipossomos de entrega de drogas em mídias complexas, como plasma sanguíneo, revelando como elementos ancorados à superfície lipossoma através de âncoras lipídicas podem ser suscetíveis à dissociação quando os lipossomas são expostos a condições que imitam aqueles experimentados durante a circulação vivo22. No geral, a versatilidade e utilidade dos únicos ensaios liúlio são fundamentados pela grande variedade de problemas que essas configurações foram empregadas para resolver, e prevemos que a metodologia continuará a ser desenvolvida e encontrará uso em novos campos científicos.
Aqui descrevemos um ensaio liposcoso único baseado em microscopia de fluorescência que permite que os lipossomas individuais sejam estudados de forma de alta despersistência (Figura 1). Para ilustrar o método, nós o usamos para quantificar o tamanho e a inhomogeneidade composicional entre lipossomos individuais dentro de um conjunto. O ensaio emprega imagens de microscópio de fluorescência de lipossomos únicos imobilizados em uma superfície de vidro passivado. Primeiro descrevemos os passos críticos no processo de fabricação de lipossoma que garante rotulagem e imobilização de liposos fluorescentes adequadas. Em seguida, descrevemos a preparação superficial necessária para facilitar a imobilização dos lipossoma antes de delinear o procedimento para garantir densidades de superfície lipossoma apropriadas. Discutimos os parâmetros de microscopia importantes para a aquisição de imagens de alta qualidade e delineamos como realizar análises de dados simples, permitindo a extração de tamanho lilímico e inhomogeneidade composicional. Este protocolo genérico deve fornecer uma boa base para o pesquisador interessado para desenvolver o ensaio ainda mais para o seu interesse de pesquisa específico.
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Protocol
1. Preparação para Lipossoma
NOTA: Brevemente, a preparação de lipossomas geralmente inclui três etapas cruciais: 1) preparação de filmes lipídicos secos da composição lipídica desejada; 2) reidratação dos lipídios para formação de lipossomas; e 3) controlar o tamanho e a lamellaridade da população de lipossomas.
- Pesar os lipídios e dissolvê-los em tert-butanol:água (9:1) em frascos de vidro.
- Dissolva POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glicero-3-fosfocolina; MW = 760 g/mol) a 50 mM.
- Dissolva o colesterol (MW = 387 g/mol) a 25 mM.
- Dissolva DOPE-Atto488 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-Atto488; MW = 1.316 g/mol) a 0,1 mM.
- Dissolva DOPE-Atto655 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-Atto655; MW = 1.368 g/mol) a 0,1 mM.
- Dissolver DSPE-PEG2000-biotina (1,2-distearyl-sn-glycero-3-fosphatetanolamina-N-[biotinyl (polietileno glicol)-2000]; MW = 3.017 g/mol) a 0,1 mM.
NOTA: Lipídios térmicos a 55 °C e usar agitação magnética, a fim de garantir a dissolução completa dos lipídios. Alternativamente, use um banho de sonication. Os estoques lipídicos não utilizados podem ser armazenados a -20 °C por vários meses.
- Misture os estoques lipídicos preparados na etapa 1.1 para uma proporção molar de POPC:cholesterol:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-biotina 68.95:30:0.5:0.0.0.05, adicionando 138 μL de POPC, 120 μL de colesterol, 500 μL de cada lipídio selada fluorescente, e 50 μL de DSPE-PEG-biotina a um frasco de vidro fresco.
NOTA: A composição lipossoma exata pode ser facilmente modificada, a fim de abordar a questão específica de interesse. Veja a discussão para mais detalhes. - Solte a tampa do frasco de vidro, e snap-congelar o frasco em nitrogênio líquido.
- Lyofilize a mistura lipídica congelada durante a noite.
- Adicione 1 mL de 200 mM D-sorbitol buffer (tampão sorbitol) para os lipídios secos.
- Aqueça a mistura a 45 °C e expor a agitação magnética por pelo menos 1 h.
NOTA: O amortecedor deve refletir a questão específica que está sendo abordada (por exemplo, condições fisiológicas para estudar interações membrana-proteína, ou um amortecedor específico clinicamente aprovado para estudar lipossomos de entrega de drogas). No entanto, se um amortecedor específico não é necessário para o estudo, um amortecedor sem íons pode ser aplicado para reidratação, a fim de reduzir a multilamellaridade dos lipossomasmas. - Congele a suspensão lipídica mergulhando o frasco em nitrogênio líquido, e espere até que a suspensão esteja completamente congelada.
- Mergulhe a suspensão congelada em um banho de aquecimento a 55 °C até que a mistura esteja completamente descongelada.
- Repita os passos 1.7 e 1.8 até que a suspensão de lipossoma tenha sido exposta a um total de 11 ciclos de congelamento/degelo.
NOTA: Ciclos repetidos de congelamento/degelo têm mostrado para reduzir a multilammellaridade lipossoma23,que é fundamental para a precisão do único ensaio lisonlímico, já que os lipossomas multilamelais distorcerão a intensidade da fluorescência versus a relação do tamanho dos lipososos. A multilamellaridade é geralmente inerentemente baixa quando incluindo mais de 0,5% lipídio sielido na formulação (como comumente feito em lipossomas para entrega de drogas)24. - Extruda a suspensão lipossoma uma vez através de um filtro de policarbonato de 800 nm usando um mini kit de extrusão. Siga as instruções do fabricante para montagem do kit de extrusão (ver Tabela de Materiais).
- Guarde os lipossomas a 4 °C durante a noite.
2. Preparação de superfície da câmara de imagem
- Prepare albumina de soro bovina (BSA; 1 mg/mL), BSA-biotina (1 mg/mL) e streptavidin (0,025 mg/mL) em 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperaezineethanesulfonic ácido) 95 mM NaCl buffer (tampão HEPES).
NOTA: Para evitar a explosão lipossômica, o tampão de sorbitol usado para reidratação e o tampão HEPES usado para preparação de superfície devem ser isotônicos. Recomenda-se, portanto, verificar a osmolaridade dos buffers antes do experimento. - Misture 1.200 μL de BSA e 120 μL de BSA-biotina e adicione 300 μL da mistura a cada poço em um slide de 8 poços para microscopia.
NOTA: Aqui usamos um slide de microscópio de 8 poços comercialmente disponível com um fundo de vidro (ver Tabela de Materiais),mas o protocolo pode ser facilmente adaptado a câmaras de microscópio personalizadas. - Incubar o slide por 20 min à temperatura ambiente (RT).
- Lave o slide 8x com 300 μL de tampão HEPES.
NOTA: Tenha cuidado para não deixar os poços sem buffer por mais de alguns segundos, como secar a superfície irá danificá-lo. Além disso, tome cuidado para não arranhar a superfície com a ponta da pipeta, pois isso também irá danificá-lo. Assim, ao aspirar buffer de um poço, fazê-lo a partir da borda ou canto. - Adicione 250 μL de streptavidin a incubação por 10 min na RT.
- Repita as 8 laviras descritas no passo 2.4.
- Guarde o slide do microscópio com 300 μL de tampão sorbitol em cada poço a 4 °C. Evaporação do solvente irá danificar a superfície, para colocar o microscópio slide em uma placa de Petri e selá-lo com parafilme, a menos que o slide preparado é usado imediatamente.
3. Imobilização de lipososos
- Diluir a suspensão lipossoma para cerca de 20 μM lipídio total no tampão sorbitol. O procedimento na seção 1 produzirá uma suspensão liposoma de aproximadamente 10 mM lipídio total.
- Coloque o slide no microscópio e concentre-se na superfície da câmara usando o sinal de reflexão a laser aumentado da interface de vidro/tampão como um guia.
- Lave a câmara 4x com 300 μL de tampão HEPES fresco.
- Adicione 10 μL de estoque lipososoma diluído (20 μM lipídio total) a um tubo de microcentrífuga.
- Retire 100 μL de buffer da câmara, adicione ao tubo de microcentrífuga preparado no passo 3.4, misture corretamente e coloque o 110 μL de volta à câmara.
- Coloque o espécime o microscópio, e use uma configuração de microscópio rudimental capaz de detectar sinal do fluorofforre liossoma (s) para observar os lipossomas sendo imobilizados na superfície.
- Apontar para uma densidade de superfície lipossoma que é simultaneamente escassa o suficiente para identificar os lipossomas individuais e densa o suficiente para que facilite as medições de alta produtividade. Normalmente usando um campo de visão de 50 μm x 50 μm, 300 a 400 lipossomos por quadro é ideal(Figura 2). Isso geralmente pode ser alcançado dentro de 5 a 10 minutos.
NOTA: Se apenas partículas fluorescentes em movimento rápido forem detectadas no campo de visão, uma ausência ou baixa concentração de qualquer um dos componentes críticos para o processo de imobilização (BSA-biotina, streptavidina, DOPE-PEG-biotina) pode ser a causa. Se não forem detectados lipossomos, pode estar relacionado a uma baixa concentração de lipossomas, configurações impróprias para a detecção de fluorescência ou, potencialmente, imagens com um plano focal que não está na superfície de vidro. - Uma vez que uma densidade de superfície lipossoma apropriada é alcançada, lave a câmara 3x com 200 μL do amortecedor de HEPES.
NOTA: Esteja ciente de que a cinética imobilização também dependem de propriedades lipomas, como tamanho e carga e, portanto, devem ser sempre otimizadas para cada formulação de lipossoma.
4. Aquisição de imagem
NOTA: Esta seção dependerá muito do sistema do microscópio disponível ao investigador que executa a experiência. Assim, serão descritas diretrizes gerais sobre como realizar a imagem. No entanto, as configurações exatas e como aplicá-las variarão entre as diferentes configurações de microscópio. Por exemplo, alguns sistemas permitem escolher qualquer combinação de filtro de emissão desejada, enquanto outros microscópios são equipados com filtros específicos e predefinidos.
- Configure o microscópio para imagens de lipossomos individuais. Para garantir a qualidade ideal da imagem e a análise de dados subsequente, use uma alta resolução em escala de cinza e um esquema de pixels que permite a superamostragem de lipossomos individuais. Um pouco de profundidade de 16 e pelo menos 1.024 x 1.024 pixels para uma área de 50 μm x 50 μm é recomendado. Se disponível, a média da linha pode ser aplicada de forma benéfica para reduzir o ruído (por exemplo, 3 varreduras por linha).
- Selecione um poder a laser de excitação que tanto garante branqueamento quadro-a-quadro não significativo e sinal forte o suficiente para discriminar claramente os lipossomas individuais a partir do fundo. A configuração ideal dependerá do microscópio específico usado, bem como a combinação de fluorofofóbico. Certifique-se de que os detectores não estão saturados, pois isso irá viés quantificação intensidade.
- A imagem de imagem dos fluoroforreos DOPE-Atto488 e DOPE-Atto655 nos lipossomas requer imagens de múltiplos canais. Assim, certifique-se de cada canal é imagem sequencialmente para evitar a excitação cruzada. Por exemplo, primeiro pegue uma imagem emocionante em 488 nm e leitura de emissão de 495-560 nm. Depois disso, pegue outra imagem emocionante em 633 nm, mas lendo a emissão apenas em 660-710 nm. As especificidades dependerão do sistema de microscópio (por exemplo, que lasers e filtros) disponíveis.
- Certifique-se de cobrir diferentes áreas da superfície, adquirindo pelo menos 10 imagens da amostra, assim, imagens de pelo menos 3.000 lipossomas individuais. Se a densidade da superfície for inferior a 300 lipossomas/quadro, adquira mais imagens. Certifique-se de reorientar o microscópio para cada nova imagem.
NOTA: Para imagens de dois canais, certifique-se de nomear os arquivos de imagem para que pares de imagens com os mesmos lipossomos em diferentes canais de fluorescência possam ser facilmente identificados durante a análise de dados. - A fim de quantificar a incerteza experimental relativa à medição da inhomogeneidade composicional, imagem a mesma área de lipossomos antes e depois de reorientar (ver Figura 3 e descrição no texto).
- Exportar as imagens do software do microscópio como arquivos .tiff. Exportar os dois canais dos mesmos lipossomas individualmente.
5. Análise de dados
NOTA: Especialmente desenvolvidas rotinas automatizadas 2D Gaussian montagem já foram empregados6,11,12. No entanto, para aumentar a aplicabilidade do método, é descrito um processo de análise de dados que possa ser facilmente implementado em todos os laboratórios.
- Carregue o par correspondente de imagens .tiff de dois canais de fluorescência diferentes no mesmo campo de imagem no software FIJI (FIJI Is Just ImageJ).
- No menu imagem, escolha cor,e usar a função Merge Channel para criar um composto dos dois canais.
- Observe se os lipossomas imagedem em dois canais diferentes exibem uma boa colocalização ou se ocorreu uma deriva visível.
NOTA: Em caso de deriva entre os dois canais de fluorescência (reconhecido como um deslocamento X-Y sistemático e igual entre o sinal nos dois canais), um dos quadros pode ser traduzido usando a função Transform > Translate no menu de imagem de FIJI. No entanto, deve ser tomado cuidado com tal manipulação de imagem. Recomenda-se, portanto, evitar a deriva, tanto quanto possível ao imagem dos lipossomas. - Certifique-se de que o plugin ComDet (v.0.3.6.1 ou mais novo) esteja instalado, ou faça isso no menu Plugins.
- Abra o plugin ComDet para detectar partículas, indo para o menu Plugins e escolhendo ComDet v.0.3.6.1 > Detect Particles.
- Em ComDet, certifique-se de escolher as partículas de detectar em ambos os canais funcionam individualmente. Defina a distância máxima entre manchas co-localizadas semelhantes ao tamanho aproximado das partículas. Normalmente, 4 pixels são apropriados para as configurações descritas aqui.
- A relação sinal-ruído deve permitir a detecção de partículas ainda não ofuscantes com uma baixa quantidade de fluorescência. Em ComDet, definir essa relação para 3, definindo a sensibilidade da detecção em ambos os canais para partículas muito dim (SNR = 3).
NOTA: Embora esse valor snr seja geralmente apropriado, pode ser necessário configurá-lo mais alto (por exemplo, se houver muito ruído de imagem que possa ser identificado como lipossomas e levar a falsos positivos). - Certifique-se de que as caixas com colocalização de cálculo e partículas detectadas em ambos os canais sejam verificadas, antes de pressionar OK.
- Depois de executar a análise, duas janelas pop-up com resultados e resumo irá mostrar. Exportar os resultados da tabela de dados contendo os dados de colocalização (coordenadas de partículas e intensidade integrada de cada partícula detectada) para um software de manipulação de dados de escolha, salvando a tabela como um arquivo .txt e importá-lo para o software.
- Certifique-se de que cada lipossosoma só é incluído uma vez no conjunto de dados e não tanto o canal1/channel2, bem como a relação canal2/channel1. Assim, filtrar os dados para que apenas Abs_frame = 1 é traçado na etapa 5.11.
NOTA: Ao escolher Colocalized = 1, falsos positivos do ruído nas imagens podem ser removidos da análise. No entanto, quaisquer lipossomas com apenas um dos dois componentes fluorescentes presentes também serão excluídos da análise, removendo assim pontos de dados importantes da análise. - Trace um histograma da coluna com dados contendo a razão de intensidade para cada liposoma detectado.
- O grau de inhomogeneidade composicional para o sistema liposômico estudado é representado pela largura da distribuição da razão de intensidade. Para quantificar a inhomogeneidade, encaixe no histograma da relação da intensidade com uma função gaussian e extraia o meio (μ) e o desvio padrão (sigma). Veja a seção resultados representativos.
- Um valor para o grau de inhomogeneidade (DI) agora pode ser calculado usando o coeficiente de variação definido como DI = sigma /μ.
6. Calibração do tamanho do lipososome
- Tire parte do estoque de lipossoma, e extruda 21x através de um filtro de policarbonato de 50 nm, como descrito no passo 1.10.
- Diluir os lipossomos, adicionando 10 μL da suspensão lipossoma para 800 μL de tampão sorbitol em um tubo de microcentrífuga.
- Transfira a amostra de liposoma diluída para uma cuvette de uso único de polipropileno.
- Medir o tamanho usando dispersão de luz dinâmica (DLS). Executar pelo menos três corridas independentes para medir o tamanho e a polidispersão da suspensão dos liposos.
NOTA: Se necessário, use uma suspensão lipossoma mais concentrada para a medição. Alternativas ao DLS (por exemplo, análise de rastreamento de nanopartículas) também podem ser aplicadas para medir o tamanho dos lipossomos. Uma descrição de como executar tal determinação do tamanho de partículas está além do escopo deste protocolo. - Imagem os lipossomos de calibração no microscópio usando exatamente as mesmas configurações experimentais, conforme definido nas etapas 4.1 e 4.2.
- Extraia a intensidade integrada para cada lipossoma de calibração nas imagens de calibração: Extraia a folha de resultados filtrada contendo intensidades de fluorescência de lipossoma, conforme descrito nos passos 5,1-5,10. A partir da tabela de resultados, extraia a coluna "IntegratedInt".
- Como a intensidade total integrada de um lipossoma rotulado em sua membrana é proporcional à área superficial do lipososoma e, portanto, proporcional ao quadrado de seu diâmetro, traça um histograma de intensidade de raiz quadrada da intensidade da fluorescência lipossomos de calibração.
- Ajuste o histograma integrado da intensidade produzido na etapa 6.7 com uma distribuição normal do registro e extrai a intensidade média da fluorescência dos liposmas da calibração.
- Para determinar a relação entre a intensidade da raiz quadrada (IntSqrt)e o tamanho dos lipososos, calcule o fator de correção (C) usando o diâmetro médio de lipossoma (Dia) pesado pelo número obtido das medições do DLS: Dia = C x IntSqrt é equivalente a C = Dia / IntSqrt.
- Calcule os valores do IntSqrt para os lipossomos no experimento de inhomogeneidade composicional e converta-os em diâmetros multiplicando-se com o fator de correção.
- Trace o valor da razão de intensidade em função do diâmetro para os lipossomos de inhomogeneidade composicional, alcançando assim a inhomogeneidade em função do tamanho dos lipossomas para uma população de lipossomas que variam de aproximadamente 50 nm-800 nm.
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Representative Results
Seguir o protocolo descrito torna possível a imagem de lipossomos únicos de uma forma paralela maciça (Figura 1). A bem-sucedida imobilização superficial dos lipossomas deve ser imediatamente aparente após a adição da solução lipossoma à câmara (passo 3.6 no protocolo), já que as manchas de intensidade limitada de difração devem aparecer na imagem (Figura 1B e Figura 1C).
A fim de alcançar boas estatísticas e explorar as habilidades de alta de supressão do ensaio, vários milhares de lipossomas devem ser imagem. Para fazer isso em um número razoável de imagens, recomenda-se imobilizar lipossomos suficientes para alcançar uma densidade de 300 a 400 lipossomas por quadro, pois isso reduzirá o número de imagens por amostra para ~10, limitando assim o número de imagens que devem ser adquiridas e analisadas. Uma densidade mais baixa tornará a análise de dados mais demorada, enquanto uma densidade maior pode torná-la desafiadora para o software de análise de imagem distinguir lipossomos únicos. Para obter uma impressão visual do que 300-400 lipossomas parecem, ver Figura 2A. Note-se, no entanto, que para algumas aplicações (por exemplo, interações membrana-proteína com uma proteína que tende a provocar forte ligação de fundo para a superfície bsa) é recomendado para usar uma densidade ligeiramente menor, como na figura 2A no canto superior direito.
Ocasionalmente, ao adquirir imagens é difícil obter todo o campo de visão em foco adequado, como ilustrado na Figura 2B. Tais problemas podem indicar que a placa de amostra está inclinando, o que pode surgir a partir da placa não ser colocada corretamente no suporte do espécime no microscópio. Além disso, se os lipossomas parecem grandes e borrados, o amortecedor na câmara pode ter evaporado e a superfície secou. É especialmente importante manter esse problema em mente quando a imagem por longos períodos de tempo ou ao realizar medições em temperaturas mais altas do que a RT. Para ilustrar a diferença entre lipossomos devidamente armazenados e secos, uma imagem da mesma amostra antes e depois de secar a câmara é mostrada na Figura 2C.
Depois de ter assegurado a qualidade ideal da imagem, a intensidade integrada para cada lipossoma nos dois canais de imagem pode ser extraída seguindo as etapas da seção 5 deste protocolo. Fazer isso criará uma lista de valores de intensidade únicos, permitindo-nos calcular a relação de intensidade para cada lipossoma individual. A inhomogeneidade composicional é avaliada a partir de histogramas de relação de intensidade, normalmente revelando uma distribuição gaussiana em torno de um valor médio de razão(Figura 3A). Observe que, se forem observados fortes desvios de uma distribuição gaussiana(Figura 3B),isso indica um problema de sensibilidade à detecção para pelo menos um dos canais de imagem, sugerindo que um subconjunto de lipossomas mostrando um sinal mais fraco foi excluído. Isso pode ser devido ao limite de detecção do sistema de imagem, ou excluindo lipossomas na análise de dados (por exemplo, ao aplicar um determinado limite mínimo; ver passo 5.7).
O cálculo do valor di descrito nas etapas 5.11-5.13 no protocolo proporcionará uma medida quantitativa da inhomogeneidade composicional entre os lipossomos individuais da preparação. Para o sistema liposômico estudado aqui, DI = 0,23 ± 0,01 (Figura 3C). Esse valor pode ser usado para comparar sistematicamente como diferentes propriedades liposoma sou métodos de preparação afetam a inhomogeneidade composicional. Para conceituar o significado do valor di, nos referimos à distribuição normal exibida pela razão de intensidade histograma, o que significa que eles obedecerão à regra empírica 68-95-99.7. Esta regra descreve a porcentagem de uma população que cai dentro de um, dois e três desvios padrão em torno do valor médio. Para o valor di de 0,23 ± 0,01 encontrado aqui, isso significa que 32% dos lipossomos da população terão uma relação de intensidade que difere em mais de 23% da razão molar média do conjunto (Figura 3D).
Para o experimento de controle, os mesmos lipossomos antes e depois de se reorientarem (seção 4.6), a mesma análise de dados e o resultado de plotagem do experimento real são realizados. Fazer isso permite a quantificação da incerteza experimental do valor DI, que foi encontrado para sera incerteza DI = 0,10 ± 0,01 (Figura 3E). Embora o valor daincerteza DI dependerá do sistema de imagem empregado, verificou-se que as configurações de microscópio confocal consistentemente dar origem a valores deincerteza DI de cerca de 0,105,6. O valor di de DI = 0,23 ± 0,01 encontrado para o sistema liposômico aqui é mais do dobro da incerteza experimental, o que sugere a presença de inhomogeneidade composicional significativa entre os lipossomos individuais da preparação.
A realização do experimento de calibração de tamanho descrito na seção 6 permitirá que os valores arbitrários de intensidade dos liposos sejam transformados em diâmetros físicos em nanômetros. O método foi validado contra outras técnicas de imagem25, como microscopia eletrônica criogênica, que tem a capacidade de resolver opticamente os lipossomos do tamanho de nanômetros, embora com uma taxa de transferência muito menor. Imagem a amostra de controle usando as configurações de microscópio exatamente o mesmo usado para os experimentos reais, agora é possível correlacionar a intensidade lipossoma média para o diâmetro lipososoma médio determinado por DLS (Figura 4A). O próximo passo é descrever a distribuição de intensidade lipossoma, que com base nas restrições físicas contra a criação de lipossomos extremamente pequenos, normalmente exibirá uma distribuição normal de log(Figura 4B). Se a distribuição não for bem descrita por uma distribuição normal de log (na maioria das vezes devido à falta de lipossomos com valores de baixa intensidade), isso significa que uma parte da população lilísofoi foi excluída devido à baixa sensibilidade à detecção de microscópio ou parâmetros excessivamente rigorosos durante a análise de dados (Figura 4C). É importante capturar e abordar essas questões para garantir a interpretação imparcial dos dados. Em seguida, os valores de intensidade para cada lipossoma individual na Figura 4B podem ser convertidos em diâmetros reais usando o fator de correção determinado na Figura 4A (Figura 4D). Depois de determinar o tamanho de cada lipossoma, o DI em função do diâmetro agora pode ser investigado traçando a razão de intensidade versus diâmetro para cada lipossoma individual (Figura 4E). Esta estrutura de dados semelhante a um funil corrobora descobertas anteriores de que o valor di aumenta quando o tamanho dos lipososos diminui6. É importante ressaltar que o aumento sitricário na disseminação de proporções de intensidade em torno de um valor médio sugere que não há variação sistemática dependente de tamanho na composição média dos lipossomas.
Figura 1: O único ensaio litosome. (A) Os lipossomas são formulados com um conteúdo equimolar dos lipídios fluorescentemente rotulados DOPE-Atto488 e DOPE-Atto655 e imobilizados em uma superfície da BSA usando uma ligação biotina/streptavidina. (B) Os lipossomas imobilizados são imagemdos usando um microscópio confocal, permitindo a detecção das intensidades de fluorescência dos lipossomos individuais. Barras de escala = 8 μm. (C) Zoom da área verde em (B)retratado como lote de intensidade de superfície para dois lipossomas adjacentes exibindo sinal fluorescente invertido entre os dois canais, ilustrando o conceito de inhomogeneidade composicional. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Otimização e armadilhas. (A) A parte superior esquerda mostra 29 lipossomas imobilizados em um quadro de 50 μm x 50 μm. Estes são muito poucos lipossomas por quadro para explorar a possibilidade de investigação de alta produtividade da inhomogeneidade dos lipososos. A direita superior mostra 123 lipossomas por quadro. Esta é uma densidade suboptimal mas pode ser usada se muitas imagens são adquiridas. A parte inferior esquerda mostra 300-400 lipossomas por quadro. Isso é ideal para o protocolo descrito aqui. A parte inferior direita mostra mais de 1.500 lipossomas por quadro, o que é demais para distinguir os lipossomos individuais. Há um alto risco de que um único ponto será realmente dois lipossomas imobilizados dentro do mesmo local limitado difração. (B)Se a câmara não é colocada corretamente no suporte do espécime, recebendo todo o campo de visão em foco adequado será impossível. Na micrografia esquerda, a placa está inclinando-se em torno do eixo de travessia, dando origem ao canto inferior esquerdo estar fora de foco. Na micrografia direita, a placa está inclinando-se em torno do eixo longitudinal, dando origem a uma inclinação mais pesada. Tanto o canto inferior esquerdo e superior direito estão fora de foco. (C)Se a imagem por longos períodos de tempo ou em temperaturas elevadas, o amortecedor pode evaporar, levando à secagem para fora da câmara. Nós ilustramos este cenário aqui por lipossomos de imagem antes e depois que a câmara foi deixada para secar por 3 min, e depois rewetted adicionando tampão fresco para a câmara. Os lipossomos resultantes são maiores, borrados, têm menor intensidade de fluorescência e parecem estar espalhados na placa. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Histogramas da relação da intensidade para quantificar a inhomogeneidade composicional lipossoma. (A) A razão de intensidade da fluorescência DOPE-Atto488 e DOPE-Atto655 para cada liposoma individual traçado como um histograma. (B) Uma distribuição gaussiana truncada ilustrando um potencial problema de sensibilidade, seja durante a imagem ou na etapa de tratamento de dados. C) Ajustar o histograma de intensidade com uma função gaussiana torna possível extrair o desvio médio e padrão usado para calcular o valor di. (D)Um valor di de 0,23 pode ser traduzido para 32% da população, diferindo em mais de 23% da razão molar média do conjunto. (E)O experimento de controle de imagens dos mesmos lipossomas antes e depois de se reorientar e, em seguida, realizar o mesmo procedimento de tratamento de dados como para o experimento real. Isso permite que o erro experimental para a quantificação di a ser determinado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Convertendo a intensidade dos lipososos em diâmetro físico em nm. (A) Histograma de intensidade dos lipossomos de calibração extrudados de 50 nm em comparação com os dados do DLS, a fim de determinar o fator de calibração. (B) Um histograma do valor intsqrt dos lipossomas experimentais normalmente produz uma distribuição normal de log devido às restrições físicas contra a criação de lipossomos muito pequenos. (C)Um histograma de valor intsqrt não normal de log normal indica problemas com sensibilidade à detecção ou que pequenos lipossomas foram excluídos durante o tratamento de dados. (D)As intensidades dos liposos (B)são convertidas em diâmetros terminosos reais usando o fator de correção. (E) A razão de intensidade de cada lipossoma traçada em função do diâmetro lilítico pode agora ser exibida permitindo a investigação da inhomogeneidade composicional em função do tamanho dos lipossomas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
É importante notar que, embora descrevamos em detalhes como o ensaio único dos lipossomas pode ser usado para estudar a inhomogeneidade composicional entre os lipossomas individuais, a plataforma é muito versátil. Como mostrado anteriormente e discutido na introdução, o protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar aspectos da fusão membrana-membrana, interações proteína-membrana ou caracterização lipossômica do portador de drogas. Para quaisquer questões científicas que estão sendo abordadas, o poder do único ensaio liúxon reside na capacidade de detectar os componentes individuais do conjunto e, assim, ter uma leitura quantitativa, não tendenciosa por efeitos de média ensemble.
O único ensaio liúcio é idealmente adequado para modalidades de imagem de superfície, como reflexão interna total ou microscópio confocal, onde o seção de direção Z pode eliminar fluorescência de fundo indesejada da solução acima da camada de lipossoma. No entanto, este aspecto é mais importante para estudos onde compostos fluorescentes rotulados, como peptídeos, proteínas ou outros lipossomas são adicionados à solução e permanecem lá durante a imagem. Por exemplo, se o ensaio é usado no formato descrito em detalhes aqui, onde os corantes fluorescentes são restritos aos lipossomos imobilizados, o ensaio poderia, em princípio, ser realizado usando microscópios widefield mais amplamente disponíveis, fornecendo a detecção sistema é sensível o suficiente.
A priori não há limitações em relação ao método usado para preparar os lipossomas usados no ensaio. Aqui descrevemos em detalhes o uso de uma técnica de congelamento de secagem. No entanto, anteriormente à base de clorofório de reidratação lipídica ou técnicas à base de injeção de etanol têm sido empregadas para fabricar lipossomos usados no ensaio5,6. Um parâmetro crítico é a inclusão de uma fração mínima de lipídios biotinylados na mistura lipípida para garantir a imobilização (0,05 mol% recomendado). Outro elemento necessário é incluir uma pequena quantidade de lipídios fluorescentes. Em geral, a quantidade de corante lipídico adicionado deve ser mantido o mais baixo possível para evitar efeitos de extinção e para evitar que a tinudura lipídicas altere significativamente as propriedades fisicoquímicas do lipossosome. O limite inferior da quantidade de corante lipídico é definido pela concentração, onde a variação estocástica no número de corantes lipídicos individuais por lipossosoma torna-se significativa em comparação com a quantidade média de corantes lipídicos (ver Larsen et al.6 para uma discussão aprofundada). Ir abaixo desse limite introduzirá grandes incertezas nas intensidades extraídas. Finalmente, a quantidade de tinudura lipídicas precisa ser alta o suficiente para a detecção precisa dos lipossomos individuais com uma boa relação sinal-ruído. Embora esse critério, naturalmente, dependa fortemente do sistema de imagem, descobrimos que as concentrações de tintura lipídicas entre 0,05 e 0,5 mol% funcionam bem na grande maioria dos casos.
Para escolher qual tintura lipídicas incluir no lipososoma, o primeiro pré-requisito é que as propriedades de excitação e emissão correspondem às capacidades de iluminação e detecção do sistema de imagem. Em segundo lugar, para aumentar a sensibilidade e precisão do método recomendamos o uso de corantes com altos rendimentos quânticos e fotostabilidade, e temos usado anteriormente corantes com sucesso com diferentes comprimentos de onda de excitação6,11. Deve-se tomar cuidado na escolha de âncoras lipídicas com propriedades fisicoquímicas semelhantes para garantir que a partição lipídicas não leve à inhomogeneidade artificialmente alta. Por exemplo, para este protocolo, ancoramos ambos os fluorophores usando DOPE, ao ter um fluorophore em DOPE e outro em DPPE poderia conduzir às heterogeneities da distribuição do fluorophore não relacionadas à inhomogeneidade inerente na população lipossome. Especialmente para imagens de cores duplas, é importante escolher corantes com espectros estreitos de excitação e emissão e a menor sobreposição espectral possível para evitar sangramento significativo, conversa cruzada e transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET) entre corantes e canais. Para evitar artefatos relacionados à variação no ambiente de fluoroforre, preferimos trabalhar com corantes, que foram comprovados experimentalmente para mostrar propensão de interação de membrana extremamente baixa, conforme determinado por Hughes et al.26. Finalmente, se uma composição liposana liposoma específica não é um requisito difícil para o projeto experimental, pode ser benéfico incluir até 10 mol% dos lipídios carregados negativamente para garantir que os lipossomos individuais reprepelem uns aos outros e sejam eficientemente imobilizados como únicos lipossomas12.
Uma vantagem do único ensaio lipossoma é o pequeno volume experimental, que pode reduzir consideravelmente a quantidade de compostos caros ou raros usados por experimento. Aqui descrevemos o uso de câmaras padrão e comercialmente disponíveis com um volume experimental entre 150-300 μL. No entanto, câmaras de microscópio personalizadas que podem reduzir o volume para um intervalo de 50-80 μL podem ser usadas. Além disso, o consumo de lipossoma é muito baixo, com uma concentração final em torno de 2 μM lipídio total.
Uma desvantagem do único ensaio lipossoma é que é difícil controlar a concentração lipítica na câmara devido às variações nas tendências de imobilização descritas acima. Além disso, no que diz respeito à aplicação do ensaio para estudar as interações membrana-proteína, é um desafio determinar a concentração ou o número de proteínas vinculadas diretamente da intensidade da fluorescência.
Ao usar os lipossomos no ensaio como sistemas de modelo de membrana (por exemplo, para estudar a interação da membrana de compostos fluorescentes, peptídeos ou proteínas) é importante garantir uma ligação baixa e não específica aos componentes proteicos que facilita a Imobilização. Se este não for o caso, sinal de fundo alto pode ser detectado que poderia impedir a detecção da ligação específica aos lipossomos. Se o fundo não específico elevado é detectado nós temos reduzido previamente com sucesso o fundo mudando do streptavidin a Neutravidin ou ao avidin.
Realizar a detecção de lipossoma único usando outras técnicas como citometria de fluxo poderia potencialmente oferecer uma maior taxa de detecção em comparação com o ensaio baseado em microscópio. No entanto, dado que os citometros de fluxo são otimizados para estudar amostras muito maiores e mais brilhantes, como as células, o sistema de detecção da maioria não é sensível o suficiente para detectar a fluorescência relativamente fraca de um lipossoma individual. Assim, enquanto a citometria de fluxo novo e mais sensível está sendo desenvolvida, o ensaio baseado em microscópio oferece a melhor solução para elucidar inhomogeneidades de lipossoma quando realizada de forma eficiente e monitorar milhares de lipossomas por experimento.
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Disclosures
Os autores declaram nenhum conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Conselho Dinamarquês para a Investigação Independente [número de subvenção 5054-00165B].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
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