Summary

Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

Published: November 01, 2019
doi:

Summary

Presentato qui è un protocollo per rilevare la produzione di trap extracellulari macrofalo (MET) nella coltura di cellule vive utilizzando microscopia e colorazione a fluorescenza. Questo protocollo può essere ulteriormente esteso per esaminare specifici marcatori proteici MET mediante colorazione immunofluorescenza.

Abstract

Il rilascio di trappole extracellulari (ET) da parte dei neutrofili è stato identificato come un fattore che contribuisce allo sviluppo di malattie legate all’infiammazione cronica. Neutrophil ETs (NETs) sono costituiti da una rete di DNA, proteine istone, e varie proteine granulo (cioè, mieloperossiasi, elastasi, e cathepsin G). Altre cellule immunitarie, compresi i macrofagi, possono anche produrre ET; tuttavia, fino a che punto ciò si verifica in vivo e se le trappole extracellulari dei macrofazini (MET) svolgono un ruolo nei meccanismi patologici non è stato esaminato in dettaglio. Per comprendere meglio il ruolo delle MET nelle patologie infiammatorie, è stato sviluppato un protocollo per visualizzare il rilascio di MET dai macrofagi umani primari in vitro, che può essere sfruttato anche negli esperimenti di immunofluorescenza. Ciò consente un’ulteriore caratterizzazione di queste strutture e il loro confronto con gli ET rilasciati dai neutrofili. I macrofagi derivati dai monofati umani (HMDM) producono MET dopo l’esposizione a diversi stimoli infiammatori a seguito della differenziazione al fenotipo pro-infiammatorio M1. Il rilascio di MET può essere visualizzato mediante microscopia utilizzando una macchia di acido nucleico fluorescente verde che è impermeantto alle cellule vive (ad esempio, verde SYTOX). L’uso di macrofagi primari appena isolati, come l’HMDM, è vantaggioso nella modellazione di eventi infiammatori in vivo rilevanti per potenziali applicazioni cliniche. Questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare il rilascio di MET da linee cellulari monocitiche umane (ad esempio, THP-1) a seguito di differenziazione in macrofagi con acetato di mirino phorbol o altre linee cellulari di macrofalo (ad esempio, le cellule J774A.1 simili a murini.

Introduction

Il rilascio di ET dai neutrofili è stato identificato per la prima volta come una risposta immunitaria innata innescata da infezione batterica1. Sono costituite da una spina dorsale del DNA a cui sono legate varie proteine del granulo con proprietà antibatteriche, tra cui l’elastasi neutrofilo e la mieloperossia2. Il ruolo principale degli ET neutrofili (NET) è quello di catturare gli agenti patogeni e facilitarne l’eliminazione3. Tuttavia, oltre al ruolo protettivo degli ET nella difesa immunitaria, un numero crescente di studi ha anche scoperto un ruolo nella patogenesi della malattia, in particolare durante lo sviluppo di malattie basate sull’infiammazione (ad es. artrite reumatoide e aterosclerosi4). Il rilascio degli ET può essere innescato da varie citochine pro-infiammatorie, tra cui l’interleuchina 8 (IL-8) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF)5,6, e l’accumulo localizzato di ET può aumentare i danni ai tessuti ed evocare risposta pro-infiammatoria7. Ad esempio, le ET sono state implicate come un ruolo causale nello sviluppo dell’aterosclerosi8,promuovendo la trombosi9e prevedendo il rischio cardiovascolare10.

Ora si riconosce che oltre ai neutrofili, altre cellule immunitarie (ad esempio, mastociti, eosofili e macrofagi) possono anche rilasciare ET in caso di esposizione alla stimolazione microbica o pro-infiammatoria11,12. Questo può essere particolarmente significativo nel caso dei macrofagi, considerando il loro ruolo chiave nello sviluppo, nella regolamentazione e nella risoluzione delle malattie infiammatorie croniche. Pertanto, è importante ottenere una maggiore comprensione della potenziale relazione tra il rilascio di ET dai macrofagi e lo sviluppo di malattie correlate all’infiammazione. Recenti studi hanno dimostrato la presenza di MET e NET in placche aterosclerotiche umane intatte e trombi organizzi13. Allo stesso modo, i MET sono stati implicati nel guidare lesioni renali attraverso la regolazione delle risposte infiammatorie14. Tuttavia, a differenza dei neutrofili, ci sono dati limitati sui meccanismi della formazione MET dai macrofagi. Recenti studi che utilizzano modelli in vitro umano di formazione MET mostrano alcune differenze nei percorsi coinvolti in ogni tipo di cellula (cioè, per quanto riguarda l’assenza di citrigazione istone con macrofagi)6. Tuttavia, alcuni hanno dimostrato che il rilascio di NET può verificarsi anche in assenza di citrullination istone15.

L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un metodo semplice e diretto per valutare il rilascio MET in un modello di macrofago clinicamente rilevante. Ci sono un certo numero di diversi modelli di cellule di macrofago in vitro che sono stati utilizzati per studiare MET (cioè, la linea cellulare monocito umano THP-1 e varie linee cellulari del macrofano murino)16. Esistono alcune limitazioni associate a questi modelli. Ad esempio, la differenziazione dei monociti THP-1 ai macrofagi richiede solitamente una fase di innesco, come l’aggiunta di acetato di forbol miristatico (PMA), che a sua volta attiva percorsi dipendenti dalla chinasi proteica C (PKC). Questo processo è noto per innescare larelease 4 ET e si traduce in un basso rilascio MET basale da cellule THP-1. Altri studi hanno evidenziato alcune differenze nella bioattività e nelle risposte infiammatorie montate dai macrofagi in vivo rispetto alle cellule THP-1 trattate daPMA.

Allo stesso modo, il comportamento e le risposte infiammatorie di diverse linee cellulari simili a macrofagi murini non rappresentano completamente lo spettro di risposta dei macrofagi umani primari18. Pertanto, allo scopo di studiare la formazione di ET macrofaci nell’ambiente clinico, si ritiene che i macrofagi derivati da monofagi (HMDM) primari siano un modello più rilevante piuttosto che linee cellulari monocitiche o murine simili a macrofagi.

Il rilascio di ET dagli HMDM polarizzati M1 è stato dimostrato in seguito all’esposizione di queste cellule a diversi stimoli infiammatori, tra cui l’acido ipocilno ossidante derivato da mieloperossia derivato da minidrica (HOCl), PMA, TNF e IL-86. Descritto qui è un protocollo per polarizzare gli HMDM al fenotipo M1 e visualizzare il successivo rilascio MET dopo l’esposizione a questi stimoli infiammatori. PMA è usato come stimolo del rilascio MET per facilitare il confronto con studi precedenti che hanno usato neutrofili. È importante sottolineare che, HOCl, IL-8, e TNF , sono utilizzati anche per stimolare il rilascio di MET, che si crede di essere modelli migliori dell’ambiente infiammatorio in vivo. Il metodo microscopico per la visualizzazione del rilascio di ET consiste nel macchiare il DNA extracellulare nelle colture di cellule vive utilizzando il verde SYTOX, una macchia di acido nucleico verde fluorescente impermeabile che è stata applicata con successo nei precedenti studi neutrofili. Questo metodo consente una valutazione rapida e qualitativa del rilascio di ET, ma non è appropriato come metodo autonomo per la quantificazione dell’estensione del rilascio ET. La metodologia alternativa deve essere utilizzata se è necessaria la quantificazione per confrontare l’entità del rilascio di ET derivante da diverse condizioni o interventi di trattamento.

Protocol

L’HMDM è stato isolato dai preparati per le mani di bufala umana forniti dalla banca del sangue con l’approvazione etica del distretto sanitario locale di Sydney. 1. Cultura HMDM Isolare i monociti dai preparati del camice buffo preparati dal sangue periferico di donatori umani sani utilizzando una preparazione disponibile in commercio per isolare i linfociti, seguita da eluriazione centrifuga contrastata19, 20. C…

Representative Results

Le immagini di Brightfield che mostrano i cambiamenti morfologici dell’HMDM in risposta agli stimoli per la differenziazione cellulare sono mostrate nella Figura 1. I macrofagi polarizzati M1 da esperimenti con HMDM esposti a IFN e LPS hanno mostrato una forma di cella allungata e simile a un mandrino, come indicato dalle frecce nere nella Figura 1 (pannello centrale). Per fare un confronto, la morfologia dei macrofagi polarizzati M2 dopo l’esposizione dell’HMDM…

Discussion

La generazione e la visualizzazione della formazione MET utilizzando HmDM differenziate M1 rappresenta un nuovo modello in vitro che può essere utile per studiare il potenziale ruolo patologico di queste strutture macrofaghe, in particolare sotto l’infiammatorio cronico Condizioni. Fornisce un protocollo robusto per la stimolazione dei macrofagi umani primari per rilasciare MET, che può anche essere utilizzato in studi correlati con linee cellulari monociti o macrofagi murini. La riuscita implementazione di questo prot…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da un perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) e da Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). L’Australian Postgraduate Award da parte dell’Università di Sydney riconosce anche la ricezione di un Australian Postgraduate Award. Ringraziamo Pat Pisansarakit e la signora Morgan Jones per l’assistenza nell’isolamento dei monociti e nella cultura dei tessuti.

Materials

120Q broad spectrum fluorescent light source EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) Sigma-Aldrich CLS3336 For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) Polysciences Inc. 24606 Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS) Thermo-Fisher 14025050 For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl) Sigma-Aldrich 320331 For MET stimulation
Interferon gamma Thermo-Fisher PMC4031 For M1 priming
Interleukin 4 Integrated Sciences rhil-4 For M2 priming
Interleukin 8 Miltenyl Biotec 130-093-943 For MET stimulation
L-Glutamine Sigma-Aldrich 59202C Added to culture media
Lipopolysaccharide Integrated Sciences tlrl-eblps For M1 priming
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS 1114544 For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D5652 For washing steps
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R8758 For cell culture
SYTOX green Life Technologies S7020 For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source Olympus, Tokyo, Japan x-cite series
Tumor necrosis factor alpha Lonza 300-01A-50 For MET stimulation

References

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Cite This Article
Zhang, Y., Rayner, B. S., Jensen, M., Hawkins, C. L. In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (153), e60541, doi:10.3791/60541 (2019).

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