In vitro-stimulering och visualisering av extracellulär fälla release i differentierade humana Monocyte-derived makrofager
Summary
Presenteras här är ett protokoll för att upptäcka makrofag extracellulära Trap (Met) produktion i levande cellkultur med hjälp av mikroskopi och fluorescens färgning. Detta protokoll kan utökas ytterligare för att undersöka specifika MET-proteinmarkörer genom färgning av immunofluorescensteknik.
Abstract
Frisläppandet av extracellulära fällor (ETs) av neutrofiler har identifierats som en bidragande faktor till utvecklingen av sjukdomar relaterade till kronisk inflammation. Neutrofila eter (NETs) består av ett nät av DNA, histonproteiner, och olika granule proteiner (dvs., myeloperoxidas, elastase, och cathepsin G). Andra immunceller, inklusive makrofager, kan också producera ETs; men i vilken utsträckning detta sker in vivo och om makrofagextracellulära fällor (METs) spelar en roll i patologiska mekanismer har inte undersökts i detalj. För att bättre förstå den roll som METs i inflammatoriska sjukdomar, ett protokoll utvecklades för att visualisera MET release från primära mänskliga makrofager in vitro, som också kan utnyttjas i immunofluorescensexperiment. Detta möjliggör ytterligare karakterisering av dessa strukturer och deras jämförelse med ETs frigörs från neutrofiler. Humana monocyte-härledda makrofager (HMDM) producerar METs vid exponering för olika inflammatoriska stimuli efter differentiering till M1 pro-inflammatorisk fenotyp. Frisättningen av METs kan visualiseras genom mikroskopi med hjälp av en grön fluorescerande nukleinsyrafotsfläck som är okänsliggjort för levande celler (t. ex. SYTOX Green). Användning av nyligen isolerade primära makrofager, såsom HMDM, är fördelaktigt vid modellering in vivo inflammatoriska händelser som är relevanta för potentiella kliniska tillämpningar. Detta protokoll kan också användas för att studera met release från Human monocyt cellinjer (t. ex., THP-1) efter differentiering till makrofager med phorbol myristate acetat eller andra makrofagcellinjer (t. ex., den murina makrofage-liknande J774A. 1 celler).
Introduction
Frisläppandet av ETs från neutrofiler identifierades först som ett medfödda immunsvar utlöst av bakteriell infektion1. De består av en DNA-ryggrad som olika granule proteiner med anti-bakteriella egenskaper är bundna, inklusive neutrofila elastase och myeloperoxidas2. Den primära rollen för neutrofila (NETs) är att fånga patogener och underlätta deras eliminering3. Men förutom den skyddande roll ETs i immunförsvaret, ett ökande antal studier har också upptäckt en roll i sjukdomens patogenes, särskilt under utvecklingen av inflammations drivna sjukdomar (dvs., reumatoid artrit och åderförkalkning4). Frisläppandet av ETS kan utlösas av olika pro-inflammatoriska cytokiner inklusive interleukin 8 (Il-8) och tumörnekrosfaktor alfa (TNFα)5,6, och den lokaliserade ansamling av ETS kan öka vävnadsskada och framkalla en Pro-inflammatoriskt svar7. Till exempel, ETs har varit inblandade som spelar en kausala roll i utvecklingen av åderförkalkning8, främja trombos9, och förutsäga kardiovaskulär risk10.
Det är nu erkänt att förutom neutrofiler, andra immunceller (dvs mastceller, eosinofiler, och makrofager) kan också släppa ETS på exponering för den mikrobiella eller pro-inflammatorisk stimulering11,12. Detta kan vara särskilt betydelsefullt när det gäller makrofager, med tanke på deras centrala roll i utvecklingen, regleringen och lösningen av kroniska inflammatoriska sjukdomar. Därför är det viktigt att få en större förståelse för den potentiella relationen mellan ET release från makrofager och inflammation-relaterade sjukdomsutveckling. Nyligen genomförda studier har visat närvaron av METs och nät i intakt mänskliga aterosklerotiska plack och organiserade Trombi13. På samma sätt har METs varit inblandade i att köra njurskada genom regleringen av inflammatoriska svar14. Men i motsats till neutrofiler, det finns begränsade data om mekanismerna för MET formation från makrofager. Nyligen genomförda studier med humana in vitro-modeller av met formation visar några skillnader i de vägar som ingår i varje celltyp (dvs., om avsaknaden av Histon citrullination med makrofager)6. Emellertid, vissa har visat att netto frisättning kan också förekomma i avsaknad av Histon citrullination15.
Det övergripande målet med detta protokoll är att ge en enkel och direkt metod för att bedöma MET release i en kliniskt relevant makrofagmodell. Det finns ett antal olika in vitro-makrofagceller modeller som har använts för att studera Mets (dvs, den THP-1 Human monocyt cellinjer och olika murin makrofage cellinjer)16. Det finns vissa begränsningar i samband med dessa modeller. Till exempel, differentiering av THP-1 monocyter till makrofager kräver vanligtvis en priming steg, såsom tillsats av phorbol myristate acetat (PMA), som själv aktiverar proteinkinas C (PKC)-beroende vägar. Denna process är känd för att utlösa ET release4 och resulterar i en låg basal met release från THP-1 celler. Andra studier har belyst vissa skillnader i bioaktivitet och inflammatoriska reaktioner monterade av makrofager in vivo jämfört med PMA-behandlade THP-1-celler17.
På samma sätt representerar beteendet och inflammatoriska reaktioner av olika murina makrofage-liknande cellinjer inte helt svaret spektrum av primära mänskliga makrofager18. Därför, i syfte att utreda makrofaget bildas i den kliniska inställningen, primära humana monocyte-härledda makrofager (HMDMs) tros vara en mer relevant modell snarare än monocytiska eller murina makrofage-liknande cellinjer.
ET release från M1 polariserade HMDMs har visats efter exponering av dessa celler till ett antal olika inflammatoriska stimuli, inklusive myeloperoxidas-derived antioxidant hypoklorös syra (HOCl), PMA, TNFα, och IL-86. Beskrivs här är ett protokoll för att polarisera HMDMs till M1 fenotyp och visualisera efterföljande MET release vid exponering för dessa inflammatoriska stimuli. PMA används som en stimulans av MET release för att underlätta jämförelser med tidigare studier som har använt neutrofiler. Viktigt, HOCl, IL-8, och TNFα används också för att stimulera MET release, som tros vara bättre modeller av den inflammatoriska miljön in vivo. Den mikroskopiska metoden för visualisering av ET release innebär färgning av extracellulära DNA i levande cellkulturer med hjälp av SYTOX Green, en ogenomtränglig fluorescerande grön nukleinsyra fläck som har framgångsrikt tillämpats i tidigare neutrofila studier. Denna metod möjliggör snabb och kvalitativ bedömning av ET-frisättning, men det är inte lämpligt som en fristående metod för kvantifiering av ET-frigöringsgrad. Alternativa metoder bör användas om kvantifieringen krävs för att jämföra omfattningen av ET-frisättningen till följd av olika behandlings villkor eller interventioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generering och visualisering av MET formation med hjälp av M1 differentierade HMDMs representerar en ny in vitro-modell som kan vara användbara för att undersöka den potentiella patologiska roll dessa makrofagstrukturer, särskilt under kroniska inflammatoriska Villkor. Det ger ett robust protokoll för stimulering av primära mänskliga makrofager att frigöra METs, som också kan utnyttjas i relaterade studier med Human monocyt eller murin makrofage cellinjer. Det framgångsrika genomförandet av detta protokoll f?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) och Novo Nordisk Foundation Biomedicinskt projekt Grant (NNF17OC0028990). YZ erkänner också mottagandet av en australisk doktorand utmärkelse från University of Sydney. Vi skulle vilja tacka Mr Pat pisansarakit och MS Morgan Jones för hjälp med monocyt isolering och vävnad kultur.
Materials
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation – new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
