Summary
يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الظهاريه من المناطق التشريحية المختلفة من الغشاء السلوى البشري لتحديد تغايرها وخصائصها الوظيفية للتطبيق المحتمل في النماذج السريرية والفسيولوجية.
Abstract
وقد تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات في الأدبيات لعزله وثقافة الخلايا الظهاريه الإنسان السلوى (HAEC). ومع ذلك ، فان هذه تفترض ان ظهاره السلوى طبقه متجانسة. يمكن تقسيم الإنسان إلى ثلاث مناطق تشريحيه: منعكسة ، والمشيمة ، والسرة. كل منطقه لها ادوار فسيولوجية مختلفه ، كما هو الحال في الحالات المرضية. هنا ، ونحن وصف بروتوكول لتشريح الانسجه الإنسان امايون في ثلاثه أقسام والحفاظ عليه في المختبر. وفي الثقافة ، تظهر الخلايا المشتقة من الامايون المنعكس شكلا كوبويدالا ، في حين ان الخلايا الماخوذه من منطقتي المشيمة والسرة كانت حرشفية. ومع ذلك ، فان جميع الخلايا التي تم الحصول عليها لديها النمط الظاهري الظهاريه ، التي أظهرتها المناعة من البريد الكتروني. التالي ، لان المناطق المشيمة والمنعكسة في الموقع تختلف في المكونات الخلوية والوظائف الجزيئية ، قد يكون من الضروري للدراسات في المختبر للنظر في هذه الاختلافات ، لأنها يمكن ان يكون لها اثار فسيولوجية لاستخدام HAEC في البحوث الطبية الحيوية والتطبيق الواعد لهذه الخلايا في الطب التجديدي.
Introduction
خلايا ظهاره الإنسان السلوى (HAEC) تنشا خلال المراحل المبكرة من النمو الجنيني ، في حوالي ثمانيه أيام بعد الإخصاب. انها تنشا من السكان من الخلايا الظهاريه الحرشفية من العدسة التي تستمد من الطبقة الأعمق من الغشاء السلوى1. وهكذا ، تعتبر HAEC بقايا الخلايا المستحثة من العدسة التي لديها القدرة علي التفريق في الطبقات الجرثومية الثلاث من الجنين2. في العقد الماضي ، قامت مجموعات بحثيه متنوعة بتطوير طرق لعزل هذه الخلايا عن الغشاء السلوى في فتره الحمل لتوصيف خصائصها الافتراضية ذات الصلة بالتعدد في نموذج الثقافة في المختبر3،4.
وبناء علي ذلك ، وجد ان HAEC سمات مميزه للخلايا الجذعية لمستحث البشرية (HPSC) ، مثل المستضدات السطحية SSEA-3 و SSEA-4 و TRA 1-60 و TRA 1-81 ؛ جوهر عوامل النسخ تعدد OCT4, SOX2, و NANOG; ومؤشر الانتشار KI67 ، مما يوحي بأنها ذاتية التجديد5،6،7. وعلاوة علي ذلك ، تم تحدي هذه الخلايا باستخدام بروتوكولات التمايز للحصول علي خلايا ايجابيه لعلامات النسب المحددة من الطبقات الجرثومية الثلاثة (اكوديرم ، الأديم المتوسط ، والأديم الباطن)4،5،8، وكذلك في النماذج الحيوانية من الامراض البشرية. أخيرا, [هتيك] مستعجله [ا-كهنرين], اي يبرهن ان هم يحتبسون [ظهاري] طبيعة كثير مثل ال [هبس]5,9.
بعيدا عن أصلهم الجنيني ، زرع13.
ومع ذلك ، فقد افترضت التقارير السابقة ان الإنسان البشري هو غشاء متجانس ، دون النظر إلى انه يمكن ان ينقسم تشريحيا وفيزيولوجيا إلى ثلاث مناطق: المشيمة (الذي يغطي السرة ساقط) ، السري (الجزء الذي يغلف الحبل السري) ، وينعكس (بقية الغشاء غير مرتبط بالمشيمة)14. وقد تبين ان المشيمة والمناطق المنعكسة من الخلافات عرض الاختلافات في المورفولوجية, نشاط الميتوكوندريا, الكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلي15, التعبير ميرنا16, وتفعيل إشارات مسارات17. وتشير هذه النتائج إلى ان الإنسان البشري مندمج من قبل مجموعه غير متجانسة من السكان ذات الوظائف المختلفة التي ينبغي النظر فيها لاجراء المزيد من الدراسات في النماذج في الموقع أو في المختبر. في حين ان المختبرات الأخرى قد صممت بروتوكولات لعزل HAEC من الغشاء كله ، فقد إنشا مختبرنا بروتوكولا لعزل وثقافة وتوصيف الخلايا من مختلف المناطق التشريحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة علي هذا البروتوكول من قبل اللجنة الاخلاقيه للمعهد الوطني لperinatología في مكسيكو سيتي (السجل رقم 212250-21041). وكانت جميع الإجراءات التي أجريت في هذه الدراسات متفقه مع المعايير الاخلاقيه للمعهد الوطني لperinatología ، وإعلان هلسنكي ، والمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في المعيار المكسيكي الرسمي لوزارة الصحة.
1-الاعداد
- اعداد حل ل 1x تلفزيوني مع أدتا. للقيام بذلك ، أضافه 500 μL من 0.5 M الأسهم أدتا إلى 500 mL من 1x تلفزيوني للتركيز النهائي من 0.5 mM أدتا.
- اعداد الثقافة المتوسطة ل HAEC. خذ 450 مل من ارتفاع الجلوكوز-dmem, تكمله مع 5 مل من بيروفات الصوديوم (100 mM), 50 ml من الدم البقري الجنين غير النشطة المؤهلين للخلايا الجذعية, 5 مل من الأحماض الامينيه غير الاساسيه (100x), 5 مل من المضادات الحيوية انتيكو200 تيك 500 μL من mercaptoethanol (1 ، 000x).
- تعقيم الحاويات لنقل ومعالجه الانسجه: وعاء من الفولاذ المقاوم للصدا مع غطاء لنقل المشيمة بأكملها من مسرح التشغيل إلى المختبر ، وصينية (20 سم × 30 سم × 8 سم) لغسل وأزاله الدم من المشيمة كلها قبل تشريح الغشاء السلوى ، ومجلس تقطيع البلاستيك لفصل الغشاء السلوى في المناطق الثلاث.
- تعقيم الاداات الجراحية (القشرية ، مقص ، ملقط ، والمشابك) ، 500 مل الأكواب ، القطن gauzes ، ومحلول ملحي.
2. الحصول علي انسجه المشيمة
ملاحظه: تم الحصول علي الاغشيه السلوى من النساء في الحمل علي المدى الكامل (37 − 40 أسبوعا) ، تحت اشاره الولادة القيصرية ، دون اي دليل علي العمل النشط ، وليس الخصائص الميكروبيولوجية للعدوى. ونفذت إجراءات العزل والثقافة الكاملة في اطار مجلس للأمن البيولوجي في ظل ظروف عقيمه.
- في غرفه العمليات ، المشبك الحبل السري لمنع تدفق الدم إلى بقية الانسجه. جمع المشيمة بأكملها مع الحبل السري فرضت في حاويه معقمه.
- أضف 500 مل من محلول ملحي إلى الحاوية لترطيب المشيمة.
- إغلاق الحاوية ونقل الانسجه إلى المختبر في درجه حرارة الغرفة.
- وضع الحاوية مع المشيمة داخل مجلس الوزراء البيولوجي.
ملاحظه: في حاله عدم اجراء تشريح في غضون 15 دقيقه من جمع المشيمة ، وتخزين الحاوية مع المشيمة علي الجليد حتى المعالجة. تجنب أكثر من 1 ساعة من الوقت المنقضي بين الحصول علي المشيمة وبداية التشريح.
3. الفصل الميكانيكي لكل منطقه من الغشاء السلوى
ملاحظه: يجب ان يتم الاجراء داخل مجلس الوزراء البيولوجي في ظل ظروف معقمه وفي درجه حرارة الغرفة.
- قم بازاله المشيمة بأكملها من الحاوية ووضعها علي الصينية مع الحبل السري الذي يواجه الأعلى.
- باستخدام شاش قطني معقم ، نظف الجلطات الدموية من سطح الغشاء الذي يغطي المشيمة.
- تحديد المناطق الثلاث من الغشاء: السرة السرية التي تغلف الحبل السري ، والمشيمة التي تغطي البسملة الحمراء ، والمنطقة المنعكسة ، والتي هي بقية الامايون التي لا تعلق علي المشيمة (الشكل 1).
- تشريح منطقه السرة السرية (الشكل 2 ا).
- باستخدام ملقط تشريح ، عقد جزء من الغشاء امايون الذي يغطي تقاطع المشيمة والحبل السري.
- مع مشرط ، تشريح المنطقة التي تحيط الحبل بينما تمتد لفصلها عن chorion.
- إيداع الانسجه المفصولة في الكاس المسمي مع 100 مل من محلول ملحي.
- تشريح منطقه اميون المشيمة (الشكل 2 ب).
- باستخدام شاش قطني معقم ، قم بازاله الجلطات الدموية من سطح المشيمة التي تغطيها.
- عقد الغشاء علي الحدود بين المشيمة والمنطقة المنعكسة مع تشريح ملقط.
- قطع علي طول محيط المشيمة مع مشرط.
- افصلي المشيمة عن المشيمة ، كوني حريصه علي عدم قطع اي من الاوعيه الدموية.
- وضع الانسجه المفصولة في كاس آخر المسمي مع 300 مل من محلول ملحي.
- افصل بقية الغشاء السلوى الذي لا يعلق علي المشيمة (اي الجزء المنعكس) من المشيميه (الشكل 2 ج).
- جمع المنطقة المنعكسة في كاس آخر المسمي مع 300 mL من محلول ملحي.
ملاحظه: أضافه محلول ملحي باستمرار خلال تشريح لمنع الانسجه من الجفاف.
- جمع المنطقة المنعكسة في كاس آخر المسمي مع 300 mL من محلول ملحي.
4. غسل الاغشيه
ملاحظه: يجب تنفيذ الاجراء داخل مجلس الوزراء البيولوجي تحت ظروف معقمه في درجه حرارة الغرفة.
- تخلص من المحلول الملحي لكل منطقه غشاء بشكل منفصل.
- أضف 100 مل من محلول ملحي طازج إلى منطقه السرة.
- أضف 300 مل من محلول ملحي طازج إلى المناطق المشيمة والمنعكسة علي التوالي.
- يحرك الاغشيه بمساعده تشريح الملقط لأزاله بقايا الدم.
- تجاهل المحلول الملحي.
- كرر غسل والانفعالات علي الأقل 3x حتى الاغشيه هي شفافة.
- وضع وتوسيع الاغشيه علي اللوحة لتنظيف مع الشاش العقيمة جلطات الدم التي لم يتم ازالتها مع يغسل.
ملاحظه: من المهم جدا لأزاله العديد من الكريات الحمراء قدر الإمكان ، ووجودها يؤثر علي وظيفة التريبسين وصلاحيه الثقافات الخلية اللاحقة.
5. الهضم الانزيمي لاغشيه من مناطق مختلفه
ملاحظه: يجب تنفيذ الاجراء داخل مجلس الوزراء البيولوجي في ظل ظروف معقمه.
- قطع المناطق المنعكسة والمشيمة إلى جزئين أو ثلاثه أجزاء.
- لا تقطع المنطقة السرية.
- ضع شظايا كل منطقه في أنابيب الطرد المركزي. أضافه 20 مل من 0.5 ٪ التريبسين/أدتا إلى المناطق المنعكسة والمشيمة و 5 مل من 0.5 ٪ التريبسين/أدتا إلى منطقه السرة ، علي التوالي.
ملاحظه: من المهم قطع المناطق المنعكسة والمشيمة إلى قطع أصغر لأنها تحتاج إلى ان تكون مغمورة تماما في حل التريبسين. - هز أنابيب الطرد المركزي بخفه لمده 30 ثانيه. تجاهل التريبسين.
- أضافه 30 مل من جديد 0.5 ٪ تريبسين/أدتا إلى المناطق المنعكسة والمشيمة و 15 مل من جديد 0.5 ٪ تريبسين/أدتا إلى منطقه السرة ، علي التوالي.
- وضع الأنابيب في المدورة داخل الحاضنة.
- احتضان مع دوران (20 دوره في الدقيقة) لمده 40 دقيقه في 37 درجه مئوية.
ملاحظه: إذا كان المدورة أنبوب غير متوفر ، يهز الأنابيب يدويا كل 10 دقيقه. - نقل الحلول التريبسين/الخلية من كل منطقه إلى أنابيب الطرد المركزي الجديدة.
- أضافه 2x حجم الوسائط HAEC مسبقا في 37 درجه مئوية لكل أنبوب لتنشيط الانزيم.
- تخزين أول الهضم علي الجليد.
- كرر الخطوات 5.6 − 5.8 لفتره هضم ثانيه.
- بالنسبة لكل منطقه ، امسك طرفا واحدا من جزء امايون باستخدام ملقط تشريح ، ومع ضغط زوج آخر علي طول الانسجه لأزاله صفوف من الخلايا الظهاريه التي لم تقشر تماما اثناء فترات الحضانة السابقة.
- جمع الهضم الثاني في مجموعه أخرى من أنابيب الطرد المركزي وإلغاء تنشيط مع 2x حجم وسائل الاعلام haec.
- تخلص من الاغشيه المهضومة في وعاء الخطر البيولوجي.
6-عزل الجماعة الاوروبيه
ملاحظه: يجب تنفيذ الاجراء داخل مجلس الوزراء البيولوجي في ظل ظروف معقمه.
- الطرد المركزي جميع أنابيب في 200 x g لمده 10 دقيقه في 4 ° c.
- تجاهل ماده طافي وأضافه 10 مل من وسائل الاعلام haec مسبقه التسخين (إلى 37 درجه مئوية) لكل أنبوب و ماصه pipet-x بلطف لتصنيف كل بيليه.
- الجمع بين المعلقات الخلوية لهضمين في أنبوب الفردية لكل منطقه الغشاء.
- تصفيه المعلقات الخلوية باستخدام 100 ميكرومتر خليه مصافي لأزاله الحطام مصفوفة خارج الخلية والحصول علي خلايا واحده.
- اعداد ثلاثه قسامات مع 90 μl من التريكان الأزرق في أنبوب الطرد المركزي.
- أضافه 10 μL من كل تعليق الخلية لكل منطقه الغشاء في أنابيب الطرد المركزي ومزيج.
- عد الخلايا مع مقياس اللزوجة تحت مجهر حقل الضوء.
7. ثقافة HAEC
- بذور HAEC من المناطق الثلاث علي حده في كثافة من 3 × 104 خلايا/سم2 مع وسائل الاعلام haec مسبقه التسخين ، تستكمل مع 10 نانوغرام/مل من عامل نمو البشرة البشرية (egf).
- بذور الخلايا في لوحات 100 مم للحفاظ عليها في المختبر أو في 24 لوحات جيدا للتحليل المناعي.
- احتضان الاطباق في 37 درجه مئوية تحت ظروف نورموكسيك (5 ٪ CO2) في حاضنه ترطيب.
- أضافه EGF يوميا وتغيير المتوسطة كل يوم ثالث.
ملاحظه: ستصبح الخلايا متموج بعد 4 − 6 أيام. - استخدام الخلايا لمناعي التقليدية ، تحليل الفرز الخلية ، بالتبريد ، الجيش النيبالي الريبي واستخراج البروتين ، أو لمواصله المرور.
8. مرور HAEC
- أزاله المتوسطة HAEC وغسل 2x مع الحل التلفزيوني/أدتا 0.01 M.
- احتضان مع الحل التلفزيوني/أدتا 0.01 M لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية.
- أزاله تلفزيوني/أدتا وأضافه 1.5 mL من 0.5 ٪ التريبسين/أدتا.
- احتضان لمده 5 − 8 دقيقه في 37 درجه مئوية.
- Inactivate الانزيم مع اثنين من مجلدات من وسائل الاعلام HAEC.
- جمع الحل المختلط والطرد المركزي لمده 5 دقائق في 200 x g.
- عد الخلايا وتابع مع الممرات التالية أو استخدام الخلايا لمزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم عزل HAEC من كل من المناطق التشريحية الثلاثة من الغشاء السلوى ومثقف بشكل فردي في المختبر. بعد 48 h من الثقافة ، والخلايا مع النمط الظاهري الظهاريه التمسك سطح لوحه ، علي الرغم من ان وسائل الاعلام أيضا تحتوي علي الحطام الخلوي والخلايا العائمة ، والتي أزيلت بمجرد تغيير المتوسطة (الشكل 3).
خلال معالجه الثقافة الاوليه (المرور صفر ، P0) ، يمكن ان تنشا بعض المضاعفات التي يمكن ان تتداخل مع تحليل البيانات التجريبية (الشكل 4): فمن المستحسن للتخلص من الثقافات ومعالجه غشاء آخر عند تحديد وجود البكتيريا بسبب تلوث الكواشف أو اثناء عمليه العزل (الشكل 4a) ؛ الكريات الحمراء المفرطة بسبب عدم كفاية غسل الاغشيه (الشكل 4B) ؛ نقص أو عدم التصاق الخلايا إلى لوحات (الشكل 4C) ؛ أو الخلايا مع المورفولوجية الليفية (الشكل 4D) ، مما يوحي بان الخلايا البشرية السلوى الإنسان (hamc) كانت معزولة بدلا من haec.
وتعتمد المورفولوجية علي منشا هذه الخلايا: فالخلايا من المنطقة المنعكسة لها شكل كوبويدال وتنمو في طبقه أحاديه مرصوفة بالحصى ، علي عكس الخلايا الموجودة في منطقتي المشيمة والسرة ، والتي هي تملق وحرشفية (الشكل 5). تدعم هذه البيانات ان الطبقة الظهاريه من امايون ليست موحده في جميع انحاء الغشاء. خلال الممرات ، يزيد حجم الخلايا من جميع المناطق ، ولكنها تحافظ علي طبيعتها الظهاريه ولا تكتسب المورفولوجية الليفية. وفي الواقع ، أظهرت المناعة ضد الانزيمات الكترونيه ان الثقافات الاوليه (P0) والثقافات الفرعية (P1-P2) حافظت علي النمط الظاهري الظهاريه (الشكل 6) ، مما يوحي بأنه لا يوجد اي تلوث من نوع آخر من الخلايا ، مثل الخلايا اللحمية المتوسطة ، أو الانتقال الظهاريه-الخلوي الاضافه إلى ذلك ، فان هذه الخلايا لا تظهر اي دليل علي وفاه الخلية وفقا لمقايسة TUNEL (الشكل التكميلي 1) ولكنها ايجابيه لعلامة الانتشار كي-67 (الشكل 6) ، علي الرغم من ان نتائجنا السابقة لم تجد اختلافات كبيره لهذا المؤشر بين كل مرور5.
يختلف عدد الخلايا التي تم الحصول عليها وفقا للمنطقة: 61.6 x 106 و 71.8 x 106 خلايا من المناطق المنعكسة والمشيمة ، علي التوالي ، واقل من 1 x 106 لكل عينه من منطقه السرة (الجدول 1). وقد أفيد مع هذا البروتوكول ان منطقه المشيمة والسرة متشابهة جدا في ملامح التعبير ، بدلا من المناطق المنعكسة والمشيمة ، وخاصه في الجينات التي تشارك في التفاعل مستقبلات ECM ، والتصاق البؤري ، والمسار PI3K-Akt إشارات من خلال الحمض الريبي النيبالي-seq6. الاتفاق ، ذكرت دراسة سابقه التعبير التفاضلي للبروتين كيناز المنشط ميتوجين وتحويل مسارات النمو بيتا عامل ، فضلا عن السايتوكينات التهابيه بين المنطقتين17.
علي الرغم من ان الادله أظهرت ان السكان الفرعيين من امايون تختلف في المورفولوجية والخصائص الفسيولوجية ، ونحن أظهرت سابقا ان التعبير ووجود جوهر العوامل تعدد لا يتغير في HAEC المستمدة من المشيمة والمناطق المنعكسة6. وفي هذا السياق ،
الشكل 1: المناطق التشريحية من الغشاء السلوى علي المدى. الغشاء السلوى السري (الأصفر) ، الغشاء السلوى الذي يحيط بالمشيمة (ابيض) ، والغشاء السلوى المنعكس (اسود). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التشريح الميكانيكي لغشاء السلوى. (ا) منطقه السرة ، (ب) منطقه المشيمة ، (ج) المنطقة المنعكسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الثقافة الاساسيه التمثيلية لل HAEC مشتقه من الغشاء السلوى. ثقافة 48 ح بعد العزلة دون (ا) ومع (ب) تغيير في وسائل الاعلام. قضبان المقياس = 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الرسوم البيانية التمثيلية للنتائج السلبية للثقافة الاوليه لشركه HAEC. (ا) زيادة الكريات الحمراء. (ب) التلوث البكتيري. (ج) لم يتقيد الاتحاد الأوروبي بعد 48 ساعة من العزلة. (د) الثقافة الاوليه المكونة من خلايا ذات مورفولوجية ليفية. قضبان المقياس = 200 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مورفولوجية HAEC من مختلف المناطق التشريحية في المختبر. الرسومات البيانية التمثيلية لمتموج HAEC من المنعكس (اللوحة العليا) ، المشيمة (اللوحة الوسطي) ، ومناطق السرة (اللوحة السفلي) المستزرعة علي الرغم من P0 − P2. أشرطه مقياس 200 = μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التعبير عن البريد الكتروني و KI-67 في HAEC. الصور المجهرية الكتابية التمثيلية لل E-الملتصقين + و KI-67 + haec من ينعكس (لوحه اليسار) والمشيمة (اللوحة اليمني) امايون مثقف من خلال P0 − P2. قضبان المقياس = 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تعرض HAEC من المناطق التشريحية المختلفة لوحه علامات تعدد. الصور المجهرية البؤرية التمثيلية من أمنيون مزدوجة المناعية ل NANOG مع TRA-1-60 ، OCT4 مع E-الملتصقون ، و SOX2 مع SSEA-4 في HAEC (P1) من ينعكس (اللوحة العليا) والمشيمة (اللوحة السفلي) المناطق. قضبان المقياس = 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| # غشاء | تنعكس | مشيمة | السري | غشاء كامل |
| 1 | 75 X 106 | 130 X 106 | 0.2 X 106 | 205.2 X 106 |
| 2 | 38.5 X 106 | 52 X 106 | 0.53 X 106 | 91.03 X 106 |
| 3 | 59 X 106 | 53 X 106 | 0.2 X 106 | 112.2 X 106 |
| 4 | 42 X 106 | 27 X 106 | 0.36 X 106 | 69.36 X 106 |
| 5 | 44.8 X 106 | 22.3 X 106 | Np | 76.1 X 106 |
| 6 | 100 X 106 | 140 X 106 | 1 X 106 | 241 X 106 |
| 7 | 72 X 106 | 78 X 106 | Np | 150 X 106 |
| متوسط | 61.6 X 106 | 71.8 X 106 | 0.45 X 106 | 133.8 X 106 |
الجدول 1: عدد المناطق المعزولة لكل منطقه من الاغشيه السلوى. (NP = لم تتم معالجتها).
الشكل التكميلي 1: تونيل تلطيخ في HAEC (مرور 2) من المنطقة المنعكسة وفي خلايا التحكم الايجابيه (HL-60 الخلايا المعالجة مع camptothecin). قضبان المقياس = 50 μm. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نفذنا بروتوكولا جديدا لعزل HAEC من الاغشيه الاجله. وهو يختلف عن التقارير السابقة في ان كل غشاء كان ينقسم إلى المناطق التشريحية الثلاث قبل العزلة لتحليل الخلايا من كل واحد.
واحده من الخطوات الأكثر اهميه في البروتوكول هو غسل الغشاء لأزاله جميع جلطات الدم ، لأنها يمكن ان تتداخل مع نشاط التريبسين عند فصل الخلايا الظهاريه. الفشل في تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح يمكن ان يؤدي إلى الحصول علي الثقافة الاساسيه مع كريات الدم الحمراء المفرطة وعدد قليل من الخلايا الظهاريه ملتصقة. إذا لم يلاحظ اي مرفق في أول 24 − 48 ساعة بعد بذر الخلايا ، نوصي بنبذ الثقافة. نقطه حرجه أخرى هي وقت الحضانة للهضم الانزيمي. إذا كانت فتره الحضانة طويلة جدا ، يمكن ان تنخفض قابليه الخلايا و/أو الخلايا التي تحتوي علي الخلية المسمارية بدلا من المورفولوجية الظهاريه (الشكل 4). أيضا ، إذا لم يتم الهضم غشاء مع التحريض السليم ، واحتمال الحصول علي عدد منخفض من الخلايا لكل غشاء يزيد.
في هذا البروتوكول ، يمكننا الحفاظ علي السكان من HAEC في المختبر دون ان تفقد النمط الظاهري الظهاريه ، كما يتضح من وجود محدده الخلية الظهاريه علامة الكترونيه لمعظم الخلايا علي طول الممرات (الشكل 6). ومع ذلك ، في تجربتنا لا يمكن الا ان يتم توسيع HAEC لثلاثه مقاطع (P1 − P3). وينبغي ان يؤخذ العدد المحدود من الفقرات في الاعتبار بالنسبة للتجارب التي تتطلب فترات طويلة من الثقافة أو مقاطع متعددة. الاضافه إلى ذلك ، فقد أفيد انه بعد P3 تبدا الخلايا لتغيير المورفولوجية والحد من التعبير عن البريد-الملتصقين ، التالي فان الثقافة لفتره طويلة يمكن ان تحفز الانتقال الظهاريه-المسسبي (EMT)18. في الاونه الاخيره ، وقد ثبت ان البروجسترون يمنع EMT في الخلايا الظهاريه السلي البويضات19،20، لذلك سيكون من المثير للاهتمام لتحليل تاثير تركيزات مختلفه من البروجسترون في الوسط الثقافة haec لتجنب النمط الظاهري المسماري بعد الممر الثالث.
في جميع التقارير السابقة حيث كانت HAEC معزولة ، وقد افترض ان امايون ان يكون نسيج موحد علي الرغم من التباين المحتمل من السكان الظهاريه التي تشكل الغشاء كله. وعلي النقيض من ذلك ، يقسم هذا البروتوكول الغشاء إلى مناطقها التشريحية الثلاثة لعزل وثقافة HAEC بشكل منفصل بالنظر إلى تقارير التعبير المورفولوجية والجينات السابقة التي توحي بوجود اختلافات وظيفية. ومن غير الضروري أيضا لتنقيه من خلال فرز الخلايا للحصول علي السكان الظهاريه فقط ، كما هو موضح من خلال الكشف عن علامة الكترونيه الملتصقة اثناء الممرات حتى P2.
وقد ثبت ان HAEC معزولة من كل من المناطق الغشاء لديها تعبير مماثل من تعدد core ، كونها خزان الكامنة من الخلايا مع stemness. في هذا السياق ، يمكن استخدام هذه الخلايا في المختبر لدراسة أليات الجزيئية ، مثل التوطين الديناميكي لعوامل النسخ ذات الصلة بالتعدد أو قدرتها علي البقاء هادئه علي الرغم من التعبير عن الجينات المرتبطة بالسرطان ، بغض النظر عن منطقه المنشا التشريحية. ومع ذلك ، يجب ان البحث في المستقبل النظر في الاختلافات الجزيئية المبلغ عنها (الجينات التعبير العالمي ، والنشاط الأيضي ، واشاره مسارات) بين كل منطقه ، والتي سيكون لها تداعيات علي تطبيقها في الطب التجديدي. وقد ذكرنا سابقا تعبيرا مختلفا عن الجينات المشاركة في PI3K/AKT والإشارات البؤرية للتصاق المسارات بين المناطق السلوى المختلفة بواسطة RNA-seq6. PI3K/akt ينظم التجديد الذاتي ويحافظ علي تعدد في hpsc ، في حين ان تفعيل التصاق البؤري كيناز يعزز التمايز21،22. التالي ، فاننا نقترح وصف دور كلا المسارين في HAEC معزولة عن المناطق التشريحية المختلفة خلال بروتوكولات التمايز الخاصة بالنسب. الاضافه إلى ذلك ، تظهر عده دراسات الاختلافات بين المنطقتين فيما يتعلق بالمكونات الخلوية ، والوظائف الجزيئية ، والعمليات البيولوجية. فعلي سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن التعبير الجيني الخاص بالمنطقة وتوزيع البروتينات في المناطق التي تشارك في عمليه النقل الخاصة بالامتصاص داخل الإقليم ،23. قارنت دراسة أخرى miRNome بواسطة ميكروصفائف ، والتي تبين التعبير منطقه محدده من مير-145 و مير-143 ، وهذه الاخيره قادره علي تنظيم بوسترانسكريبتيونالي بروستاندداز-اندوبيراكسيديز synthase 2 تحت ظروف محدده مثل العمل في الفصل16. وعلاوة علي ذلك ، تقدم المنطقة المشيمة التنفس الميتوكوندريا اعلي ولكن انخفاض الكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية بالمقارنة مع الانسجه المنعكسة15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد دعمت أبحاثنا بمنح من المعهد الوطني لperinatología المكسيكية (21041 و 21081) و CONACYT (A1-S-8450 و 252756). نشكر جيسيكا غونزاليس نوريس وليديا يوريريا باريدس فيفاس علي الدعم الفني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , Springer. 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
