Denne protokollen beskriver fabrikasjon av liposomer og hvordan disse kan immobilisert på en overflate og avbildet individuelt i en massiv parallell måte ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Dette gjør det mulig for kvantifisering av størrelsen og inhomogeneity mellom enkelt liposomer i populasjonen.
De fleste forskning ansette liposomer som membran modellsystemer eller narkotika levering bærere er avhengig av bulk lese-ut teknikker og dermed egentlig forutsetter alle liposomer av ensemblet å være identiske. Men nye eksperimentelle plattformer i stand til å observere liposomer på enkelt-partikkel-nivå har gjort det mulig å utføre svært sofistikerte og kvantitative studier på protein-membran interaksjoner eller stoffet carrier egenskaper på individuelle liposomer, Dermed unngår feil fra ensemble snitt. Her presenterer vi en protokoll for å forberede, oppdage og analysere enkelt liposomer ved hjelp av en fluorescens-basert mikroskopi-analyse, noe som letter slike enkelt partikkel målinger. Oppsettet gjør det mulig å avbilde individuelle liposomer på en massiv parallell måte og brukes til å avsløre intra-sample størrelse og inhomogeneities. I tillegg beskriver protokollen fordelene ved å studere liposomer på enkelt liposome nivå, begrensningene til analysen, og de viktige funksjonene som skal vurderes når du endrer den til å studere andre forskningsspørsmål.
Liposomer er sfæriske fosfolipid-baserte blemmer som er mye brukt både i grunnleggende og anvendt forskning. De fungerer som utmerket membran modellsystemer, fordi deres fysiokjemiske egenskaper lett kan manipuleres ved å variere lipid komponentene gjør opp liposome1,2. Liposomer utgjør også det mest brukte legemiddel leverings nanocarrier systemet, som tilbyr forbedrede farmakokinetikken og farmakodynamikk, i tillegg til høy biokompatibilitet3.
I mange år har liposomer først og fremst blitt studert ved hjelp av bulk teknikker, noe som gir kun tilgang til gjennomsnittlige lese-ut-verdier for Ensemble. Dette har ført de fleste av disse studiene til å anta at alle liposomer i ensemblet er identiske. Slike ensemble-gjennomsnitt verdier er imidlertid bare riktige Hvis det underliggende datasettet er jevnt fordelt rundt middelverdien, men kan representere en USANN og partisk konklusjon Hvis datasettet omfatter flere uavhengige populasjoner, for eksempel. I tillegg, forutsatt at ensemblet mener å representere hele befolkningen kan overse informasjonen næret innenfor inhomogeneity mellom liposomer. Bare nylig har kvantitative analyser dukket opp som er i stand til å granske enkelt liposomer, avslører store inhomogeneities mellom individuelle liposomer med hensyn til viktige fysikalsk egenskaper, inkludert liposome størrelse4, lipid sammensetning5,6, og innkapsling effektivitet7, fremhever viktigheten av å studere liposomer på single liposome nivå.
Et forskningsområde der ensemble snitt av liposome egenskaper har vist til bias resultatene studerer liposome størrelse avhengig protein-membran interaksjoner8,9. Tradisjonelt har forskere som studerer slike prosesser vært begrenset til å forberede liposomer med ulike ensemble gjennomsnittlig diameter ved ekstrudering gjennom filtre med ulike pore størrelser9. Men å utvinne diameteren til individuelle liposomer ved hjelp av enkelt liposome analyser har avdekket store befolknings overlappinger, med liposomer ekstrudert ved hjelp av 100 NM og 200 NM filtre viser opp til 70% overlapper hverandre i størrelsesfordelingen4. Dette kan sterkt bias bulk målinger av liposome størrelse-avhengige protein-membran interaksjoner10. Utføre membran-protein interaksjon studier ved hjelp av single liposome analysen, forskere i stedet tok fordel av størrelsen-polydispersitet innenfor prøven, slik at de kan studere et bredt spekter av liposome diametere innenfor hvert enkelt eksperiment, tilrettelegging nye funn av hvordan membran krumning og sammensetning kan påvirke protein rekruttering til membraner4,11,12. Et annet felt der anvendelsen av single liposome analysene har vist seg instrumental er i mekanistisk studier av protein-mediert membran Fusion13,14. For slike kinetisk målinger, evnen til å studere individuelle fusjon hendelser lindres behovet for eksperimentell synkronisering av Fusion prosessen, slik at nye mekanistisk innsikter som ellers ville ha gått tapt i spatiotemporal i snitt gjort i bulk ensemble målinger. I tillegg har enkelt liposomer blitt brukt som et membran stillas, slik at måling av individuelle proteiner og gir ny kunnskap om transmembrane protein strukturelle dynamikk15,16. Videre, slik proteoliposome-baserte oppsett gjort det mulig å studere funksjon av individuelle transmembrane transportører17 og pore-forming protein komplekser18 samt mekanismen av bioaktive membran-permeabilizing peptider19. Enkelt liposomer har også blitt brukt som myke materie-nanofluidics med overflate-immobilisert enkelt liposomer som fungerer som kamre for enzymatisk reaksjoner i volumer på 10-19 L, noe som øker gjennomstrømningen og kompleksiteten i screening-analysene med minimalt produkt forbruk20.
Nylig har enkelt liposome analyser blitt brukt for karakteriserer stoffet levering liposomer på et tidligere unprecendented detaljnivå. Forskerne var i stand til å kvantifisere signifikant inhomogeneities i mengden av polymer festet til overflaten av individuelle liposomer21. Singelen liposome analysene også tillatt målinger av stoffet levering liposomer i komplekse medier, slik som blodplasma, avslørende hvordan elementer forankret til liposome overflaten gjennom lipid ankere kan være utsatt for dissosiasjon når liposomer er utsatt for forhold etterligne de opplevde under in vivo sirkulasjon22. Samlet sett er allsidigheten og nytten av enkelt liposome analysene begrunnes med den store variasjonen av problemer disse oppsettene har vært ansatt for å henvende seg, og vi ser for oss at metodikken vil fortsette å bli utviklet og finne bruk i nye vitenskapelige felt.
Her beskriver vi en fluorescens mikroskopi enkelt liposome-analyse som gjør at individuelle liposomer kan bli studert på en høy gjennomstrømming måte (figur 1). For å illustrere metoden bruker vi den til å kvantifisere størrelsen og inhomogeneity mellom individuelle liposomer i et ensemble. Analysen sysselsetter fluorescens mikroskop Imaging av enkelt liposomer immobilisert på en paddivert glass overflate. Vi først beskrive de kritiske trinnene i liposome fabrikasjon prosessen som sikrer riktig fluorescerende liposome merking og immobilisering. Deretter beskriver vi forbehandling som trengs for å lette liposome immobilisering før skisserte prosedyren for å sikre riktig liposome overflate tetthet. Vi diskuterer mikroskopi parametrene viktig for å anskaffe bilder av høy kvalitet og avgrense hvordan du utfører enkle dataanalyse, slik at utvinning av liposome størrelse og inhomogeneity. Denne generiske protokollen skal gi et godt grunnlag for interesserte forsker til å utvikle analysen videre for hans eller hennes spesifikke forskning interesse.
Det er viktig å merke seg at mens vi beskriver i detalj hvordan enkelt liposomer analysen kan brukes til å studere inhomogeneity mellom individuelle liposomer, er plattformen svært allsidig. Som tidligere vist og diskutert i innledningen, kan protokollen lett bli tilpasset for å studere aspekter ved membran-membran fusjon, protein-membran interaksjoner, eller liposomal stoffet carrier karakterisering. For noen vitenskapelige spørsmål blir adressert, kraften i singelen liposome analysen ligger i evnen til å oppdage…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av det danske Rådet for uavhengig forskning [Grant Number 5054-00165B].
8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
BSA | Sigma | A9418 | |
BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
HEPES | Sigma | H3375 | |
Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
Na HEPES | Sigma | H7006 | |
NaCl | Sigma | S9888 | |
NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
Streptavidin | Sigma | S4762 | |
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
Ultrapure water | e.g. MilliQ |