Summary

分化ヒト単球由来マクロファージにおける細胞外トラップ放出のIn Vitro刺激と可視化

Published: November 01, 2019
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Summary

ここで提示するプロトコルは、顕微鏡法および蛍光染色を用いて生細胞培養におけるマクロファージ細胞外トラップ(MET)産生を検出するプロトコルである。このプロトコルは、免疫蛍光染色によって特異的なMETタンパク質マーカーを調べるためにさらに拡張することができる。

Abstract

好中球による細胞外トラップ(けること)の放出は、慢性炎症に関連する疾患の発症に寄与する要因として同定されている。好中球のNETs(NETs)は、DNA、ヒストンタンパク質、および様々な顆粒タンパク質(すなわち、骨髄ペルオキシダーゼ、エラスターゼ、およびカテプシンG)のメッシュからなる。マクロファージを含む他の免疫細胞も、ETを産生することができる。しかしながら、これは生体内でどの程度起こるのか、そしてマクロファージ細胞外トラップ(MET)が病理学的メカニズムにおいて役割を果たすかどうかは、詳細には調べていない。炎症性病理におけるMETの役割をよりよく理解するために、インビトロで一次ヒトマクロファージからのMET放出を可視化するためのプロトコルが開発され、免疫蛍光実験でも利用できる。これにより、これらの構造のさらなる特性評価と好中球から放出されるEとの比較が可能になります。ヒト単球由来マクロファージ(HMDM)は、M1前炎症表現型への分化に続いて異なる炎症刺激にさらされるとMETを産生する。METの放出は、生細胞(例えば、SYTOXグリーン)に含まれる緑色蛍光核酸染色を用いて顕微鏡検査によって可視化することができる。HMDMのような単に単離された一次マクロファージの使用は、潜在的な臨床応用に関連する生体内炎症性イベントのモデリングに有利である。このプロトコルはまた、ヒト単球細胞株からのMET放出(例えば、THP−1)をホルボル酢酸または他のマクロファージ細胞株(例えば、マウスマクロファージ様J774A.1細胞)とのマクロファージへの分化後に使用することもできる。

Introduction

好中球からの尿毒剤の放出は、まず細菌感染1によって引き起こされる自然免疫応答として同定された。それらは、好中球エラスターゼおよび骨髄oxoxidase2を含む抗菌特性を有する種々の顆粒タンパク質が結合するDNA骨格からなる。好中球のNE(NETs)の主な役割は、病原体を捕捉し、その除去を促進することです 3.しかし、免疫防御におけるETの保護的役割に加えて、特に炎症主導疾患の発症時(すなわち、関節リウマチおよび関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化症 4).Eの放出は、インターロイキン8(IL-8)および腫瘍壊死因子α(TNFα)5、6を含む様々な炎症性サイトカインによって引き起こされ、およびEの局所的な蓄積は、組織損傷を増加させ、誘発することができる炎症性反応7.例えば、ETは、アテローム性動脈硬化症8の発症に因果的役割を果たし、血栓症9を促進し、心血管リスク10を予測することに関与している。

好中球に加えて、他の免疫細胞(すなわち、肥満細胞、好酸球、およびマクロファージ)も微生物または炎症刺激11、12への曝露時にEを放出できることが認識されている。これは、慢性炎症性疾患の発症、調節、および解決における重要な役割を考慮して、マクロファージの場合に特に重要であり得る。したがって、マクロファージからのET放出と炎症関連疾患発症との間の潜在的な関係をより深く理解することが重要である。最近の研究は、無傷のヒトアテローム硬化性プラークおよび組織化された血栓13におけるMETおよびNETの存在を示している。同様に、METは、炎症反応14の調節を介して腎臓損傷を駆動するのに関与している。しかしながら、好中球とは対照的に、マクロファージからのMET形成のメカニズムに関するデータは限られている。MET形成のヒトin vitroモデルを用いた最近の研究は、各細胞型に関与する経路のいくつかの違いを示す(すなわち、マクロファージによるヒストンシトルリン化の欠如に関して)6.しかし、一部の人々は、ヒストンシトルリン化15がない場合にもNETリリースが発生する可能性があることを示しています。

このプロトコルの全体的な目標は、臨床的に関連するマクロファージモデルでMET放出を評価するための簡単で直接的な方法を提供することです。MET(すなわち、THP-1ヒト単球細胞株および各種マウスマクロファージ細胞株)16を研究するために使用されている多数の異なるin vitroマクロファージ細胞モデルがある。これらのモデルに関連するいくつかの制限があります。例えば、マクロファージに対するTHP-1単球の分化には、通常、プロテインキナーゼC(PKC)依存性経路を活性化するフォルボル菌性酢酸(PMA)の添加などのプライミングステップが必要です。このプロセスは、ETリリース4をトリガすることが知られており、THP-1細胞からの低基底MET放出をもたらす。他の研究は、PMA処理THP-1細胞17と比較して、生体内のマクロファージによって取り付けられた生理活性および炎症応答のいくつかの違いを強調している。

同様に、異なるマウスマクロファージ様細胞株の挙動および炎症応答は、一次ヒトマクロファージ18の応答スペクトルを完全に表すものではない。従って、臨床現場におけるマクロファージET形成を調べる目的で、原発ヒト単球由来マクロファージ(HMDM)は、単球性またはマウスマクロファージ様細胞株よりもむしろより関連性の高いモデルであると考えられている。

M1偏光HMDMからのET放出は、ミエロペルオキシダーゼ由来酸化性次亜塩素酸(HOCl)、PMA、TNFα、およびIL-86を含む多数の異なる炎症刺激にこれらの細胞の曝露後に実証されている。ここで説明するプロトコルは、M1表現型にHMDMを偏光させ、これらの炎症刺激への曝露時にその後のMET放出を可視化するプロトコルである。PMAは、好中球を使用した以前の研究との比較を容易にするためにMETリリースの刺激として使用されます。重要なことに、HOCl、IL-8、およびTNFαはまた、生体内の炎症環境のより良いモデルであると考えられているMET放出を刺激するために使用される。ET放出の可視化のための顕微鏡的方法は、SYTOXグリーンを使用して生細胞培養中の細胞外DNAを染色することを含む、 SYTOXグリーン、以前の好中球研究で正常に適用された不浸透性蛍光緑色核酸染色。この方法は、ETリリースの迅速かつ定性的な評価を可能にしますが、ETリリース範囲を定量化するためのスタンドアロンの方法としては適切ではありません。異なる治療条件または介入から生じるET放出の程度を比較するために定量化が必要な場合は、代替方法論を使用する必要があります。

Protocol

HMDMは、シドニー地方保健地区からの倫理の承認を得て血液銀行から供給されたヒトバフィーコート製剤から分離された。 1. HMDMカルチャー リンパ球を単離する市販の調製物を用いて健康なヒトドナーの末梢血から調製したバフィーコート製剤から単球を単離し、続いて逆電流遠心溶血19、 20. 単球特性評価用の修…

Representative Results

細胞分化の刺激に対するHMDMの形態変化を示す明視野画像を図1に示す。IFNγおよびLPSに曝露されたHMDMを用いた実験からのM1偏光マクロファージは、図1(中央パネル)の黒い矢印で示されるように細長く紡錘状の細胞形状を示した。比較のために、48時間のIL-4にHMDMを曝露した後のM2偏光マクロファージの形態は、図1(右端パネル)の…

Discussion

M1分化HmDMを用いたMET形成の生成と可視化は、特に慢性炎症下でこれらのマクロファージ構造の潜在的な病理学的役割を調べるのに有用である可能性のある新しいin vitroモデルを表す条件。これは、ヒト単球またはマウスマクロファージ細胞株との関連研究にも利用することができるMETを放出する原発ヒトマクロファージの刺激のための堅牢なプロトコルを提供する。HMDMによるMET形成の刺激の?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、永久的なインパクト・グラント(IPAP201601422)とノボ・ノルディスク財団バイオメディカル・プロジェクト・グラント(NNF17OC0028990)によって支援されました。YZはまた、シドニー大学からオーストラリアの大学院賞を受賞したことも認めています。パット・ピサンサラキット氏とモーガン・ジョーンズ氏の単球分離と組織培養に関する支援に感謝します。

Materials

120Q broad spectrum fluorescent light source EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) Sigma-Aldrich CLS3336 For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) Polysciences Inc. 24606 Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS) Thermo-Fisher 14025050 For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl) Sigma-Aldrich 320331 For MET stimulation
Interferon gamma Thermo-Fisher PMC4031 For M1 priming
Interleukin 4 Integrated Sciences rhil-4 For M2 priming
Interleukin 8 Miltenyl Biotec 130-093-943 For MET stimulation
L-Glutamine Sigma-Aldrich 59202C Added to culture media
Lipopolysaccharide Integrated Sciences tlrl-eblps For M1 priming
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS 1114544 For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D5652 For washing steps
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R8758 For cell culture
SYTOX green Life Technologies S7020 For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source Olympus, Tokyo, Japan x-cite series
Tumor necrosis factor alpha Lonza 300-01A-50 For MET stimulation

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
  3. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  5. Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
  6. Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
  7. Gunzer, M. Traps and hyperinflammation – new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
  8. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
  9. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
  10. Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
  11. Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
  12. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  13. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
  14. Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
  15. Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
  16. Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
  17. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
  18. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  19. Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
  20. Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
  21. Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
  22. Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
  23. Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).

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Zhang, Y., Rayner, B. S., Jensen, M., Hawkins, C. L. In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (153), e60541, doi:10.3791/60541 (2019).

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