Summary
Denne protokollen beskriver fabrikasjon av liposomer og hvordan disse kan immobilisert på en overflate og avbildet individuelt i en massiv parallell måte ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Dette gjør det mulig for kvantifisering av størrelsen og inhomogeneity mellom enkelt liposomer i populasjonen.
Abstract
De fleste forskning ansette liposomer som membran modellsystemer eller narkotika levering bærere er avhengig av bulk lese-ut teknikker og dermed egentlig forutsetter alle liposomer av ensemblet å være identiske. Men nye eksperimentelle plattformer i stand til å observere liposomer på enkelt-partikkel-nivå har gjort det mulig å utføre svært sofistikerte og kvantitative studier på protein-membran interaksjoner eller stoffet carrier egenskaper på individuelle liposomer, Dermed unngår feil fra ensemble snitt. Her presenterer vi en protokoll for å forberede, oppdage og analysere enkelt liposomer ved hjelp av en fluorescens-basert mikroskopi-analyse, noe som letter slike enkelt partikkel målinger. Oppsettet gjør det mulig å avbilde individuelle liposomer på en massiv parallell måte og brukes til å avsløre intra-sample størrelse og inhomogeneities. I tillegg beskriver protokollen fordelene ved å studere liposomer på enkelt liposome nivå, begrensningene til analysen, og de viktige funksjonene som skal vurderes når du endrer den til å studere andre forskningsspørsmål.
Introduction
Liposomer er sfæriske fosfolipid-baserte blemmer som er mye brukt både i grunnleggende og anvendt forskning. De fungerer som utmerket membran modellsystemer, fordi deres fysiokjemiske egenskaper lett kan manipuleres ved å variere lipid komponentene gjør opp liposome1,2. Liposomer utgjør også det mest brukte legemiddel leverings nanocarrier systemet, som tilbyr forbedrede farmakokinetikken og farmakodynamikk, i tillegg til høy biokompatibilitet3.
I mange år har liposomer først og fremst blitt studert ved hjelp av bulk teknikker, noe som gir kun tilgang til gjennomsnittlige lese-ut-verdier for Ensemble. Dette har ført de fleste av disse studiene til å anta at alle liposomer i ensemblet er identiske. Slike ensemble-gjennomsnitt verdier er imidlertid bare riktige Hvis det underliggende datasettet er jevnt fordelt rundt middelverdien, men kan representere en USANN og partisk konklusjon Hvis datasettet omfatter flere uavhengige populasjoner, for eksempel. I tillegg, forutsatt at ensemblet mener å representere hele befolkningen kan overse informasjonen næret innenfor inhomogeneity mellom liposomer. Bare nylig har kvantitative analyser dukket opp som er i stand til å granske enkelt liposomer, avslører store inhomogeneities mellom individuelle liposomer med hensyn til viktige fysikalsk egenskaper, inkludert liposome størrelse4, lipid sammensetning5,6, og innkapsling effektivitet7, fremhever viktigheten av å studere liposomer på single liposome nivå.
Et forskningsområde der ensemble snitt av liposome egenskaper har vist til bias resultatene studerer liposome størrelse avhengig protein-membran interaksjoner8,9. Tradisjonelt har forskere som studerer slike prosesser vært begrenset til å forberede liposomer med ulike ensemble gjennomsnittlig diameter ved ekstrudering gjennom filtre med ulike pore størrelser9. Men å utvinne diameteren til individuelle liposomer ved hjelp av enkelt liposome analyser har avdekket store befolknings overlappinger, med liposomer ekstrudert ved hjelp av 100 NM og 200 NM filtre viser opp til 70% overlapper hverandre i størrelsesfordelingen4. Dette kan sterkt bias bulk målinger av liposome størrelse-avhengige protein-membran interaksjoner10. Utføre membran-protein interaksjon studier ved hjelp av single liposome analysen, forskere i stedet tok fordel av størrelsen-polydispersitet innenfor prøven, slik at de kan studere et bredt spekter av liposome diametere innenfor hvert enkelt eksperiment, tilrettelegging nye funn av hvordan membran krumning og sammensetning kan påvirke protein rekruttering til membraner4,11,12. Et annet felt der anvendelsen av single liposome analysene har vist seg instrumental er i mekanistisk studier av protein-mediert membran Fusion13,14. For slike kinetisk målinger, evnen til å studere individuelle fusjon hendelser lindres behovet for eksperimentell synkronisering av Fusion prosessen, slik at nye mekanistisk innsikter som ellers ville ha gått tapt i spatiotemporal i snitt gjort i bulk ensemble målinger. I tillegg har enkelt liposomer blitt brukt som et membran stillas, slik at måling av individuelle proteiner og gir ny kunnskap om transmembrane protein strukturelle dynamikk15,16. Videre, slik proteoliposome-baserte oppsett gjort det mulig å studere funksjon av individuelle transmembrane transportører17 og pore-forming protein komplekser18 samt mekanismen av bioaktive membran-permeabilizing peptider19. Enkelt liposomer har også blitt brukt som myke materie-nanofluidics med overflate-immobilisert enkelt liposomer som fungerer som kamre for enzymatisk reaksjoner i volumer på 10-19 L, noe som øker gjennomstrømningen og kompleksiteten i screening-analysene med minimalt produkt forbruk20.
Nylig har enkelt liposome analyser blitt brukt for karakteriserer stoffet levering liposomer på et tidligere unprecendented detaljnivå. Forskerne var i stand til å kvantifisere signifikant inhomogeneities i mengden av polymer festet til overflaten av individuelle liposomer21. Singelen liposome analysene også tillatt målinger av stoffet levering liposomer i komplekse medier, slik som blodplasma, avslørende hvordan elementer forankret til liposome overflaten gjennom lipid ankere kan være utsatt for dissosiasjon når liposomer er utsatt for forhold etterligne de opplevde under in vivo sirkulasjon22. Samlet sett er allsidigheten og nytten av enkelt liposome analysene begrunnes med den store variasjonen av problemer disse oppsettene har vært ansatt for å henvende seg, og vi ser for oss at metodikken vil fortsette å bli utviklet og finne bruk i nye vitenskapelige felt.
Her beskriver vi en fluorescens mikroskopi enkelt liposome-analyse som gjør at individuelle liposomer kan bli studert på en høy gjennomstrømming måte (figur 1). For å illustrere metoden bruker vi den til å kvantifisere størrelsen og inhomogeneity mellom individuelle liposomer i et ensemble. Analysen sysselsetter fluorescens mikroskop Imaging av enkelt liposomer immobilisert på en paddivert glass overflate. Vi først beskrive de kritiske trinnene i liposome fabrikasjon prosessen som sikrer riktig fluorescerende liposome merking og immobilisering. Deretter beskriver vi forbehandling som trengs for å lette liposome immobilisering før skisserte prosedyren for å sikre riktig liposome overflate tetthet. Vi diskuterer mikroskopi parametrene viktig for å anskaffe bilder av høy kvalitet og avgrense hvordan du utfører enkle dataanalyse, slik at utvinning av liposome størrelse og inhomogeneity. Denne generiske protokollen skal gi et godt grunnlag for interesserte forsker til å utvikle analysen videre for hans eller hennes spesifikke forskning interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. liposome forberedelse
Merk: kort, utarbeidelse av liposomer inneholder vanligvis tre viktige trinn: 1) utarbeidelse av tørre lipid filmer av ønsket lipid sammensetning; 2) rehydrering av lipider for dannelse av liposomer; og 3) kontrollere størrelsen og lamellarity av liposome befolkningen.
- Veie ut lipider og oppløse dem i tert-butanol: vann (9:1) i hetteglass.
- Oppløse POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine; MW = 760 g/mol) til 50 mM.
- Oppløse kolesterol (MW = 387 g/mol) til 25 mM.
- Oppløse DOPE-Atto488 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Atto488; MW = 1 316 g/mol) til 0,1 mM.
- Oppløse DOPE-Atto655 (1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Atto655; MW = 1 368 g/mol) til 0,1 mM.
- Oppløse DSPE-PEG2000-biotin (1, 2-distearyl-sn-glycero-3-phosphatethanolamine-N-[biotinyl (polyetylen glykol)-2000]; MW = 3 017 g/mol) til 0,1 mM.
Merk: varm opp lipider til 55 ° c og bruk magnetisk omrøring for å sikre fullstendig oppløsning av lipider. Alternativt kan du bruke en sonikering bad. Ubrukte lipid aksjer kan oppbevares ved-20 ° c i flere måneder.
- Bland lipid aksjer utarbeidet i trinn 1,1 til en molar ratio av POPC: kolesterol: DOPE-Atto488: DOPE-Atto655: DOPE-PEG-biotin 68.95:30:0.5:0.5:0,05, ved å legge 138 μL av POPC, 120 μL av kolesterol, 500 μL av hver fluorescensmerkete merket lipid, og 50 μL av DSPE-PEG-biotin til et friskt hetteglass.
Merk: den eksakte liposome sammensetningen kan enkelt endres for å løse bestemte spørsmål av interesse. Se diskusjonen for flere detaljer. - Løsne lokket på glass flasken og smekk fryse glasset i flytende nitrogen.
- Lyophilize den frosne lipid blandingen over natten.
- Tilsett 1 mL 200 mM D-Sorbitol buffer (Sorbitol buffer) til tørr lipider.
- Varm opp blandingen til 45 ° c og utsett den for magnetisk omrøring i minst 1 time.
Merk: bufferen skal gjenspeile det spesifikke spørsmålet som blir tatt opp (f.eks. fysiologiske tilstander for å studere membran-protein interaksjoner, eller en spesifikk klinisk godkjent buffer for studier av legemiddellevering liposomer). Men hvis en bestemt buffer ikke er nødvendig for studien, kan en buffer uten ioner brukes for rehydrering for å redusere multilamellarity av liposomer. - Frys lipid suspensjonen ved å dyppe hetteglasset i flytende nitrogen, og vent til suspensjonen er helt frosset.
- Dypp den frosne fjæringen i et oppvarmings bad ved 55 ° c til blandingen er helt tint.
- Gjenta trinn 1,7 og 1,8 til liposome suspensjonen har vært utsatt til totalt 11 fryse/tine sykluser.
Merk: gjentatt fryse/tine sykluser har vist å redusere liposome multilamellarity23, som er avgjørende for nøyaktigheten av singelen liposome analysen, som multilamellar liposomer vil skew fluorescens intensitet versus liposome størrelsesforholdet mellom liposomer. Multilamellarity er vanligvis iboende lav når inkludert mer enn 0,5% pegylert lipid i formuleringen (slik som vanlig gjort i liposomer for narkotika levering)24. - Extrude den liposome suspensjonen en gang gjennom en 800 NM polykarbonat filter ved hjelp av en mini ekstrudering Kit. Følg produsentens instruksjoner for montering av ekstrudering Kit (se tabell over materialer).
- Oppbevar liposomer ved 4 ° c over natten.
2. forbehandling av Imaging Chamber
- Forbered storfe serum albumin (BSA; 1 mg/mL), BSA-biotin (1 mg/mL) og streptavidin (0,025 mg/mL) i 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) 95 mM NaCl buffer (HEPES buffer).
Merk: for å forhindre liposomal burst, skal Sorbitol-bufferen som brukes til rehydrering og HEPES-bufferen som brukes til forbehandling, være isoton. Det anbefales derfor å kontrollere OSMOLARITETSSYSTEM av buffere før eksperimentet. - Bland 1 200 μL av BSA og 120 μL av BSA-biotin og tilsett 300 μL av blandingen til hver brønn i et 8-mikroskopi.
Merk: Her bruker vi et kommersielt tilgjengelig 8 godt mikroskop lysbilde med et glassbunn (se tabell over materialer), men protokollen kan enkelt tilpasses til tilpassede mikroskop kamre. - Ruge lysbildet i 20 min ved romtemperatur (RT).
- Vask lysbildet 8x med 300 μL av HEPES-buffer.
Merk: Vær forsiktig så du ikke forlater brønnene uten buffer i mer enn noen få sekunder, siden tørking av overflaten vil skade den. Videre, vær forsiktig så du ikke skraper overflaten med pipette spissen da dette vil også skade den. Således, når aspirating buffer fra en brønn, gjør det fra kanten eller hjørnet. - Tilsett 250 μL av streptavidin og ruge i 10 min ved RT.
- Gjenta de 8 vasken som er beskrevet i trinn 2,4.
- Oppbevar objektglasset med 300 μL av Sorbitol buffer i hver brønn ved 4 ° c. Fordampning av løsemiddel vil skade overflaten, så sette mikroskopet lysbildet i en Petri parabol og forsegle den med parafilm mindre forberedt lysbildet brukes umiddelbart.
3. liposome immobilisering
- Fortynne liposome suspensjon til ca 20 μM totalt lipid i Sorbitol buffer. Prosedyren i del 1 vil gi en liposome suspensjon på ca 10 mM total lipid.
- Plasser lysbildet på mikroskopet og fokuser på overflaten av kammeret ved hjelp av økt laser refleksjon signal fra glass/buffer-grensesnittet som en guide.
- Vask kammeret 4X med 300 μL av frisk HEPES buffer.
- Tilsett 10 μL av fortynnet liposome lager (20 μM totalt lipid) til en mikrosentrifugen tube.
- Ta ut 100 μL av buffer fra kammeret, Legg til mikrosentrifugen-slangen fremstilt i trinn 3,4, bland riktig, og sett 110 μL tilbake i kammeret.
- Sett prøven under mikroskopet, og bruk en tromme mikroskop innstilling som kan påvise signal fra liposome fluoroforen for å observere at liposomer blir immobilisert på overflaten.
- Mål for en liposome overflate tetthet som samtidig er sparsommelig nok til å identifisere individuelle liposomer og tette nok til at det Letter høykapasitets målinger. Vanligvis ved hjelp av et 50 μm x 50 μm synsfelt, er 300 − 400 liposomer per ramme optimalt (figur 2). Dette kan vanligvis oppnås innen 5 − 10 min.
Merk: Hvis det bare blir påvist raskt bevegelige fluorescerende partikler i synsfeltet, kan et fravær eller for lav konsentrasjon av noen av komponentene som er kritiske for immobilisering prosessen (BSA-biotin, streptavidin, DOPE-PEG-biotin) være årsaken. Hvis det ikke oppdages noen liposomer, kan det enten være relatert til en lav konsentrasjon av liposomer, feil innstillinger for fluorescens deteksjon eller potensielt bildebehandling med et fokal fly som ikke er på glassflaten. - Når en passende liposome overflate tetthet er nådd, vask kammeret 3x med 200 μL av HEPES buffer.
Merk: Vær oppmerksom på at immobilisering Kinetics også avhenger av liposome egenskaper som størrelse og ladning, og bør derfor alltid optimaliseres for hver liposome formulering.
4. image oppkjøp
Merk: denne delen vil avhenge mye på mikroskopet systemet tilgjengelig for forskeren å utføre eksperimentet. Således, total retningslinjene opp på hvor å utføre det tenkelig ville være beskrevet. De nøyaktige innstillingene og hvordan du bruker dem, vil imidlertid variere mellom de ulike mikroskop oppsettene. Noen systemer tillater for eksempel valg av eventuell utslipps filterkombinasjon, mens andre mikroskop er utstyrt med spesifikke, forhåndsinnstilte filtre.
- Sett opp mikroskopet for Imaging enkelt liposomer. For å sikre optimal bildekvalitet og påfølgende dataanalyse må du bruke en høy gråskala oppløsning og et pikseloppsett som muliggjør oversampling individuelle liposomer. En bit dybde på 16 og minst 1 024 x 1 024 piksler for en 50 μm x 50 μm området anbefales. Hvis tilgjengelig, kan linje snitt beneficially brukes for å redusere støy (for eksempel 3 skanninger per linje).
- Velg en eksitasjon laser effekt som begge sikrer nonsignificant ramme-til-ramme bleking og sterkt nok signal til å klart diskriminere individuelle liposomer fra bakgrunnen. Den optimale innstillingen vil avhenge av det spesifikke mikroskopet som brukes i tillegg til den fluoroforen kombinasjonen. Pass på at detektorer ikke er mettet, da dette vil bias intensitet kvantifisering.
- Imaging både DOPE-Atto488 og DOPE-Atto655 fluorophores i liposomer krever Imaging flere kanaler. Sørg derfor for at hver kanal er avbildet sekvensielt for å unngå kryss eksitasjon. For eksempel, først ta ett bilde av spennende på 488 NM og lesing utslipp på 495 − 560 NM. Deretter tar du et nytt bilde av spennende på 633 NM, men leser utslipp bare på 660 − 710 NM. Detaljene vil avhenge av mikroskop systemet (f. eks, hvilke lasere og filtre) tilgjengelig.
- Sørg for å dekke ulike områder av overflaten, anskaffe minst 10 bilder av prøven, og dermed Imaging minst 3 000 individuelle liposomer. Hvis overflate tettheten er lavere enn 300 liposomer/ramme, anskaffe flere bilder. Sørg for å fokusere mikroskopet på nytt for hvert nye bilde.
Merk: for to-kanals bildebehandling må du sørge for å navngi bildefilene slik at par med bilder med samme liposomer i forskjellige fluorescens kanaler enkelt kan identifiseres under dataanalyse. - For å kvantifisere den eksperimentelle usikkerheten knyttet til måling av inhomogeneity, skal bildet være det samme området av liposomer før og etter refocusing (se Figur 3 og beskrivelse i teksten).
- Eksporter bildene fra mikroskop programvaren som. TIFF-filer. Eksporter de to kanalene med samme liposomer enkeltvis.
5. data analyse
Merk: spesielt utviklede automatiserte 2D Gaussian montering rutiner har tidligere vært ansatt6,11,12. Men for å øke anvendelsen av metoden en dataanalyse prosess som lett kan implementeres i alle laboratorier er beskrevet.
- Legg tilsvarende par av. TIFF-bilder av to forskjellige fluorescens kanaler i samme bildefelt inn i FIJI (FIJI er Just ImageJ) programvare.
- Velg fargei bilde menyen, og bruk funksjonen slå sammen kanal til å opprette en sammensetning av de to kanalene.
- Observer om liposomer avbildet i to forskjellige kanaler viser god colocalization eller om synlig drift inntraff.
Merk: i tilfelle av drift mellom de to fluorescens kanaler (anerkjent som en systematisk og lik X-Y offset mellom signalet i de to kanalene), en av rammene kan oversettes ved hjelp av Transform ≫ oversett funksjon i bilde menyen i FIJI. Imidlertid bør forsiktighet tas med slike bilde manipulasjon. Det er derfor anbefalt å i stedet unngå drift så mye som mulig når Imaging de liposomer. - Kontroller at ComDet plugin (v. 0.3.6.1 eller nyere) er installert, eller gjøre dette i plugins -menyen.
- Åpne ComDet plugin for å oppdage partikler ved å gå til plugins -menyen og velge ComDet v. 0.3.6.1 > Detect partikler.
- I ComDet, sørg for å velge Finn partikler på begge kanaler individuelt funksjon. Angi maksimal avstand mellom co-lokaliserte spots ligner på omtrentlig partikler størrelse. Vanligvis er 4 piksler passende for innstillingene som er beskrevet her.
- Signal-til-støy-forholdet bør muliggjøre påvisning av selv svake partikler med en lav mengde fluorescens. I ComDet, sette dette forholdet til 3 ved å sette følsomhet for deteksjon i begge kanaler til svært Dim partikler (SNR = 3).
Merk: selv om denne SNR-verdien er vanligvis hensiktsmessig, kan det være nødvendig å sette den høyere (for eksempel hvis det er mye bildestøy som kan identifiseres som liposomer og føre til falske positiver). - Kontroller at boksene med Beregn Colocalization og plott oppdagede partikler i begge kanaler er merket av, før du trykker OK.
- Etter å ha kjørt analysen, vil to popup-vinduer med resultater og oppsummering vises. Eksportere datatabell resultatene som inneholder colocalization data (partikkel koordinater og integrert intensitet av hver partikkel oppdaget) til en datahåndtering programvare av valget ved å lagre tabellen som en txt-fil og importere den inn i programvaren.
- Sørg for at hver liposome er bare inkludert en gang i datasettet og ikke både Channel1/tokanals2 samt tokanals2/Channel1 ratio. Dermed filtrerer du dataene slik at bare Abs_frame = 1 tegnes inn i trinn 5,11.
Merk: ved å velge Colocalized = 1, falske positiver fra støy i bildene kan fjernes fra analysen. Noen liposomer med bare én av de to fluorescerende komponentene som finnes, vil imidlertid også bli ekskludert fra analysen, og dermed potensielt fjerne viktige datapunkter fra analysen. - Plot et histogram av kolonnen med data som inneholder intensitet ratio for hver oppdaget liposome.
- Graden av inhomogeneity for det studerte liposomal systemet representeres av bredden på fordelingen av intensitet forholdet. Å kvantifisere inhomogeneity, passe intensiteten forholdet histogram med en Gaussian funksjon og trekke gjennomsnittet (μ) og standardavvik (Sigma). Se delen representant resultater.
- En verdi for graden av inhomogeneity (DI) kan nå beregnes ved hjelp av variasjonskoeffisienten definert som DI = Sigma/μ.
6. kalibrering av liposome størrelse
- Ta ut en del av liposome lager, og extrude 21x gjennom et 50 NM polykarbonat filter som beskrevet i trinn 1,10.
- Fortynne liposomer ved å tilsette 10 μL av liposome fjæring til 800 μL av Sorbitol buffer i et mikrosentrifugen rør.
- Overfør den fortynnede liposome prøven til en polypropylen-Cuvette.
- Målstørrelsen ved hjelp av dynamisk lysspredning (DLS). Utfør minst tre selvstendige løyper for å måle størrelsen og polydispersitet på liposome suspensjonen.
Merk: Bruk om nødvendig en mer konsentrert liposome suspensjon for målingen. Alternativer til DLS (f. eks, nanopartikkel Tracking analyse) kan også brukes for å måle størrelsen på liposomer. En beskrivelse av hvordan du utfører en slik partikkel størrelses bestemmelse er utenfor omfanget av denne protokollen. - Avbilde kalibrerings liposomer på mikroskopet med nøyaktig de samme eksperimentelle innstillingene som definert i trinn 4,1 og 4,2.
- Pakk ut den integrerte intensiteten for hver kalibrerings liposome i kalibrerings bildene: Pakk ut det filtrerte resultat arket som inneholder liposome fluorescens intensitet som beskrevet i trinn 5.1 − 5.10. Pakk ut "IntegratedInt"-kolonnen fra resultattabellen.
- Fordi den totale integrerte intensiteten av en liposome merket i membranen er proporsjonal med overflatearealet av liposome og er dermed proporsjonal med kvadratet av diameter, plotte en kvadratrot intensitet histogram av fluorescens intensiteten av og kalibrerings liposomer.
- Tilpass histogrammet med integrert intensitet som ble produsert i trinn 6,7, med en vanlig Logg fordeling, og trekk ut den gjennomsnittlige fluorescens intensiteten til kalibrerings liposomer.
- For å bestemme forholdet mellom kvadratroten intensitet (intsqrt) og liposome størrelse, beregne korreksjon faktor (C) ved hjelp av gjennomsnittlig liposome diameter (DIA) veies av tallet innhentet fra DLS mål: dia = C x intsqrt tilsvarer C = dia/intsqrt.
- Beregn intsqrt verdier for liposomer i inhomogeneity eksperimentet, og Konverter disse til diametre ved å multiplisere med korrigeringsfaktoren.
- Tegnverdien for intensitet ratio som en funksjon av diameter for inhomogeneity liposomer, og dermed oppnå inhomogeneity som en funksjon av liposome størrelse for en populasjon av liposomer som strekker seg fra ca 50 NM − 800 NM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen beskrevet gjør det mulig å image enkelt liposomer i en massiv parallell måte (figur 1). Den vellykkede overflate immobilisering av liposomer bør umiddelbart åpenbare ved tilsetning av liposome løsningen til kammeret (trinn 3,6 i protokollen) som Diffraksjon begrenset intensitet flekker skal vises i bildet (figur 1B og figur 1C).
For å oppnå god statistikk og utnytte høy gjennomstrømming evnene til analysen, bør flere tusen liposomer bli avbildet. For å gjøre dette på et rimelig antall bilder, anbefales det å nakkens nok liposomer til å oppnå en tetthet på 300 − 400 liposomer per ramme, da dette vil bringe antall bilder per prøve ned til ~ 10, og dermed begrense antall bilder som må anskaffes og analyseres. En lavere tetthet vil gjøre dataanalysen mer tidkrevende, mens en høyere tetthet kan gjøre det utfordrende for bildet analyseprogramvare for å skille enkelt liposomer. For å få et visuelt inntrykk av hvordan 300 − 400 liposomer ser ut, se figur 2a. Det bemerkes imidlertid at for noen applikasjoner (f. eks, membran-protein interaksjoner med et protein som har en tendens til å lokke fram sterk bakgrunn binding til BSA overflaten) anbefales det å bruke en litt lavere tetthet, for eksempel i figur 2a øverst til høyre.
Noen ganger, når anskaffe bilder er det vanskelig å få hele synsfeltet i riktig fokus, som illustrert i figur 2B. Slike problemer kan tyde på at prøveplaten vipper, noe som kan oppstå fra at platen ikke plasseres riktig på prøveholderen på mikroskopet. Likeledes, hvis liposomer synes store og uklare, buffer i kammeret kan ha fordampet og overflaten tørket ut. Det er spesielt viktig å ha dette problemet i bakhodet når bildebehandling for lang tid perioder eller når du utfører målinger ved temperaturer høyere enn RT. For å illustrere forskjellen mellom riktig lagret og tørket ut liposomer, er et bilde av samme prøve før og etter tørking av kammeret vist i figur 2C.
Etter å ha sikret optimal bildekvalitet, kan den integrerte intensiteten for hver liposome i de to bilde kanalene trekkes ut ved å følge trinnene i avsnitt 5 i denne protokollen. Dette vil skape en liste over unike intensitet verdier, slik at vi kan beregne intensiteten ratio for hver enkelt liposome. Den inhomogeneity er evaluert fra intensitet ratio histogrammer, vanligvis avslører en Gaussian distribusjon rundt en gjennomsnittlig ratio verdi (Figur 3a). Legg merke til at hvis det observeres sterke avvik fra en Gaussian-fordeling (Figur 3B), indikerer det et problem med gjenkjennings følsom het for minst én av bilde kanalene, noe som tyder på at et delsett av liposomer som viser et svakere signal, er utelukket. Dette kan skyldes både deteksjons grensen til bilde systemet eller eksklusive liposomer i dataanalysen (f.eks. ved bruk av en viss minimums terskel, se trinn 5,7).
Beregning av DI-verdien som beskrevet i trinn 5.11 − 5.13 i protokollen vil gi en kvantitativ måling av inhomogeneity mellom de individuelle liposomer av preparatet. For liposomal systemet studert her, DI = 0,23 ± 0,01 (Figur 3C). Denne verdien kan brukes til å systematisk sammenligne hvor varierende liposome egenskaper eller Forberedelses metoder påvirker inhomogeneity. For å conceptualize betydningen av DI-verdien refererer vi til normalfordelingen som vises i histogrammet for intensitet, noe som betyr at de vil adlyde den empiriske 68 -95-99.7 regelen. Denne regelen beskriver prosenten av en populasjon som faller innenfor én, to og tre standardavvik rundt middelverdien. For DI-verdien av 0,23 ± 0,01 funnet her, betyr det at 32% av liposomer i befolkningen vil ha en intensitet ratio som avviker med mer enn 23% fra gjennomsnittet molar forholdet mellom ensemblet (Figur 3D).
For kontroll eksperimentet Imaging samme liposomer før og etter refocusing (del 4,6), den samme dataanalyse og resultat plotting som for selve eksperimentet er utført. Å gjøre dette gjør det mulig for kvantifisering av eksperimentell usikkerhet i DI verdi, som ble funnet å være DIusikkerhet = 0,10 ± 0,01 (Figur 3E). Selv om diusikkerhet verdien vil avhenge av ansatt Imaging system, ble det funnet at konfokalmikroskopi mikroskop oppsett konsekvent gi opphav til diusikkerhet verdier på rundt 0,105,6. DI-verdien av DI = 0,23 ± 0,01 funnet for liposomal systemet her er mer enn dobbelt så eksperimentell usikkerhet, noe som tyder på tilstedeværelsen av betydelig sammensetning inhomogeneity mellom de enkelte liposomer av preparatet.
Utføring av størrelses kalibrerings forsøket som er beskrevet i avsnitt 6, vil gjøre det mulig å omdanne vilkårlige liposome intensitet til fysiske diametre i nanometer. Metoden har blitt validert mot andre Imaging teknikker25 som kryogene elektron mikroskopi, som har en evne til å optisk løse nanometer-sized liposomer, men med mye lavere gjennomstrømming. Imaging kontroll prøven med nøyaktig samme mikroskop innstillingene som brukes for de faktiske eksperimenter, er det nå mulig å relatere gjennomsnittlig liposome intensitet til gjennomsnittlig liposome diameter bestemmes av DLS (Figur 4A). Det neste trinnet er å skildre liposome intensitet fordelingen, som basert på de fysiske begrensningene mot å skape ekstremt små liposomer, vanligvis vil vise en logg normalfordeling (Figur 4B). Hvis fordelingen ikke er godt beskrevet av en logg normalfordeling (oftest på grunn av manglende liposomer med lav intensitet verdier) betyr det at en del av liposome befolkningen ble utelukket enten på grunn av lav mikroskop deteksjon følsomhet eller altfor strenge parametre under dataanalyse (Figur 4C). Det er viktig å fange og løse disse problemene for å sikre saklig data tolkning. Deretter kan intensiteten for hver enkelt liposome i Figur 4B konverteres til faktiske diametere ved hjelp av korrigeringsfaktoren som er fastsatt i Figur 4A (Figur 4D). Etter å bestemme størrelsen på hver liposome, kan DI som en funksjon av diameter nå bli undersøkt ved å plotte intensiteten ratio versus diameter for hver enkelt liposome (Figur 4E). Denne trakten-lignende datastruktur bekrefter tidligere funn at DI verdien øker når liposome størrelse synker6. Det er viktigere at den symmetriske økningen i spredningen av intensitet som er rundt en middelverdi, antyder at det ikke finnes noen systematisk størrelses avhengig variasjon i den gjennomsnittlige sammensetningen av liposomer.
Figur 1: singelen liposome analysen. (A) liposomer er formulert med et ekvimolare innhold av fluorescensmerkete merket lipider dope-ATTO488 og dope-Atto655 og immobilisert på en BSA overflate ved hjelp av en biotin/streptavidin kobling. (B) immobilisert liposomer er avbildet ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop, noe som åpner for påvisning av fluorescens intensitet fra enkelt liposomer. Skala bars = 8 μm. (C) zoom av det grønne området i (B) avbildet som overflate intensitet plot for to tilstøtende liposomer viser invertert fluorescerende signal mellom de to kanalene, som illustrerer begrepet av inhomogeneity. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: optimalisering og fallgruver. (A) øverst til venstre vises 29 liposomer immobilisert i en 50 μm x 50 μm ramme. Disse er for få liposomer per ramme for å utnytte muligheten for etterforskning med høy gjennomstrømming av liposome inhomogeneity. Øverst til høyre vises 123 liposomer per ramme. Dette er en suboptimal tetthet, men kan brukes hvis mange bilder er ervervet. Nederst til venstre vises 300 − 400 liposomer per ramme. Dette er optimalt for protokollen som er beskrevet her. Nederst til høyre vises mer enn 1 500 liposomer per ramme, noe som er for mange til å skille mellom individuelle liposomer. Det er en høy risiko for at et enkelt sted faktisk vil være to liposomer immobilisert innenfor samme Diffraksjon begrenset sted. (B) hvis kammeret ikke plasseres riktig i prøveholderen, vil det være umulig å få hele synsfeltet i riktig fokus. I venstre mikroskop er platen vippe rundt traversering aksen, noe som gir opphav til nedre venstre hjørne er ute av fokus. I høyre mikroskop er platen vippe rundt langsgående aksen, noe som gir opphav til en tyngre vippe. Både nedre venstre og øvre høyre hjørne er ute av fokus. (C) hvis bildebehandling for lange tidsperioder eller ved forhøyede temperaturer, kan bufferen fordampe, noe som fører til uttørking av kammeret. Vi illustrerte dette scenariet her ved Imaging liposomer før og etter kammeret ble etterlatt for å tørke i 3 min, og deretter rewetted ved å legge frisk buffer til kammeret. De resulterende liposomer er større, uskarpe, har lavere fluorescens intensitet, og ser ut til å være spredt ut på tallerkenen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: intensitet ratio histogrammer for kvantifisere liposome inhomogeneity. (A) intensiteten ratio av dope-ATTO488 og dope-Atto655 fluorescens for hver enkelt liposome plottet som et histogram. (B) en avkortet Gaussian-fordeling som illustrerer et potensielt problem med følsomhet, enten under avbildning eller i behandlingstrinnet for databehandling. (C) montering av intensiteten histogram med en Gaussian-funksjon gjør det mulig å trekke ut gjennomsnittet og standardavviket som brukes til å beregne di-verdien. (D) en di verdi på 0,23 kan oversettes til 32% av befolkningen avviker med mer enn 23% fra gjennomsnittet molar forholdet mellom ensemblet. (E) kontrollere eksperimentet Imaging samme liposomer før og etter refocusing og deretter utføre samme databehandling prosedyre som for selve eksperimentet. Dette gjør at den eksperimentelle feil for DI kvantifisering skal fastsettes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: konvertere liposome intensitet til fysisk diameter i NM. (A) intensitet histogrammet av 50 NM ekstrudert kalibrering liposomer SAMMENLIGNET med DLS data for å bestemme kalibrering faktor. (B) et histogram for intsqrt -verdien fra de eksperimentelle liposomer gir vanligvis en logg normalfordeling på grunn av de fysiske begrensningene mot å opprette svært små liposomer. (C) en ikke-log-normal intsqrt -verdi histogram indikerer enten problemer med deteksjonsfølsomhet eller at små liposomer ble utelatt under databehandling. (D) liposome intensitet i (B) konverteres til faktiske liposome diametere ved hjelp av korreksjonsfaktoren. (E) intensiteten ratio av hver liposome plottet som en funksjon av liposome diameter kan nå vises slik at etterforskningen av inhomogeneity som en funksjon av liposome størrelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er viktig å merke seg at mens vi beskriver i detalj hvordan enkelt liposomer analysen kan brukes til å studere inhomogeneity mellom individuelle liposomer, er plattformen svært allsidig. Som tidligere vist og diskutert i innledningen, kan protokollen lett bli tilpasset for å studere aspekter ved membran-membran fusjon, protein-membran interaksjoner, eller liposomal stoffet carrier karakterisering. For noen vitenskapelige spørsmål blir adressert, kraften i singelen liposome analysen ligger i evnen til å oppdage de enkelte komponentene i ensemblet og dermed ha en kvantitativ avlesning, ikke partisk av ensemblet snitt effekter.
Singelen liposome analysen er optimalt egnet for overflate Imaging modaliteter som total intern refleksjon eller konfokalmikroskopi mikroskop, der Z-retning snitting kan eliminere uønsket bakgrunn fluorescens fra løsningen over liposome laget. Dette aspektet er imidlertid viktigst for studier der fluorescensmerkete merket forbindelser, for eksempel peptider, proteiner eller andre liposomer legges til løsningen og forbli der under bildebehandling. For eksempel, hvis analysen brukes i formatet beskrevet i detalj her, der fluorescerende fargestoffer er begrenset til immobilisert liposomer, kan analysen i prinsippet utføres ved hjelp av mer bredt tilgjengelig widefield mikroskop, gir deteksjon systemet er følsomt nok.
A priori det er ingen begrensninger med hensyn til metoden som brukes til å forberede liposomer brukes i analysen. Her beskriver vi i detalj bruken av en fryse-tørking teknikk. Men tidligere kloroform-baserte lipid rehydrering eller etanol injeksjon-baserte teknikker har vært ansatt for å dikte liposomer brukes i analysen5,6. En kritisk parameter er inkluderingen av et minutt brøkdel av biotinylated lipider i lipid blandingen for å sikre immobilisering (0,05 mol% anbefales). Et annet nødvendig element er å inkludere en liten mengde fluorescensmerkete merket lipid. Samlet, mengden av lipid-Dye lagt bør holdes så lavt som mulig for å både unngå slukke effekter og for å unngå lipid-Dye fra betydelig endre fysikalsk egenskapene til liposome. Den nedre grensen for mengden av lipid fargestoff er satt av konsentrasjonen, der Stokastisk variasjon i antall individuelle lipid fargestoffer per liposome blir betydelig sammenlignet med den gjennomsnittlige mengden av lipid-fargestoffer (se Larsen et al.6 for en grundig diskusjon). Å gå under denne grensen vil innføre stor usikkerhet i den utpakkede intensiteten. Til slutt, mengden av lipid fargestoff må være høy nok for nøyaktig påvisning av enkelt liposomer med et godt signal-til-støy-forhold. Mens dette kriteriet selvfølgelig avhenger sterkt på Imaging system, fant vi at lipid fargestoff konsentrasjoner mellom 0,05 og 0,5 mol% fungerer godt i de aller fleste tilfeller.
Å velge hvilke lipid fargestoff å inkludere i liposome, den første forutsetningen er at eksitasjon og utslipps egenskaper matche belysning og deteksjon evner av Imaging system. For det andre, for å øke følsomheten og nøyaktigheten av metoden anbefaler vi å bruke fargestoffer med både høy Quantum gir og photostability, og vi har tidligere brukt fargestoffer med ulike eksitasjon bølgelengder6,11. Forsiktighet bør utvises i valg av lipid ankere med lignende fysikalsk egenskaper for å sikre at lipid partisjonering ikke fører til kunstig høy inhomogeneity. For eksempel, for denne protokollen, har vi forankret både fluorophores bruker DOPE, mens du har en fluoroforen på DOPE og en annen på DPPE kan føre til fluoroforen distribusjon heterogeniteter ikke relatert til den iboende inhomogeneity i liposome befolkningen. Spesielt for dual farge Imaging er det viktig å velge fargestoffer med smale eksitasjon og utslipp Spectra og den minste Spectral overlapping som mulig for å unngå betydelig blø gjennom, crosstalk, og fluorescens resonans energi overføring (bånd) mellom fargestoffer og kanaler. For å unngå artefakter knyttet til variasjon i fluoroforen miljøet foretrekker vi å arbeide med fargestoffer, som er påvist eksperimentelt å vise ekstremt lav membran interaksjon tilbøyelighet som bestemmes av Hughes et al.26. Til slutt, hvis en bestemt liposome lipid sammensetning er ikke en vanskelig forutsetning for eksperimentell design, kan det være fordelaktig å inkludere opptil 10 mol% av negativt ladet lipider å sikre at enkelte liposomer slå tilbake hverandre og er effektivt immobilisert som enkelt liposomer12.
En fordel med singelen liposome analysen er den lille eksperimentelle volumet, som i stor grad kan redusere mengden av dyre eller sjeldne forbindelser som brukes per eksperiment. Her beskriver vi bruken av standard og kommersielt tilgjengelige kamre med et eksperimentelt volum mellom 150 – 300 μL. Spesiallagde mikroskop kamre som kan redusere volumet til et område på 50 – 80 μL kan imidlertid brukes. Dessuten er liposome forbruk svært lav, med en endelig konsentrasjon rundt 2 μM totalt lipid.
En ulempe med singelen liposome analysen er at det er vanskelig å kontrollere lipid konsentrasjonen i kammeret på grunn av variasjoner i immobilisering tendenser beskrevet ovenfor. I tillegg, med hensyn til å anvende analysen for å studere membran-protein interaksjoner, er det utfordrende å bestemme konsentrasjonen eller antall bundne proteiner direkte fra fluorescens intensitet.
Ved bruk av liposomer i analysen som membran modellsystemer (f. eks, for å studere membranen interaksjon av fluorescerende forbindelser, peptider, eller proteiner) er det viktig å sikre lav ikke-spesifikk binding til proteinkomponenter som forenkler immobilisering. Hvis dette ikke er tilfelle, kan høy bakgrunns signal oppdages som kan hindre påvisning av den spesifikke bindingen til liposomer. Hvis høy ikke-spesifikk bakgrunn oppdages, har vi tidligere redusert bakgrunnen ved å bytte fra streptavidin til Neutravidin eller avidin.
Utføre enkelt liposome deteksjon ved hjelp av andre teknikker som Flow flowcytometri kan potensielt gi en økt deteksjon gjennomstrømning i forhold til mikroskop-basert analysen. Imidlertid, gitt det flyte cytometers er optimert for studerer mange større og lysere eksemplar like celler, oppdagelsen system av høyst er ikke følsom nok å merker det relativt svak fluorescens fra en individ liposome. Så mens ny og mer følsom flyt flowcytometri utvikles mikroskop-basert analysen tilbyr den beste løsningen for Elucidating liposome inhomogeneities når utført effektivt og overvåking av tusenvis av liposomer per eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av det danske Rådet for uavhengig forskning [Grant Number 5054-00165B].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| Heating plate with Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
