Summary
Этот протокол описывает изготовление липосом и как они могут быть обездвижены на поверхности и изображены индивидуально в массивной параллельной манере с помощью флуоресценции микроскопии. Это позволяет количественно определить размер и композиционную неоднородность между отдельными липосонами населения.
Abstract
Большинство исследований с использованием липосом в качестве мембранных систем модели или носителей доставки лекарств опирается на объемные методы чтения и, таким образом, внутренне предполагает, что все липосомы ансамбля будут идентичны. Тем не менее, новые экспериментальные платформы, способные наблюдать липосомы на уровне одной частицы, позволили провести высокосложные и количественные исследования по белково-мембрановым взаимодействиям или свойствам носителя наркотиков на отдельных липосомых, таким образом избегая ошибок из ансамбля усреднения. Здесь мы представляем протокол для подготовки, обнаружения и анализа отдельных липосом с помощью анализа микроскопии на основе флуоресценции, облегчая такие измерения одной частицы. Установка позволяет для визуализации отдельных липосом в массовом параллельном порядке и используется для выявления внутривыборных размеров и композиционных неоднородностей. Кроме того, протокол описывает преимущества изучения липосом на одном уровне липосомы, ограничения асссея, а также важные особенности, которые необходимо учитывать при его изменении для изучения других исследовательских вопросов.
Introduction
Липосомы являются сферические фосфолипидные пузырьки, которые широко используются как в основных, так и в прикладных исследованиях. Они функционируют как отличные системы мембранной модели, потому что их физиохимические свойства можно легко манипулировать путем изменения липидных компонентов, составляющих липосому1,2. Кроме того, липосомы представляют собой наиболее часто используемую систему доставки лекарств, предлагая улучшенную фармакокинетику и фармакодинамику, а также высокую биосовместимость3.
На протяжении многих лет липосомы в основном изучались с использованием массовых методов, давая только доступ к среднему ансамблю считывание значений. Это привело большинство из этих исследований предположить, что все липосомы в ансамбле идентичны. Однако такие значения, усредненные по ансамблю, являются правильными только в том случае, если базовый набор данных равномерно распределен вокруг среднего значения, но может представлять собой ложное и предвзятое заключение, если набор данных включает, например, несколько независимых групп населения. Кроме того, предполагая, ансамбль означает представлять все население может игнорировать информацию, укрываемую в неоднородности между липосомы. Только недавно появились количественные анализы, которые способны зондировать одиночные липосомы, выявляя большие неоднородности между отдельными липосомы по отношению к важным физикохимическим свойствам, включая липосомы размер4, липидный состав5,6, и эффективность инкапсуляции7, подчеркивая важность изучения липосом на одном уровне липосомы.
Научно-исследовательская область, где ансамбль усреднения липосомсвойства было показано, что результаты смещения изучает липосома-зависимых белково-мембранных взаимодействий8,9. Традиционно, исследователи, изучающие такие процессы, были ограничены в подготовке липосом с различными средними диаметрами ансамбля экструзией через фильтры с различными размерами пор9. Тем не менее, извлечение диаметра отдельных липосом с помощью одной липосомы анализы выявили большие перекрытия населения, с липосомы экструдированные с помощью 100 нм и 200 нм фильтры отображения до 70% перекрытия в их размер распределения4. Это может серьезно смещения объемных измерений липосома размера-зависимых белково-мембранных взаимодействий10. Выполняя исследования взаимодействия мембраны и белка с использованием одного липосома анализ, исследователи вместо этого воспользовался размер-polydispersity в образце, что позволяет им изучать широкий спектр липосом диаметров в рамках каждого одного эксперимента, способствуя новым открытиям о том, как мембранная кривизна и состав может повлиять на набор белка в мембраны4,11,12. Еще одно поле, где применение одной липосомы анализы оказалось полезным в механистических исследованиях белка опосредованного мембранного слияния13,14. Для таких кинетических измерений, способность изучать индивидуальные события слияния смягчила необходимость экспериментальной синхронизации процесса синтеза, позволяя новые механистические идеи, которые в противном случае были бы потеряны в пространственно-временном усреднении сделано в объемных измерений ансамбля. Кроме того, одиночные липосомы были использованы в качестве мембраны эшафот, что позволяет измерения отдельных белков и предлагает новые знания о трансмембранных белков структурной динамики15,16. Кроме того, такие протеолипосомы на основе установок позволило изучить функции отдельных трансмемментов17 и порообразующих белковых комплексов18, а также механизм биоактивных мембранно-пермяковых пептидов19. Однолиповая липосома также использовалась в качестве нанофлюидики мягкой материи с поверхностно-обездвиженных одиночными липосомыми, выступающей в качестве камер для ферментативных реакций в объемах 10-19 л, увеличивая пропускную способность и сложность скрининговых анализов с минимальным потреблением продукта20.
В последнее время, один липосома анализы были использованы для характеристики доставки наркотиков липосомы на ранее unprecendented уровне детализации. Исследователям удалось количественно очислить значительные неоднородности в количестве полимера, прикрепленного к поверхности отдельных липосом21. Один липосомы анализы также позволили измерения доставки наркотиков липосомы в сложных средствах массовой информации, таких как плазма крови, показывая, как элементы, закрепленные на липосом поверхности через липидные якоря могут быть восприимчивы к диссоциации, когда липосомы подвергаются условиям, имитирующим тех, кто испытал во время циркуляции vivo22. В целом, универсальность и полезность одного липосома анализы обоснованы большое разнообразие проблем, эти установки были использованы для решения, и мы предусматриваем, что методология будет продолжать разрабатываться и найти применение в новых научных областях.
Здесь мы описываем флуоресценцию на основе одного липосомы анализ, который позволяет отдельных липосом, которые будут изучены в высокой пропускной форме (Рисунок 1). Чтобы проиллюстрировать метод, мы используем его для количественной оценки размера и композиционной неоднородности между отдельными липосонами в ансамбле. В анализе используется флуоресцентный микроскоп визуализации одной липосомы, обездвиженной на пассивной стеклянной поверхности. Сначала мы описываем критические шаги в процессе изготовления липосом, который обеспечивает надлежащую флуоресцентную маркировку липосом и иммобилизацию. Затем мы описываем поверхностный препарат, необходимый для облегчения липосомного иммобилизации, прежде чем с изложением процедуры обеспечения надлежащей плотности поверхности липосом. Мы обсуждаем параметры микроскопии, важные для получения высококачественных изображений, и разграничив, как выполнять простой анализ данных, позволяющий извить липосому и композиционную неоднородность. Этот общий протокол должен обеспечить хорошую основу для заинтересованного исследователя для дальнейшего развития ассседля для его или ее конкретных научных интересов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Липосомная подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Кратко, подготовка липосом обычно включает в себя три важнейших шага: 1) подготовка сухих липидных пленок желаемого липидного состава; 2) регидратация липидов для формирования липосом; и 3) контроль размера и ламелярности популяции липосом.
- Взвесьте липиды и растворите их в терт-бутаноле: вода (9:1) в стеклянных флаконах.
- Растворить ПОПК (1-пальмитоил-2-олеойл-глицеро-3-фосфохолин; МВт - 760 г/моль) до 50 мм.
- Растворите холестерин (МВс 387 г/моль) до 25 мм.
- Растворите DOPE-Atto488 (1,2-диолеоил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Атто488; МВт - от 1316 г/мол) до 0,1 мм.
- Растворите DOPE-Atto655 (1,2-диолеоил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Атто655; МВт - от 1368 г/мол) до 0,1 мм.
- Растворите DSPE-PEG2000-биотин (1,2-дистенил-сн-глицеро-3-фосфататаноламин-N-биотинил (полиэтиленгликоль)-2000"; МВт - от 3 017 г/мол) до 0,1 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тепло липидов до 55 градусов по Цельсию и использовать магнитное перемешивание для того, чтобы обеспечить полное растворение липидов. Кроме того, используйте соникную ванну. Неиспользованные липидные запасы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев.
- Смешайте липидные запасы, подготовленные в шаге 1,1 к молярному соотношению POPC:cholesterol:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DOPE-PEG-биотин 68.95:30:0.5:0.5:0.05, добавляя 138 л поп-музыки, 120 л холестерина, 500 л/ и липидный флуоресцентный, и 50 л DSPE-PEG-биотин к свежему стеклянному флакону.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точная липосомовая композиция может быть легко изменена для решения конкретного вопроса, интересуемого. Более подробно об этом можно просмотреть. - Освободьте крышку стеклянного флакона и заморозьте флакон в жидком азоте.
- Лиофилизацию замороженной липидной смеси на ночь.
- Добавьте 1 мл 200 мМ D-сорбитол буфера (сорбитол буфер) в сухие липиды.
- Нагрейте смесь до 45 градусов по Цельсию и подвергайте подвергать воздействию магнитного помешивания, по крайней мере 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер должен отражать конкретный вопрос, который рассматривается (например, физиологические условия для изучения взаимодействия мембранно-белкового белка, или конкретный клинически утвержденный буфер для изучения липосом доставки лекарств). Однако, если для исследования не требуется определенный буфер, для регидратации можно нанести буфер без ионов, чтобы уменьшить многоламеллярность липосом. - Заморозить липидную подвеску, окунув флакон в жидкий азот, и подождите, пока суспензия полностью замерзнет.
- Опустите замороженную подвеску в отопительную ванну при 55 градусах Цельсия до тех пор, пока смесь полностью не разморозится.
- Повторите шаги 1.7 и 1.8 до тех пор, пока липосомоносная суспензия не подвергнется воздействию в общей сложности 11 циклов замораживания/оттепели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторные циклы замораживания/оттепели показали, что уменьшают липосомную мультиламелляритность23, что имеет первостепенное значение для точности одного липосомного анализ, как мультиламеллярные липосомы будут исказить интенсивность флуоресценции по сравнению с липосомы соотношение размера липосомы. Мультиламеллярность, как правило, по своей сути низким, когда в том числе более 0,5% PEGylated липидов в формулировке (например, обычно делается в липосомы для доставки наркотиков)24. - Вынизуйте липосомную подвеску один раз через 800 нм поликарбонатного фильтра с помощью мини-экструзионного комплекта. Следуйте инструкциям производителя по сборке экструзионного комплекта (см. Таблицу материалов).
- Храните липосомы при 4 градусах Цельсия на ночь.
2. Подготовка поверхности камеры визуализации
- Подготовка бычьего сывороточного альбумина (BSA; 1 мг/мл), BSA-биотин (1 мг/мл) и стрептавидина (0,025 мг/мл) в 10 мм HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперетанесульфоновая кислота) 95 мМ НаК буфер (буфер HEPES).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения липосомального всплеска, сорбитол буфер, используемый для регидратации и HEPES буфер, используемый для подготовки поверхности должен быть изотоническим. Поэтому рекомендуется проверить осмолярность буферов перед экспериментом. - Смешайте 1200 л BSA и 120 л BSA-биотина и добавьте 300 л смеси к каждому колодцу в 8 скважине для микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы используем коммерчески доступные 8 хорошо микроскоп слайд со стеклянным дном (см. Таблица материалов), но протокол может быть легко адаптированы к индивидуальным микроскоп камеры. - Инкубировать горку в течение 20 минут при комнатной температуре (RT).
- Вымойте слайд 8x с 300 зл буфера HEPES.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не оставить скважины без буфера в течение более нескольких секунд, как высыхание поверхности повредит его. Кроме того, будьте осторожны, чтобы не поцарапать поверхность с кончиком пипетки, как это также повредит его. Таким образом, при успомении буфера от колодца, сделайте это от края или угла. - Добавьте 250 л стрептавидина и инкубацию в течение 10 мин на РТ.
- Повторите 8 смы, описанные в шаге 2.4.
- Храните слайд микроскопа с 300 qL буфера сорбитола в каждой скважине при 4 градусах Цельсия. Испарение растворителя повредит поверхность, поэтому поместите слайд микроскопа в чашку Петри и запечатайте его парафильмом, если не будет немедленно использованподготовленный слайд.
3. Липосомомат иммобилизация
- Разбавить липосомную суспензию примерно до 20 МКм общего липида в буфере сорбитола. Процедура в разделе 1 даст липосому подвески примерно 10 мМ общей липидов.
- Поместите слайд на микроскоп и сосредоточьтесь на поверхности камеры, используя увеличенный лазерный сигнал отражения от стеклянного/буферного интерфейса в качестве направляющего руководства.
- Вымойте камеру 4x с 300 зл и свежего буфера HEPES.
- Добавьте в микроцентрифугную трубку 10 л разбавленного липосомного запаса (20 мкм общего липида).
- Выняйте 100 qL буфера из камеры, добавить в микроцентрифугтрубки подготовлены в шаге 3.4, правильно перемешать, и положить 110 qL обратно в камеру.
- Поместите образец под микроскопом и используйте рудиментарный микроскоп, способный обнаруживать сигнал от липосомного фторора (ы) для наблюдения за обездвижением липосомы на поверхности.
- Цель для липосомного плотности поверхности, которая одновременно достаточно разреженной, чтобы определить отдельные липосомы и достаточно плотной, что облегчает измерения высокой пропускной связи. Обычно с использованием 50 мкм х 50 мкм поля зрения, 300-400 липосом на кадр является оптимальным(рисунок 2). Обычно это может быть достигнуто в течение 5–10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если только быстро движущихся флуоресцентных частиц обнаружены в поле зрения, отсутствие или слишком низкая концентрация любого из компонентов, критически важных для процесса иммобилизации (BSA-биотин, стрептавидин, DOPE-PEG-биотин) может быть причиной. Если липосомы не обнаружены, это может быть связано либо с низкой концентрацией липосом, неправильные настройки для обнаружения флуоресценции, или потенциально изображения с координационной плоскости не на поверхности стекла. - Как только соответствующая плотность поверхности липосом достигается, промойте камеру 3x с 200 зл и буфером HEPES.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что иммобилизация кинетики также зависит от липосомного свойства, такие как размер и заряд и, таким образом, всегда должны быть оптимизированы для каждой липосомой формулировки.
4. Приобретение изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел будет во многом зависеть от системы микроскопа, доступной исследователю, выполняющего эксперимент. Таким образом, будут описаны общие рекомендации о том, как выполнять изображения. Тем не менее, точные настройки и как их применять будет варьироваться между различными настройками микроскопа. Например, некоторые системы позволяют выбирать любую желаемую комбинацию эмиссионных фильтров, в то время как другие микроскопы оснащены специфическими, заданные фильтры.
- Настройка микроскопа для визуализации отдельных липосом. Для обеспечения оптимального качества изображения и последующего анализа данных используйте высокое разрешение серого масштаба и схему пикселей, которая позволяет перебирать отдельные липосомы. Немного глубины 16 и по крайней мере 1024 х 1024 пикселей для 50 мкм х 50 мкм области рекомендуется. При наличии, линейное число строк может быть благотворно применено для уменьшения шума (например, 3 сканирования на линию).
- Выберите возбуждающую лазерную мощность, которая обеспечивает незначительное отбеливание кадров и достаточно сильный сигнал, чтобы четко различать отдельные липосомы на заднем плане. Оптимальная настройка будет зависеть от конкретного микроскопа, а также комбинации фторофора. Убедитесь, что детекторы не насыщены, так как это будет смещения интенсивности количественной оценки.
- Визуализация как DOPE-Atto488, так и DOPE-Atto655 фторофоров в липосомы требует визуализации нескольких каналов. Таким образом, убедитесь, что каждый канал изображен последовательно, чтобы избежать перекрестного возбуждения. Например, сначала возьмите одно изображение, захватывающий на 488 нм и чтение выбросов на 495-560 нм. После этого, принять другое изображение, захватывающие на 633 нм, но чтение выбросов только на 660-710 нм. Специфика будет зависеть от системы микроскопа (например, которая лазеры и фильтры) доступны.
- Убедитесь в том, чтобы покрыть различные области поверхности, приобретая по крайней мере 10 изображений образца, таким образом, изображение по крайней мере 3000 отдельных липосом. Если плотность поверхности ниже 300 липосом/кадра, приобретите больше изображений. Убедитесь в том, чтобы переориентировать микроскоп для каждого нового изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для двухканальной визуализации, убедитесь, что имя файлы изображений так, что пары изображений с теми же липосомы в различных каналах флуоресценции могут быть легко идентифицированы во время анализа данных. - Для количественной оценки экспериментальной неопределенности, связанной с измерением композиционной неоднородности, изображение той же области липосом до и после переориентации (см. рисунок 3 и описание в тексте).
- Экспорт изображения из микроскопа программного обеспечения как .tiff файлов. Экспортировать два канала одной и той же липосомы индивидуально.
5. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Специально разработанные автоматизированные 2D Гауссиан установки процедур ранее были использованы6,11,12. Однако для повышения применимости метода описывается процесс анализа данных, который может быть легко реализован во всех лабораториях.
- Загрузите соответствующую пару изображений .tiff двух различных каналов флуоресценции в одном поле изображения в программное обеспечение FIJI (FIJI Is Just ImageJ).
- В меню изображения выберите Colorи используйте функцию канала слияния для создания композитного из двух каналов.
- Обратите внимание, если липосомы, изображенные в двух разных каналах, показывают хорошую колокализацию или произошло ли видимый дрейф.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае дрейфа между двумя каналами флуоресценции (признанных как систематическое и равное X-Y смещение между сигналом в двух каналах), один из кадров может быть переведен с помощью преобразования йgt; Перевод функции в меню изображения FIJI. Тем не менее, следует позаботиться о таких манипуляций изображения. Поэтому рекомендуется, чтобы вместо этого избежать дрейфа как можно больше при визуализации липосомы. - Убедитесь, что плагин ComDet (v.0.3.6.1 или newer) установлен, или сделайте это в меню Plugins.
- Откройте плагин ComDet для обнаружения частиц, перейдя в меню Plugins и выбрав ComDet v.0.3.6.1 .
- В ComDet убедитесь, что выберите обнаружить частицы на обоих каналах Индивидуально функции. Установите максимальное расстояние между колокализованными пятнами, похожими на приблизительное размер частиц. Как правило, 4 пикселя подходят для параметров, описанных здесь.
- Соотношение сигнала к шуму должно позволять обнаруживать даже тусклые частицы с низким количеством флуоресценции. В ComDet установите это соотношение до 3, установив чувствительность обнаружения в обоих каналах на очень тусклые частицы (SNR No 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это значение SNR обычно уместно, может быть необходимо установить его выше (например, если есть много шума изображения, которые могут быть определены как липосомы и привести к ложным срабатываниям). - Убедитесь, что коробки с рассчитать colocalization и Участок Обнаруженные частицы в обоих каналах проверяются, прежде чем нажать OK.
- После запуска анализа будут отображаться два всплывающих окна с результатами и Резюме. Экспорт таблицы данных Результаты, содержащие данные colocalization (координаты частиц и интегрированной интенсивности каждой обнаруженной частицы) в программное обеспечение обработки данных по выбору, сохраняя таблицу в качестве файла .txt и импортируя его в программное обеспечение.
- Убедитесь, что каждая липосома включена только один раз в набор данных, а не как канал1/канал2, а также соотношение channel2/channel1. Таким образом, отфильтруйте данные, чтобы только Abs_frame No 1 построен в шаге 5.11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирая Colocalized No 1, ложные срабатывания от шума в изображениях могут быть удалены из анализа. Однако любые липосомы, в которых присутствует только один из двух флуоресцентных компонентов, также будут исключены из анализа, что потенциально удалит важные точки данных из анализа. - Участок гистограммы столбца с данными, содержащими коэффициент интенсивности для каждой обнаруженной липосомы.
- Степень композиционной неоднородности для изученной липосомальной системы представлена шириной распределения коэффициента интенсивности. Для количественной оценки неоднородности, соответствовать коэффициенту интенсивности гистограммы с гауссийской функцией и извлечь среднее (я) и стандартное отклонение (сигма). Смотрите раздел «Результаты представительства».
- Значение степени неоднородности (DI) теперь можно рассчитать с использованием коэффициента вариации, определяемого как DI и sigma / q.
6. Калибровка размеров липом
- Выняйте часть липосомного запаса и выдавливайте 21x через фильтр поликарбоната 50 нм, как описано в шаге 1.10.
- Разбавить липосомы, добавив 10 зл липосомного суспензии до 800 л сорбитолового буфера в микроцентрифуговой трубке.
- Перенесите разбавленный образец липосомы в полипропиленовый одноразовой квет.
- Измерьте размер с помощью динамического рассеяния света (DLS). Выполните по крайней мере три независимых пробега для измерения размера и полидисперсности липосомной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте более концентрированную липосомную суспензию для измерения. Альтернативы DLS (например, анализ отслеживания наночастиц) также могут быть применены для измерения размера липосом. Описание того, как выполнить такое определение размера частиц, выходит за рамки данного протокола. - Изображение калибровочных липосом на микроскопе, используя точно такие же экспериментальные настройки, как это определено в шагах 4.1 и 4.2.
- Извлеките интегрированную интенсивность для каждой калибровочной липосомии на калибровочных изображениях: Извлеките фильтрованный лист результатов, содержащий интенсивность липосомного флуоресценции, как описано в шагах 5.1–5.10. Из таблицы результатов извлеките столбец "IntegratedInt".
- Потому что общая интегрированная интенсивность липосомы помечены в мембране пропорционально площади поверхности липосомы и, таким образом, пропорциональна квадрату своего диаметра, участок квадратного корня интенсивности гистограммы интенсивности флуоресценции интенсивности калибровка липосомы.
- Fit интегрированной интенсивности гистограммы производится в шаге 6.7 с журналом нормального распределения и извлечь среднюю интенсивность флуоресценции калибровочных липосом.
- Чтобы определить связь между интенсивностью квадратного корня (IntSqrt)и размером липосомы, вычислите коэффициент коррекции (C) с использованием среднего диаметра липосомы (Dia), взвешенного по количеству, полученному из измерений DLS: Dia c c IntSqrt эквивалентен C и Dia / IntSqrt.
- Рассчитайте значения IntSqrt для липосом в композиционном эксперименте неоднородности и преобразуйте их в диаметры, умножая с коэффициентом коррекции.
- Участок соотношение интенсивности значение как функция диаметра для композиционной липосомы неоднородности, таким образом, достижение неоднородности как функция липосомы размера для популяции липосом, охватывающих от примерно 50 нм-800 нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следуя описанному протоколу, можно изображение отдельных липосом в массовом параллельном порядке(рисунок 1). Успешная поверхностная иммобилизация липосом должна быть немедленно очевидна при добавлении липосомного раствора в камеру (шаг 3.6 в протоколе), так как на изображении должны появиться пятна ограниченной интенсивности (Рисунок 1В и Рисунок 1C).
Для того, чтобы достичь хорошей статистики и использовать высокопроизводительные способности анализ, несколько тысяч липосом должны быть изображены. Для того, чтобы сделать это в разумном количестве изображений, рекомендуется обездвижить достаточно липосом для достижения плотности 300-400 липосом на кадр, так как это приведет к тому, что количество изображений на образец снизится до 10 фунтов, тем самым ограничивая количество изображений, которые должны быть приобретены и проанализированы. Более низкая плотность сделает анализ данных более трудоемким, в то время как более высокая плотность может сделать его сложным для программного обеспечения анализа изображений, чтобы различать отдельные липосомы. Чтобы получить визуальное впечатление о том, как выглядят 300–400 липосом, см. Рисунок 2А. Следует отметить, однако, что для некоторых применений (например, мембранно-белковые взаимодействия с белком, который имеет тенденцию к вынудить сильный фон связывания с поверхностью BSA) рекомендуется использовать несколько более низкую плотность, например, на рисунке 2А в правом верхнем правом.
Иногда при приобретении изображений трудно получить все поле зрения в надлежащем фокусе, как показано на рисунке 2B. Такие проблемы могут указывать на то, что пробная пластина наклоняется, что может возникнуть из-за того, что пластина не помещается должным образом на держатель образца на микроскопе. Кроме того, если липосомы кажутся большими и размытыми, буфер в камере мог испариться и поверхность высохла. Особенно важно иметь в виду этот вопрос при визуализации в течение длительных периодов времени или при выполнении измерений при температурах выше, чем RT. Чтобы проиллюстрировать разницу между правильно хранить и высушенные липосомы, изображение того же образца до и после высыхания камеры показано на рисунке 2C.
После обеспечения оптимального качества изображения, интегрированная интенсивность для каждой липосомы в двух каналах изображения может быть извлечена после шагов в разделе 5 этого протокола. Это позволит создать список уникальных значений интенсивности, что позволит нам рассчитать соотношение интенсивности для каждой отдельной липосомы. Композиционная неоднородность оценивается по коэффициенту интенсивности гистограмм, как правило, выявление гауссовского распределения вокруг среднего значения соотношения(рисунок 3A). Обратите внимание, что если сильные отклонения от гауссовского распределения наблюдаются(рисунок 3B), это указывает на проблему чувствительности обнаружения, по крайней мере, для одного из каналов изображения, предполагая, что подмножество липосом, показывающих более слабый сигнал, были исключены. Это может быть связано как с пределом обнаружения системы визуализации, так и с исключением липосом в анализе данных (например, при применении определенного минимального порога; см. шаг 5.7).
Расчет значения DI, описанного в шагах 5.11-5.13 в протоколе, обеспечит количественную меру композиционной неоднородности между отдельными липосомы препарата. Для липосомальной системы, изученной здесь, DI 0,23 и 0,01(Рисунок 3C). Это значение может быть использовано для систематического сравнения, как различные липосомы свойства или методы подготовки влияют на композиционную неоднородность. Чтобы концептуализировать значение значения DI, мы ссылаемся на нормальное распределение, отображаемые гистограммой соотношения интенсивности, что означает, что они будут подчиняться эмпирическим правилу 68-95-99.7. Это правило описывает процент населения, который относится к одному, двум и трем стандартным отклонениям вокруг среднего значения. Для значения DI 0,23 и 0,01 найдено здесь, это означает, что 32% липосом в популяции будет иметь соотношение интенсивности, которая отличается более чем на 23% от среднего молярного соотношения ансамбля (Рисунок 3D).
Для контрольного эксперимента выполняется то же липосомы до и после переориентации (раздел 4.6), тот же анализ данных и построение результатов, что и для фактического эксперимента. Это позволяет количественно определить экспериментальную неопределенность значения DI, которая была признананеопределенности DI 0,10 и 0,01(рисунок 3E). Хотя значениенеопределенности DI будет зависеть от используемой системы визуализации, было установлено, что настройки конфокального микроскопа постоянно приводят к значениямнеопределенности DI около 0,105,6. Значение DI DI 0,23 и 0,01, найденное для липосомальной системы, более чем в два раза превышает экспериментальную неопределенность, что свидетельствует о наличии значительной композиционной неоднородности между отдельными липосомы препарата.
Выполнение эксперимента калибровки размеров, описанного в разделе 6, позволит преобразовать произвольные значения липосомной интенсивности в физические диаметры в нанометрах. Метод был проверен против других методов визуализации25, таких как криогенная электронная микроскопия, которая имеет возможность оптически разрешать липосомы размером с нанометр, хотя и с гораздо более низкой пропускной способностью. Изображение контрольного образца с использованием точно таких же параметров микроскопа, которые используются для реальных экспериментов, теперь можно соотнести среднее липосомного интенсивности со средним диаметром липосомы, определяемым DLS (Рисунок 4A). Следующим шагом является изображение распределения липосом интенсивности, которое основано на физических ограничениях против создания крайне небольших липосом, как правило, будет отображать нормальное распределение журнала(рисунок 4B). Если распределение не очень хорошо описано в нормальном распределении журнала (чаще всего из-за отсутствия липосом с низкими значениями интенсивности), это означает, что часть популяции липосом была исключена либо из-за низкой чувствительности обнаружения микроскопа, либо из-за чрезмерно строгих параметров при анализе данных(рисунок 4C). Важно уловить и решить эти вопросы, чтобы обеспечить беспристрастную интерпретацию данных. Далее, значения интенсивности для каждой отдельной липосомы на рисунке 4B могут быть преобразованы в фактические диаметры с использованием фактора коррекции, определяемого на рисунке 4A (Рисунок 4D). После определения размера каждой липосомы, DI как функция диаметра теперь могут быть исследованы путем построения коэффициента интенсивности по сравнению с диаметром для каждой отдельной липосомы (Рисунок 4E). Эта воронка-подобная структура данных подтверждает более ранние выводы, что значение DI увеличивается, когда размер липосомы уменьшается6. Важно отметить, что симметричное увеличение распределения коэффициентов интенсивности вокруг среднего значения свидетельствует об отсутствии систематического изменения среднего размера в среднем составе липосом.
Рисунок 1: Один липосомотовый ассс. (A) Липосомы сформулированы с эквимолярным содержанием флуоресцентно помечены липиды DOPE-Atto488 и DOPE-Atto655 и обездвижены на поверхности BSA с помощью биотина / стрептавидина связи. (B) Обездвижемы образуются с помощью конфокального микроскопа, что позволяет обнаруживать интенсивность флуоресценции от одной липосомы. Шкала баров 8 мкм. (C) Увеличить зеленую зону в (B) изображен в качестве поверхностного участка интенсивности для двух смежных липосом отображения перевернутый флуоресцентный сигнал между двумя каналами, иллюстрирующие концепцию композиционной неоднородности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Оптимизация и подводные камни. (A) В верхнем левом показывает 29 липосом обездвижены в 50 мкм х 50 мкм кадра. Это слишком мало липосом на кадр, чтобы использовать возможность для высокой пропускной способностью исследования липосомного неоднородности. В правом верхнем верхнем положении показано 123 липосомы на кадр. Это неоптимальная плотность, но может быть использована, если много изображений приобретено. В левом нижнем углу изображено 300–400 липосом на кадр. Это оптимально для описанного здесь протокола. В правом нижнем углу показано более 1500 липосом на кадр, что слишком много, чтобы различать отдельные липосомы. Существует высокий риск того, что одно место будет на самом деле две липосомы обездвижены в том же месте дифракции ограниченное место. (B) Если камера не помещается должным образом в держатель образца, получить все поле зрения в надлежащем фокусе будет невозможно. В левом микрографе пластина наклоняется вокруг оси траверса, что приводит к тому, что нижний левый угол находится вне фокуса. В правом микрографе пластина наклоняется вокруг продольной оси, что приводит к более тяжелому наклону. И левый нижний, и верхний правый угол не в фокусе. (C) Если изображение в течение длительных периодов времени или при повышенных температурах буфер может испаряться, что приводит к высыханию из камеры. Мы проиллюстрировали этот сценарий здесь изображения липосомы до и после того, как камера была оставлена высохнуть в течение 3 минут, а затем rewetted, добавив свежий буфер в камеру. В результате липосомы больше, размыто, имеют более низкую интенсивность флуоресценции, и, как представляется, распространяется на пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Коэффициент интенсивности гистограмм для количественной липосомы композиционной неоднородности. (A) Коэффициент интенсивности DOPE-Atto488 и DOPE-Atto655 флуоресценции для каждой отдельной липосомы, построенной как гистограмма. (B) Усеченное гауссианское распределение, иллюстрирующее потенциальную проблему чувствительности, либо во время визуализации, либо на этапе обработки данных. (C) Установка интенсивности гистограммы с гауссианской функции позволяет извлечь среднее и стандартное отклонение, используемое для расчета значения DI. (D) Значение DI 0.23 можно перевести к 32% из населенности отличая больше чем 23% от среднего соотношения моляра ансамбля. (E) Контроль ный эксперимент визуализации же липосомы до и после переориентации, а затем выполнения той же процедуры обработки данных, как для фактического эксперимента. Это позволяет определить экспериментальную ошибку для количественной оценки DI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Преобразование липосоминтенсивности в физический диаметр в нм. (A) Интенсивная гистограмма 50 нм экструдированной калибровки липосом по сравнению с данными DLS для определения фактора калибровки. (B) Гистограмма значения IntSqrt от экспериментальных липосом обычно дает журнал нормального распределения из-за физических ограничений против создания очень маленьких липосом. (C) Не журнал-нормальный IntSqrt значение гистограммы указывает либо проблемы с чувствительностью обнаружения или что небольшие липосомы были исключены во время обработки данных. (D) Липосома интенсивности в (B) преобразуются в фактические диаметры липосомы с использованием фактора коррекции. (E) Коэффициент интенсивности каждой липосомы построен как функция липосомного диаметра теперь могут быть отображены позволяет исследование композиционной неоднородности как функция липосомного размера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важно отметить, что в то время как мы подробно описываем, как один липосомы можно использовать для изучения композиционной неоднородности между отдельными липосомы, платформа очень универсальна. Как было показано ранее и обсуждается во введении, протокол может быть легко адаптирован для изучения аспектов мембранно-мембранного синтеза, белково-мембранных взаимодействий или липосомальной характеристики носителя наркотиков. Для любых научных вопросов, которые рассматриваются, сила одного липосомного исследования заключается в способности обнаруживать отдельные компоненты ансамбля и, таким образом, имеющих количественные считыватель, а не предвзято ансамбль усреднения эффектов.
Один липосомообразный анализ оптимально подходит для методов визуализации поверхности, таких как полное внутреннее отражение или конфокальный микроскоп, где секция направления может устранить нежелательную фоновом флуоресценцию из раствора над липосомного слоем. Тем не менее, этот аспект является наиболее важным для исследований, где флуоресцентно помечены соединения, такие как пептиды, белки, или другие липосомы добавляются в раствор и остаются там во время визуализации. Например, если анализ используется в формате, подробно описанном здесь, где флуоресцентные красители ограничены обездвижеными липосомы, анализ в принципе может быть выполнен с помощью более широко доступных широкоугольных микроскопов, обеспечивая обнаружение система достаточно чувствительна.
Априори нет никаких ограничений в отношении метода, используемого для подготовки липосом, используемых в ассе. Здесь мы подробно описываем использование техники замораживания сушиния. Тем не менее, ранее хлороформ основе липидной регидратации или этанола инъекционных методов были использованы для изготовления липосом, используемых в анализа5,6. Критическим параметром является включение минутной доли биотинилатированных липидов в липидную смесь для обеспечения иммобилизации (рекомендуется 0,05 мл). Другим необходимым элементом является включение небольшого количества флуоресцентно помеченных липидов. В целом, количество липидного красителя добавил следует держать как можно ниже, чтобы избежать закалки эффекты и избежать липид-краситель от существенного изменения физико-химических свойств липосомы. Нижний предел количества липидного красителя устанавливается концентрацией, где стохастические изменения в количестве отдельных липидных красителей на липосому становится значительным по сравнению со средним количеством липидных красителей (см. Ларсен и др.6 для углубленного обсуждения). Переход ниже этого предела введет большие неопределенности в извлеченных интенсивности. Наконец, количество липидного красителя должно быть достаточно высоким для точного обнаружения одной липосомы с хорошим соотношением сигнала к шуму. Хотя этот критерий, конечно, в значительной степени зависит от системы визуализации, мы обнаружили, что концентрации липидных красителя между 0,05 и 0,5 мл% хорошо работают в подавляющем большинстве случаев.
Чтобы выбрать, какой липидный краситель включить в липосому, первым условием является то, что возбуждение и свойства выбросов соответствуют освещенности и обнаружения возможностей системы визуализации. Во-вторых, для повышения чувствительности и точности метода рекомендуем использовать красители как с высокими квантовыми урожаями, так и с фотостабильностью, а ранее мы успешно использовали красители с различными длинами волнвозбуждения 6,11. Следует позаботиться о выборе липидных якорей с аналогичными физикохимическими свойствами, чтобы не привести к искусственно высокой неоднородности липидного перегородки. Например, для этого протокола, мы якорь как фторофоры с помощью DOPE, в то время как один флюорофор на DOPE, а другой на DPPE может привести к неоднородности распределения фторофора не связаны с присущей inhomogeneity в популяции липосомы. Специально для двойной визуализации цвета важно выбрать красители с узким возбуждением и спектра мигания и наименьшее спектральное перекрытие, как это возможно, чтобы избежать значительного кровотечения через, перекрестный разговор, и флуоресценция резонанса передачи энергии (FRET) между красителей и каналов. Чтобы избежать артефактов, связанных с изменением среды фторофора, мы предпочитаем работать с красителями, которые были доказаны экспериментально, чтобы показать крайне низкую склонность взаимодействия мембраны, как это определено Хьюз и др.26. Наконец, если конкретные липосомы липидной композиции не является жестким требованием для экспериментального дизайна, это может быть полезно включить до 10 мол% отрицательно заряженных липидов, чтобы отдельные липосомы отталкивают друг друга и эффективно обездвижены в качестве одной липосомы12.
Преимуществом одного липосомного асссея является небольшой экспериментальный объем, который может значительно уменьшить количество дорогих или редких соединений, используемых в ходе эксперимента. Здесь мы описываем использование стандартных и коммерчески доступных камер с экспериментальным объемом от 150-300 л. Тем не менее, на заказ микроскоп камер, которые могут уменьшить объем до диапазона 50-80 Зл может быть использован. Кроме того, потребление липосом очень низка, с окончательной концентрацией около 2 ММ общего липидов.
Недостатком одного липосомного асссея является то, что трудно контролировать концентрацию липидов в камере из-за изменений в тенденциях иммобилизации, описанных выше. Кроме того, в отношении применения анализ для изучения мембранно-белковых взаимодействий, это сложно определить концентрацию или количество связанных белков непосредственно от интенсивности флуоресценции.
При использовании липосом в анализе в качестве мембранных моделей систем (например, для изучения мембранного взаимодействия флуоресцентных соединений, пептидов или белков) важно обеспечить низкую неспецифическую связующую к белковым компонентам, что облегчает Иммобилизации. Если это не так, может быть обнаружен высокий фоновый сигнал, который может предотвратить обнаружение специфической привязки к липосом. При обнаружении высокого неспецифического фона мы ранее успешно снижали фон, переопределившись с стрептавидина на неутравидин или авидина.
Выполнение одного обнаружения липосом с использованием других методов, таких как цитометрия потока потенциально может предложить повышенную пропускную мощность по сравнению с микроскопом на основе анализа. Однако, учитывая, что цитометры потока оптимизированы для изучения гораздо больших и ярких образцов, таких как клетки, система обнаружения большинства из них недостаточно чувствительна, чтобы обнаружить относительно слабую флуоресценцию от отдельной липосомы. Таким образом, в то время как новые и более чувствительные цитометрии потока в настоящее время разрабатывается микроскоп на основе анализ предлагает лучшее решение для выяснения липосома неоднородности при выполнении эффективно и мониторинга тысяч липосом за эксперимент.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована Датским советом независимых исследований (грант No 5054-00165B).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
