İnsan Amniyotik Membranının Farklı Anatomik Bölgelerinden Epitel Hücrelerin In Vitro Kültürü
Summary
Bu protokol, klinik ve fizyopatolojik modellerde olası uygulama için heterojenliklerini ve fonksiyonel özelliklerini belirlemek için insan amniyotik zarının farklı anatomik bölgelerinden epitel hücrelerinin izolasyonu açıklanmaktadır.
Abstract
Literatürde insan amniyotik epitel hücrelerinin (HAEC) izolasyonu ve kültürü için çeşitli protokoller bildirilmiştir. Ancak, bu amniyotik epitel homojen bir tabaka olduğunu varsayalım. İnsan amnionu üç anatomik bölgeye ayrılabilir: yansıyan, plasental, ve göbek. Her bölgenin patolojik koşullar gibi farklı fizyolojik rolleri vardır. Burada, insan amnion dokusunu üç bölümden ayırıp tüp bebek olarak muhafaza etmek için bir protokol uyguluyoruz. Kültürde, yansıyan amniondan elde edilen hücreler küloidal morfoloji speküel, hem plasental hem de göbek bölgelerindeki hücreler skuamözdür. Bununla birlikte, elde edilen tüm hücrelerde e-kadherin immünositinin immünotespiti ile gösterilen bir epitel fenotip vardır. Bu nedenle, yerinde plasental ve yansıyan bölgeler hücresel bileşenler ve moleküler fonksiyonlar farklı olduğundan, in vitro çalışmalar için bu farklılıkları dikkate almak için gerekli olabilir, çünkü HAEC kullanımı için fizyolojik etkileri olabilir biyomedikal araştırma ve rejeneratif tıpta bu hücrelerin umut verici uygulama.
Introduction
İnsan amniyotik epitel hücreleri (HAEC) embriyonik gelişimin erken aşamalarında, yaklaşık sekiz gün postfertilizasyon kaynaklanır. Onlar amniyotik membran1en iç tabakasından türetilen epiblast skuamöz epitel hücrelerinin bir popülasyon ortaya çıkar. Böylece, HAEC embriyo nun üç mikrop katmanları na ayırt etme potansiyeline sahip epiblast pluripotent hücrelerin kalıntıları olarak kabul edilir2. Son on yılda, çeşitli araştırma grupları in vitro bir kültür modeli onların varsayımsal pluripotency ile ilgili özellikleri karakterize etmek için gebelik döneminde amniyotik membran bu hücreleri izole etmek için yöntemler geliştirdik3,4.
Buna göre, HAEC’in yüzey antijenleri SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; pluripotency transkripsiyon faktörleri OCT4, SOX2 ve NANOG çekirdek; ve çoğalma belirteci KI67, kendi kendini yenileyen olduğunu düşündüren5,6,7. Ayrıca, bu hücreler üç germ katmanları (ektoderm, mezoderm ve endoderm)4,5,8,yanı sıra insan hastalıklarının hayvan modellerinde soy-spesifik belirteçleri için pozitif hücreleri elde etmek için farklılaşma protokolleri kullanılarak meydan edilmiştir. Son olarak, HAEC ekspres E-kadherin, onlar hpsc gibi bir epitel doğasını korumak olduğunu göstermektedir5,9.
Onların embriyonik kökenli dışında, HAEC farklı klinik uygulamalar için uygun hale diğer içsel özelliklere sahip, anti-inflamatuar ve antibakteriyel moleküllerin salgılanması gibi10,11, büyüme faktörleri ve sitokin salınımı12, onlar HPSCileaksine immüneksik fareler içine nakledildiğinde teratom oluşumu , ve immünolojik tolerans ifade hla-G ifade çünkü, hangi reddedilme riskini azaltır transplantasyon13.
Ancak, önceki raporlar insan amnion homojen bir membran olduğunu varsayılmıştır, anatomik ve fizyolojik olarak üç bölgeye ayrılabilir dikkate almadan: plasental (decidua bazaliskapsayan amnion ), göbek (göbek kordonu saran parçası), ve yansıyan (plasenta bağlı olmayan membran geri kalanı)14. Bu morfoloji, mitokondriyal aktivite, reaktif oksijen türlerinin tespiti15,miRNA ekspresyonu16ve sinyal yollarının aktivasyonu nda amnion ekran farklılıkları plasental ve yansıyan bölgelerde gösterilmiştir17. Bu sonuçlar, insan amnion yerinde veya in vitro modellerde yapılan ileri çalışmalar için düşünülmelidir farklı işlevsellik ile heterojen bir popülasyon tarafından entegre olduğunu göstermektedir. Diğer laboratuvarlar HAEC’in tüm membrandan izolasyonu için protokoller tasarlarken, laboratuvarımız farklı anatomik bölgelerdeki hücreleri izole etmek, kültürünü ve karakterizesini sağlamak için bir protokol oluşturmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
HAEC’i dönem zarlarından izole etmek için yeni bir protokol uyguladık. Her zarın izolasyondan önce üç anatomik bölgeye bölünerek her bir membrandan hücreleri analiz ettiği önceki raporlardan farklıdır.
Protokoldeki en kritik adımlardan biri, epitel hücrelerini ayırırken tripsin aktivitesine engel olabileceğinden, tüm kan pıhtılarını temizlemek için zarın yıkanmasıdır. Bu adımın düzgün bir şekilde gerçekleştirilememesi, aşırı eritrositler ve az sayıda y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırmamız Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 ve 21081) ve CONACYT (A1-S-8450 ve 252756) tarafından desteklenmiştir. Teknik destek için Jessica González Norris ve Lidia Yuriria Paredes Vivas’a teşekkür ederiz.
Materials
| Culture reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | Supplemented with high glucose and HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| Embryonic stem-cell FBS, qualified | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| Paraformaldehyde | any brand | ||
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Saline solution (sodium chloride 0.9%) | any brand | ||
| Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| Disposable material | |||
| 100 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3516 | |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | |||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Centrifuge | |||
| Micropipettes | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Sterile beakers of 500 mL | |||
| Sterile plastic cutting board | |||
| Sterile scalpels, scissors, forceps, clamps | |||
| Sterile stainless steel container | |||
| Sterile tray | |||
| Tube Rotator | MaCSmix | ||
| Antibodies and Kits | Antibody ID | ||
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| Anti-KI67 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859) |
| Anti-NANOG | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| Anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| Anti-SOX2 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| Anti-SSEA-4 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| Anti-TRA-1-60 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_2119059 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Tunel Assay Kit | Abcam | 66110 |
References
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
- Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082 (2015).
- Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
- Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
- Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
- Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
- Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003 (2018).
- Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
- Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
- Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , 268-318 (1995).
- Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
- Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131 (2011).
- Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
- Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
- Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761 (2017).
- Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
- Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
- Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
- Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320 (2015).
- Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).
