Estimulación in Vitro y visualización de la liberación de trampas extracelulares en macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados
Summary
Aquí se presenta un protocolo para detectar la producción de trampaextracelular de macrófagos (MET) en el cultivo de células vivas mediante microscopía y tinción de fluorescencia. Este protocolo se puede ampliar aún más para examinar marcadores específicos de proteína MET mediante la tinción de inmunofluorescencia.
Abstract
La liberación de trampas extracelulares (ET) por neutrófilos se ha identificado como un factor que contribuye al desarrollo de enfermedades relacionadas con la inflamación crónica. Las ET de neutrófilos (NET) consisten en una malla de ADN, proteínas de histona y varias proteínas de gránulos (es decir, mieloperoxidasa, elastasa y catepsina G). Otras células inmunitarias, incluidos los macrófagos, también pueden producir ETs; sin embargo, en qué medida esto ocurre in vivo y si las trampas extracelulares de macrófagos (MET) desempeñan un papel en los mecanismos patológicos no se han examinado en detalle. Para comprender mejor el papel de los MET en las patologías inflamatorias, se desarrolló un protocolo para visualizar la liberación de MET de los macrófagos humanos primarios in vitro, que también se puede explotar en experimentos de inmunofluorescencia. Esto permite una mayor caracterización de estas estructuras y su comparación con los ET liberados de neutrófilos. Los macrófagos derivados de monocitos humanos (HMDM) producen MET al exponerse a diferentes estímulos inflamatorios después de la diferenciación al fenotipo proinflamatorio M1. La liberación de METs se puede visualizar mediante microscopía utilizando una mancha de ácido nucleico fluorescente verde que está impermeant a las células vivas (por ejemplo, SYTOX verde). El uso de macrófagos primarios recién aislados, como el MMDM, es ventajoso en el modelado de eventos inflamatorios in vivo que son relevantes para posibles aplicaciones clínicas. Este protocolo también se puede utilizar para estudiar la liberación de MET de las líneas celulares de monocitos humanos (por ejemplo, THP-1) después de la diferenciación en macrófagos con acetato de mirista phorbol u otras líneas celulares de macrófagos (por ejemplo, las células J774A.1 similares a los macrófagos murinos).
Introduction
La liberación de ETs de neutrófilos se identificó por primera vez como una respuesta inmune innata desencadenada por una infección bacteriana1. Consisten en una columna vertebral del ADN a la que se unen varias proteínas de gránulos con propiedades antibacterianas, incluyendo la aslastasa de neutrófilos y mieloperoxidasa2. El papel principal de las ET de neutrófilos (NET) es capturar patógenos y facilitar su eliminación3. Sin embargo, además del papel protector de las ET en la defensa inmunitaria, un número cada vez mayor de estudios también han descubierto un papel en la patogénesis de la enfermedad, particularmente durante el desarrollo de enfermedades impulsadas por la inflamación (es decir, artritis reumatoide y aterosclerosis4). La liberación de ETs puede ser desencadenada por varias citoquinas proinflamatorias incluyendo interleucina 8 (IL-8) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF)5,6, y la acumulación localizada de ETs puede aumentar el daño tisular y evocar una respuesta proinflamatoria7. Por ejemplo, las ET se han implicado como un papel causal en el desarrollo de la aterosclerosis8,promoviendo la trombosis9, y prediciendo el riesgo cardiovascular10.
Ahora se reconoce que, además de los neutrófilos, otras células inmunitarias (es decir, células de mástil, eosinófilos y macrófagos) también pueden liberar ET en la exposición a la estimulación microbiana o proinflamatoria11,12. Esto puede ser particularmente significativo en el caso de los macrófagos, teniendo en cuenta su papel clave en el desarrollo, la regulación y la resolución de enfermedades inflamatorias crónicas. Por lo tanto, es importante obtener una mayor comprensión de la relación potencial entre la liberación ET de los macrófagos y el desarrollo de enfermedades relacionadas con la inflamación. Estudios recientes han demostrado la presencia de MET y NETs en placas ateroscleróticas humanas intactas y trombos organizados13. Del mismo modo, los MET se han implicado en la conducción de lesiones renales a través de la regulación de las respuestas inflamatorias14. Sin embargo, a diferencia de los neutrófilos, hay datos limitados sobre los mecanismos de formación de MET a partir de macrófagos. Estudios recientes que utilizan modelos in vitro humanos de formación MET muestran algunas diferencias en las vías involucradas en cada tipo de célula (es decir, con respecto a la ausencia de citrulinación histona con macrófagos)6. Sin embargo, algunos han demostrado que la versión NET también puede ocurrir en ausencia de histona citrullination15.
El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método simple y directo para evaluar la liberación de MET en un modelo de macrófagos clínicamente relevante. Hay una serie de diferentes modelos de células de macrófagos in vitro que se han utilizado para estudiar los MET (es decir, la línea celular de monocitos humanos THP-1 y varias líneas celulares de macrófagos murinos)16. Hay algunas limitaciones asociadas con estos modelos. Por ejemplo, la diferenciación de los monocitos THP-1 a los macrófagos generalmente requiere un paso de cebado, como la adición de acetato de mirista phorbol (PMA), que a su vez activa las vías dependientes de la proteína quinasa C (PKC). Este proceso es conocido por desencadenar la liberación de ET4 y da como resultado una liberación basal baja de MET de las células THP-1. Otros estudios han puesto de relieve algunas diferencias en la bioactividad y las respuestas inflamatorias montadas por los macrófagos in vivo en comparación con las células THP-1 tratadas con PMA17.
Del mismo modo, el comportamiento y las respuestas inflamatorias de diferentes líneas celulares similares a macrófagos murinos no representan completamente el espectro de respuesta de los macrófagos humanos primarios18. Por lo tanto, con el fin de investigar la formación de ET de macrófagos en el entorno clínico, se cree que los macrófagos derivados de monocitos humanos primarios (HMM) son un modelo más relevante en lugar de líneas celulares monocíticas o similares a la murina.
La liberación de ET de los HMMAM polarizados M1 se ha demostrado después de la exposición de estas células a una serie de diferentes estímulos inflamatorios, incluyendo el ácido hipocloroso oxidante derivado de mieloperoxidasa (HOCl), PMA, TNF, e IL-86. Aquí se describe un protocolo para polarizar los HMMAM al fenotipo M1 y visualizar la posterior liberación de MET tras la exposición a estos estímulos inflamatorios. PMA se utiliza como un estímulo de la liberación de MET para facilitar las comparaciones con estudios anteriores que han utilizado neutrófilos. Es importante destacar que HOCl, IL-8 y TNF también se utilizan para estimular la liberación de MET, que se cree que son mejores modelos del ambiente inflamatorio in vivo. El método microscópico para la visualización de la liberación de ET consiste en tinchar el ADN extracelular en cultivos de células vivas utilizando SYTOX green, una mancha de ácido nucleico verde fluorescente impermeable que se ha aplicado con éxito en estudios anteriores de neutrófilos. Este método permite una evaluación rápida y cualitativa de la versión ET, pero no es apropiado como método independiente para la cuantificación de la extensión de liberación ET. Se debe utilizar una metodología alternativa si se requiere cuantificación para comparar el alcance de la liberación de ET resultante de diferentes condiciones o intervenciones de tratamiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generación y visualización de la formación met utilizando HMMam diferenciados M1 representa un nuevo modelo in vitro que puede ser útil para investigar el papel patológico potencial de estas estructuras de macrófagos, particularmente bajo inflamatoriocrónico Condiciones. Proporciona un protocolo robusto para la estimulación de macrófagos humanos primarios para liberar MET, que también se puede utilizar en estudios relacionados con monocitos humanos o líneas celulares de macrófagos murinos. La implementaci?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una Beca Perpetua IMPACT (IPAP201601422) y la Beca de Proyecto Biomédico de la Fundación Novo Nordisk (NNF17OC0028990). YZ también reconoce la recepción de un Premio de Posgrado Australiano de la Universidad de Sídney. Nos gustaría dar las gracias al Sr. Pat Pisansarakit y a la Sra. Morgan Jones por la asistencia en el aislamiento de monocitos y el cultivo de tejidos.
Materials
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
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