A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes
Summary
Ce protocole décrit la fabrication de liposomes et comment ceux-ci peuvent être immobilisés sur une surface et représentés individuellement d’une manière parallèle massive à l’aide de la microscopie fluorescence. Cela permet de quantifier la taille et l’inhomogénéité compositionnelle entre les liposomes simples de la population.
Abstract
La plupart des recherches utilisant des liposomes comme systèmes de modèles membranaires ou porteurs de médicaments s’appuient sur des techniques de lecture en vrac et supposent donc intrinsèquement que tous les liposomes de l’ensemble sont identiques. Cependant, de nouvelles plates-formes expérimentales capables d’observer les liposomes au niveau d’une seule particule ont permis d’effectuer des études très sophistiquées et quantitatives sur les interactions protéines-membranes ou les propriétés des porteurs de médicaments sur des liposomes individuels, évitant ainsi les erreurs de la moyenne d’ensemble. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation, la détection et l’analyse de liposomes simples à l’aide d’un test de microscopie à base de fluorescence, facilitant ces mesures à partiilule unique. La configuration permet d’imagerie liposomes individuels d’une manière massive parallèle et est utilisé pour révéler la taille intra-échantillon et les inhomogénéités de composition. En outre, le protocole décrit les avantages de l’étude des liposomes au niveau liposome unique, les limites de l’assay, et les caractéristiques importantes à considérer lors de sa modification pour étudier d’autres questions de recherche.
Introduction
Les liposomes sont des vésicules sphériques à base de phospholipides qui sont fortement utilisées à la fois dans la recherche fondamentale et appliquée. Ils fonctionnent comme d’excellents systèmes de modèle membranaire, parce que leurs propriétés physiochimiques peuvent être facilement manipulées en variant les composants lipidiques composant le liposome1,2. En outre, les liposomes constituent le système de nanoporteur de livraison de médicaments le plus utilisé, offrant une pharmacocinétique et une pharmacodynamiie améliorées ainsi qu’une biocompatibilité élevée3.
Pendant de nombreuses années, les liposomes ont principalement été étudiés à l’aide de techniques en vrac, ne donnant accès qu’aux valeurs moyennes de lecture de l’ensemble. Cela a conduit la majorité de ces études à supposer que tous les liposomes de l’ensemble sont identiques. Toutefois, ces valeurs moyennes d’ensemble ne sont correctes que si l’ensemble de données sous-jacent est uniformément réparti autour de la valeur moyenne, mais peut représenter une conclusion fausse et biaisée si l’ensemble de données comprend plusieurs populations indépendantes, par exemple. En outre, en supposant que l’ensemble signifie représenter l’ensemble de la population peut négliger l’information contenue dans l’inhomogénéité entre les liposomes. Ce n’est que récemment que des essais quantitatifs ont émergé qui sont capables de sonder les liposomes simples, révélant de grandes inhomogénéités entre les liposomes individuels en ce qui concerne les propriétés physicochimiques importantes, y compris la taille liposome4, composition lipidique5,6, et l’efficacité de l’encapsulation7, soulignant l’importance d’étudier les liposomes au niveau liposome unique.
Un domaine de recherche où la moyenne d’ensemble des propriétés liposome a été montrée aux résultats de biais est étudiant les interactions de protéine-membrane dépendantes de liposome8,9. Traditionnellement, les chercheurs qui étudient de tels processus ont été limités à la préparation de liposomes avec différents diamètres moyens d’ensemble par extrusion à travers des filtres avec différentes tailles de pores9. Cependant, l’extraction du diamètre des liposomes individuels à l’aide d’essais liposome simples a révélé de grands chevauchements de population, avec des liposomes extrudés utilisant des filtres de 100 nm et 200 nm affichant jusqu’à 70% de chevauchement dans leur distribution de taille4. Ceci pourrait sérieusement biaiser des mesures en vrac des interactions protéine-membrane dépendantes de la taille liposome10. En effectuant les études d’interaction membrane-protéine à l’aide de l’analyse liposome unique, les chercheurs ont plutôt profité de la taille-polydispersity dans l’échantillon, leur permettant d’étudier un large éventail de diamètres de liposome dans chaque expérience, facilitant de nouvelles découvertes de la façon dont la courbure et la composition de membrane peuvent affecter le recrutement de protéine aux membranes4,11,12. Un autre domaine où l’application d’essais liposome simples a prouvé instrumental est dans les études mécanistes de la fusion de membrane protéine-négociée13,14. Pour de telles mesures cinétiques, la capacité d’étudier des événements individuels de fusion a atténué le besoin de synchronisation expérimentale du processus de fusion, permettant de nouvelles perspicacités mécanistes qui auraient autrement été perdues dans la moyenne spatiotemporale faite dans les mesures d’ensemble en vrac. En outre, les liposomes simples ont été employés comme échafaudage de membrane, permettant la mesure des protéines individuelles et offrant de nouvelles connaissances sur la dynamique structurale de protéine transmembrane15,16. En outre, ces configurations à base de protéoliposome ont permis d’étudier la fonction des transporteurs transmembranaires individuels17 et les complexes protéiques de formation de pores18 ainsi que le mécanisme des peptides bioactifs de lamembrane-perméabilisant19. Les liposomes simples ont également été utilisés comme nanofluidiques de matière molle avec des liposomes simples immobilisés de surface servant de chambres pour des réactions enzymatiques dans des volumes de 10-19 L, augmentant le débit et la complexité des essais de criblage avec la consommation minimale de produit20.
Récemment, des essais de liposome simples ont été employés pour caractériser des liposomes d’administration de drogue à un niveau précédemment non-precendented de détail. Les chercheurs ont été en mesure de quantifier des inhomogénéités significatives dans la quantité de polymère attachée à la surface des liposomes individuels21. Les essais de liposome simples ont également permis des mesures des liposomes d’administration de drogue dans les médias complexes, tels que le plasma sanguin, révélant comment les éléments ancrés à la surface de liposome par des ancres de lipide peuvent être susceptibles à la dissociation quand les liposomes sont exposés aux conditions imitant ceux éprouvés pendant la circulation in vivo22. Dans l’ensemble, la polyvalence et l’utilité des essais de liposome unique sont corroborées par la grande variété de problèmes que ces configurations ont été employées pour traiter, et nous prévoyons que la méthodologie continuera d’être développée et de trouver l’utilisation dans de nouveaux domaines scientifiques.
Ici, nous décrivons un test de liposome unique à base de fluorescence qui permet d’étudier les liposomes individuels d’une manière à haut débit (figure 1). Pour illustrer la méthode, nous l’utilisons pour quantifier la taille et l’inhomogénéité de composition entre les liposomes individuels au sein d’un ensemble. L’assay utilise l’imagerie au microscope à fluorescence de liposomes simples immobilisés sur une surface de verre passivated. Nous décrivons d’abord les étapes critiques dans le processus de fabrication de liposome qui assure l’étiquetage fluorescent approprié et l’immobilisation. Ensuite, nous décrivons la préparation de surface nécessaire pour faciliter l’immobilisation de liposome avant d’exposer la procédure pour assurer les densités appropriées de surface de liposome. Nous discutons des paramètres de microscopie importants pour l’acquisition d’images de haute qualité et délinuons comment effectuer l’analyse simple de données, permettant l’extraction de la taille de liposome et de l’inhomogénéité compositionnelle. Ce protocole générique devrait fournir une bonne base pour le chercheur intéressé de développer l’essai plus loin pour son intérêt spécifique de recherche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est important de noter que si nous décrivons en détail comment l’analyse des liposomes simples peut être utilisée pour étudier l’inhomogénéité de composition entre les liposomes individuels, la plate-forme est très polyvalente. Comme indiqué précédemment et discuté dans l’introduction, le protocole peut facilement être adapté pour étudier des aspects de la fusion membrane-membrane, des interactions protéine-membrane, ou de la caractérisation liposomique de porteur de drogue. Pour toutes les questions…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par le Conseil danois pour la recherche indépendante [accord 5054-00165B].
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
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