In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen
Summary
Hier is een protocol voor het opsporen van macrofaag extracellulaire trap (met) productie in levende celcultuur met behulp van microscopie en fluorescentie kleuring. Dit protocol kan verder worden uitgebreid om specifieke MET eiwit markers te onderzoeken door immunofluorescentie kleuring.
Abstract
De afgifte van extracellulaire vallen (ETs) door neutrofielen is geïdentificeerd als een factor die bijdraagt aan de ontwikkeling van ziekten die verband houden met chronische ontstekingen. Neutrofiele ETS (netten) bestaan uit een Maas van DNA, Histon-eiwitten en diverse korrel proteïnen (d.w.z. myeloperoxidase, elastase en door G). Andere immuuncellen, waaronder macrofagen, kunnen ook ETs produceren; in hoeverre dit in vivo gebeurt en of macrofaag extracellulaire vallen (METs) een rol spelen bij pathologische mechanismen, is niet in detail onderzocht. Om de rol van METs in inflammatoire pathologieën beter te begrijpen, werd een protocol ontwikkeld voor het visualiseren van de introductie van primaire menselijke macrofagen in vitro, die ook kunnen worden misbruikt bij immunofluorescentie experimenten. Dit maakt verdere karakterisering van deze structuren en hun vergelijking met ETs vrijgegeven uit neutrofielen. Humane monocyte-afgeleide macrofagen (HMDM) produceren METs bij blootstelling aan verschillende ontstekings stimuli na differentiatie aan het M1 pro-inflammatoire fenotype. De vrijgave van de METs kan worden gevisualiseerd door microscopie met behulp van een groen fluorescerende nucleïnezuur vlek die ongevoelig is voor levende cellen (bijv. SYTOX groen). Het gebruik van vers geïsoleerde primaire macrofagen, zoals HMDM, is voordelig bij het modelleren in vivo ontstekings gebeurtenissen die relevant zijn voor potentiële klinische toepassingen. Dit protocol kan ook worden gebruikt om te studeren met vrijlating van humane monocyt cellijnen (bv, thp-1) na differentiatie in macrofagen met forbol myristaat acetaat of andere macrofaag cellijnen (bijv. de Murine macrofaag-achtige J774A. 1 cellen).
Introduction
De afgifte van ETs uit neutrofielen werd voor het eerst geïdentificeerd als een aangeboren immuunrespons veroorzaakt door bacteriële infectie1. Ze bestaan uit een DNA-ruggengraat waaraan verschillende korrel eiwitten met antibacteriële eigenschappen gebonden zijn, waaronder neutrofiele elastase en myeloperoxidase2. De primaire rol van neutrofiele ETs (netten) is het opvangen van pathogenen en het vergemakkelijken van hun eliminatie3. Echter, naast de beschermende rol van ETs in immuun verdediging, een toenemend aantal studies hebben ook een rol in de ziekte-pathogenese ontdekt, vooral tijdens de ontwikkeling van ontsteking-gedreven ziekten (dat wil zeggen, reumatoïde artritis en atherosclerose4). De afgifte van ETS kan worden geactiveerd door verschillende pro-inflammatoire cytokines, met inbegrip van Interleukine 8 (Il-8) en tumor necrose factor alpha (tnfα)5,6, en de gelokaliseerde accumulatie van ETS kan weefselschade te verhogen en roepen een pro-inflammatoire respons7. Bijvoorbeeld, ETs zijn betrokken als het spelen van een causale rol in de ontwikkeling van atherosclerose8, bevordering van trombose9, en het voorspellen van cardiovasculaire risico10.
Het wordt nu erkend dat naast neutrofielen ook andere immuuncellen (d.w.z. mestcellen, eosinofielen en macrofagen) ETS kunnen vrijgeven voor blootstelling aan de microbiële of pro-inflammatoire stimulatie11,12. Dit kan bijzonder belangrijk zijn in het geval van macrofagen, gezien hun cruciale rol in de ontwikkeling, regulering en oplossing van chronische ontstekingsziekten. Daarom is het belangrijk om een beter begrip te krijgen van de potentiële relatie tussen ET-vrijlating van macrofagen en ontsteking-gerelateerde ziekte ontwikkeling. Recente studies hebben aangetoond dat de aanwezigheid van Mets en netten in intact menselijke atherosclerotische plaques en georganiseerde trombi13. Evenzo zijn METs betrokken bij het besturen van nierschade door de regulering van ontstekingsreacties14. Echter, in tegenstelling tot neutrofielen, er zijn beperkte gegevens over de mechanismen van MET vorming van macrofagen. Recente studies met behulp van humane in vitro modellen van MET formatie vertonen enkele verschillen in de trajecten die betrokken zijn bij elk celtype (d.w.z. met betrekking tot de afwezigheid van Histon-Citrullinatie met macrofagen)6. Echter, sommige hebben aangetoond dat netto vrijlating kan ook optreden in de afwezigheid van Histon-Citrullinatie15.
Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige en directe methode te bieden om MET vrijgave te beoordelen in een klinisch relevant macrofaag model. Er zijn een aantal verschillende in vitro macrofaag celmodellen die zijn gebruikt om Mets te bestuderen (d.w.z. de thp-1 humane monocyt cellijn en verschillende muriene macrofaag cellijnen)16. Er zijn enkele beperkingen in verband met deze modellen. Bijvoorbeeld, de differentiatie van thp-1 monocyten aan macrofagen meestal vereist een priming stap, zoals de toevoeging van forbol myristaat acetaat (PMA), die zelf activeert proteïne kinase C (PKC)-afhankelijke trajecten. Dit proces is bekend om te activeren ET release4 en resulteert in een lage basale met release van thp-1 cellen. Andere studies hebben gewezen op enkele verschillen in bioactiviteit en ontstekingsreacties die in vivo door macrofagen zijn aangebracht in vergelijking met PMA-behandelde THP-1-cellen17.
Evenzo, het gedrag en inflammatoire reacties van verschillende muriene macrophage-achtige cellijnen niet volledig vertegenwoordigen de respons spectrum van primaire menselijke macrofagen18. Daarom worden met het oog op het onderzoeken van macrofaag et-vorming in de klinische setting, primaire humane monocyte-afgeleide macrofagen (hmdm’s) verondersteld een relevanter model te zijn in plaats van monocytische of muriene macrofaag-achtige cellijnen.
ET vrijlating van M1 gepolariseerde HMDMs is aangetoond na blootstelling van deze cellen aan een aantal verschillende ontstekings stimuli, waaronder het myeloperoxidase-afgeleide oxidant hypochloreuze zuur (HOCl), PMA, TNFα en IL-86. Hier beschreven is een protocol voor het polariseren van HMDMs op de M1 fenotype en visualiseer de daaropvolgende ONTMOETTE release bij blootstelling aan deze ontstekings stimuli. PMA wordt gebruikt als een stimulans van de release om vergelijkingen te maken met eerdere onderzoeken die neutrofielen hebben gebruikt. Belangrijker, HOCl, IL-8, en TNFα worden ook gebruikt om te stimuleren MET release, die worden verondersteld te zijn betere modellen van de ontstekings omgeving in vivo. De microscopische methode voor visualisatie van ET-release impliceert het extracellulair DNA in levende celculturen met behulp van SYTOX Green, een ondoorlatende fluorescerende groene nucleïnezuur vlek die met succes is toegepast in eerdere neutrofiele onderzoeken. Deze methode maakt een snelle en kwalitatieve beoordeling van de ET-release mogelijk, maar is niet geschikt als een stand-alone methode voor de kwantificering van ET-vrijgave omvang. Er moet een alternatieve methode worden gebruikt als kwantificering nodig is om de mate van ET-afgifte te vergelijken die voortvloeit uit verschillende behandelings condities of interventies.
Protocol
Representative Results
Discussion
De generatie en visualisatie van met vorming met M1 gedifferentieerde Hmdm’s vertegenwoordigt een nieuw in vitro model dat nuttig kan zijn voor het onderzoeken van de potentiële pathologische rol van deze macrofaag structuren, met name onder chronische inflammatoire Voorwaarden. Het biedt een robuust protocol voor het stimuleren van primaire menselijke macrofagen om METs vrij te geven, die ook kunnen worden gebruikt in gerelateerde studies met humane monocyt of muriene macrofaag cellijnen. De succesvolle implementatie v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) en Novo Nordisk Foundation Biomedical project Grant (NNF17OC0028990). YZ erkent ook de ontvangst van een Australische postdoctorale onderscheiding aan de Universiteit van Sydney. We willen de heer Pat en mevrouw Morgan Jones bedanken voor de hulp bij de monocyt-isolatie en weefselkweek.
Materials
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation – new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
