Summary
Detta protokoll ger en lätt att hantera metod för att odla tarmcellerna från sjögurka Apostichopus japonicus och är kompatibel med en mängd olika allmänt tillgängliga vävnadsprover från marina organismer, inklusive ECHINODERMATA, Mollusca, och Crustacea.
Abstract
Primära odlade celler används i en mängd olika vetenskapliga discipliner som exceptionellt viktiga verktyg för funktionell utvärdering av biologiska substanser eller karakterisering av specifika biologiska aktiviteter. Men på grund av bristen på universellt tillämpliga cellkultur medier och protokoll, väl beskrivna cell odlingsmetoder för marina organismer är fortfarande begränsade. Under tiden hämmar den vanligast förekommande mikrobiella föroreningen och de polytropiska egenskaperna hos Marina ryggradslösa celler ytterligare inrättandet av en effektiv cellkultur strategi för Marina ryggradslösa djur. Här beskriver vi en lätt att hantera metod för odling av tarmceller från sjögurka Apostichopus japonicus; Dessutom, vi ger ett exempel på in vitro-apoptos induktion och detektion i primära odlade tarmceller. Dessutom ger detta experiment information om lämplig odlingsmedium och cellinsamlingsmetod. Det beskrivna protokollet är förenligt med en mängd allmänt tillgängliga vävnadsprover från marina organismer, inklusive ECHINODERMATA, Mollusca och Crustacea, och det kan ge tillräckliga celler för flera in vitro-experimentella tillämpningar. Denna teknik skulle göra det möjligt för forskare att effektivt manipulera primär cellkulturer från Marina ryggradslösa djur och att underlätta funktionell utvärdering av riktade biologiska material på celler.
Introduction
Odling av celler under artificiellt kontrollerade betingelser, och inte i deras naturliga miljö, ger enhetliga experimentella material för biologiska studier, särskilt för arter som inte lätt kan odlas i laboratoriemiljö. Marina ryggradslösa djur står för mer än 30% av alla djurarter1, och de tillhandahåller många biologiska material för att bedriva forskning om regleringsmekanismerna för specifika biologiska processer, såsom Regeneration2,3, stress svar4och miljöanpassning5,6.
Sjögurka, apostichopus japonicus, är en av de mest studerade artikel om arter som lever tempererade vatten längs Norra Stillahavskusten. Det är välkänt som en kommersiellt viktig art och mariculodlade i stor skala i Östasien, särskilt i Kina7. Många vetenskapliga frågor om A. japonicus, inklusive de reglerande mekanismerna bakom intestinal förnyelse efter urtagning8 och degeneration i aestivation9, metabolisk kontroll10,11, och immunsvar12,13 under termiska eller patogena spänningar, har uppmärksammats av forskare. Men jämfört med väl studerade modell djur, grundforskning, särskilt på cellnivå, begränsas av tekniska flaskhalsar, såsom avsaknaden av avancerade metoder cellodling.
Forskare har ägnat mycket arbete åt att etablera cellinjer, men de har också stått inför många utmaningar och ingen cellinjer från några Marina ryggradslösa djur har etablerats ännu14. Men primära cellkulturer från Marina ryggradslösa djur har avancerat i senaste decennierna15,16, och de har gett en möjlighet för experiment på cellnivå. Till exempel, den regenererande intesine från A. japonicus har utnyttjats som en källa till celler för långsiktiga cellkulturer som gav en praktisk metod för primär cellkultur av Marina ryggradslösa djur17. Detta protokoll kombinerade och optimerade strategier för ryggradslösa cellkulturer och utvecklade en allmänt lämplig primär kultur metod för sjögurka eller andra ryggradslösa marina djur.
Apoptos är en inneboende cell självmord program som utlöses av olika exogena och endogena stimuli. Koordinerad apoptos är avgörande för många biologiska system18,19, och det har varit inblandad i intestinal regression av sjögurka under aestivation9. För att undersöka den apoptotiska processen i organismer av intresse, en rad metoder, inklusive Hoechst färgning och mikroskopi analyser, har upprättats och framgångsrikt tillämpas20. Här genomförde vi apoptos induktion och detektion i primära odlade tarmceller av sjögurka för att bedöma användbarheten av primära celler i biologiska studier av Marina ryggradslösa djur. Dexametason, en av de vanligaste syntetiska glukokortikosteroiderna21, användes för att inducera apoptos i odlade tarmceller från sjögurka, och betydande Hoechst 33258 signal framgångsrikt upptäcktes i de färgade cellerna av fluorescerande mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell odling medelstor beredning
-
Coelomic vätska förberedelse
- Coelomic Fluid insamling: Under sterila förhållanden, dissekera en frisk sjögurka (våtvikt av 85-105 g), samla coelomic vätska, och förvara den i en steril glaskolv.
- Coelomic cell borttagning: Centrifugera den coelomic vätskan i 50 mL centrifugrör på 1 700 x g i 5 min och överföra supernatanten till en ny steril glaskolv; därefter samla in den cell fria coelomic vätskan av sjögurka.
- Inaktive Ring av komplement komponenter: Inkubera den sterila glasflaskan, som innehåller Sea gurka coelomic Fluid, i ett 40 – 50 ° c vattenbad för 20 – 40 min för att erhålla komplement komponenter-inaktiverad coelomic Fluid.
- Microbe avlägsnande: Ta bort bakterier och klamydia genom filtrering genom 0,22 μm membranfilter. Därefter ta bort Mycoplasma och andra fina partiklar genom filtrering med hjälp av 0,1 μm membranfilter för att få coelomic vätska förbehandling lösning.
- Justering av salthalt: Justera salthalten i den coelomic Fluid förbehandlings lösningen till 30‰ (mätt med salinometer) genom att tillsätta 20% hög koncentration Försteriliserad och filtrerad NaCl-lösning (utspädd med förbehandlad coelomic Fluid) eller DDW (dubbelt destillerat vatten). Överför havet gurka coelomic vätska till en steril flaska, försegla flaskan, och förvara vätskan vid 4 ° c för ytterligare experiment.
-
Leibovitz s L-15 cellkulturmedium optimering
- Väg 5,05 g av NaCl, 0,135 g KCl, 0,15 g av CaCl2, 0,25 g av na2så4, 0,975 g av mgcl2, 0,25 g glukos, och 6,25 mg taurin och späd dem i 40 ml av Leibovitz s L-15 medium i en 50 ml steril centrifug röret. Skaka röret på en shaker i 1 h för att säkerställa att salterna har lösts upp helt.
- Tillsätt 2,5 mL L-glutamin (100 mg/mL) och 500 μL av VE lösning (1,75 mg/L) i tidigare preparerade Leibovitz s L-15 medium och ytterligare filtrera mediet genom 0,22 μm membranfilter.
- Justera den totala Medelvolymen till 500 mL med färska Leibovitz s L-15 medium och med 100 mL av tidigare beredda coelomic vätska; justera sedan pH till 7,6 med hjälp av NaOH-lösning. Behåll Operations processen i en steril miljö. Den kompoundering förhållandet av coelomic vätska kan vara 10%-50%, och 20% är tillräckligt för A. japonicus intestinal celler kultur.
2. intestinal cell beredning
-
Sjögurka tarmen bearbetning
- Anaesthetize friska havet gurkor i en Ice Box. Dissekera och samla främre tarmarna, sedan avsnitt vävnadsprover vertikalt och ta bort det inre innehållet.
- Tvätta vävnadsproverna i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger och desinficera dem genom nedsänkning i en vattenlösning av etanol (75 volymprocent) som inte är längre än 2 s.
- Tvätta vävnadsproverna i PBS tre gånger för att ta bort etanol och överför ca 100 mg vävnadsprov till ett 2,0 mL sterilt microcentrifugerör.
-
Cell insamling
- Tillsätt 1,5 mL av det föroptimerade odlingsmediet till havet gurka tarm vävnad blocket och färs blocket med steriliserad kirurgisk sax tills lösningen är grumlig.
Anmärkning: för valfritt förenklat protokoll, tillsätt 0,5 mL av pre-optimerad odlingssubstrat till havet gurka tarm vävnad blocket och skär blocket med steriliserad kirurgisk sax i 1 mm3. Överför proverna direkt till kultur rätter följt av efterföljande inkuberande steg. - Tillsätt 400 μL trypsin (0,25%), blanda lösningen med inversion och inkubera den i 5 minuter vid rumstemperatur; filtrera sedan lösningen med en cell SIL på 100 μm.
Anmärkning: det är frivilligt att lägga trypsin för cell spridning vid behandling av olika vävnadsprover. Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) bör ingå i trypsin lösning för att minska den hämmande aktiviteten från ca2 + och mg2 + i odlingssubstrat. - Samla upp filtratet till ett nytt sterilt 2,0 mL microcentrifugerör, Centrifugera vid 1 700 x g i 3 min, Kassera supernatanten, sedan Omsuspendera pelleten i odlingssubstrat (kompletterad med antibiotika) och tvätta den två gånger.
Anmärkning: Förbered färsk pre-optimerad odlingssubstrat kompletteras med 2% penicillin-streptomycin lösning (10 000 U/mL penicillin och 10 mg/mL streptomycin) och 1% gentamicin (4 mg/mL) före början av experimentet.
- Tillsätt 1,5 mL av det föroptimerade odlingsmediet till havet gurka tarm vävnad blocket och färs blocket med steriliserad kirurgisk sax tills lösningen är grumlig.
3. cell odling
-
Inkubator för inställning: Förinställa inkubatorn för cellodling och kör den i förväg i minst 24 timmar med temperatur på 18 ° c och mättad fuktighet.
Anmärkning: feed CO2 i inkubatorn beroende på cellodlingsmedium egenskaper; ingen CO2 behöver tillhandahållas när man använder bas mediet för Leibovitz s L-15. -
Cellkultur för första etappen
- För att hämma tillväxten av mikrober och främja spridningen under det inledande stadiet av cellkultur, tillsätt 10 mL av penicillin-streptomycin lösning (10 000 U/mL penicillin och 10 mg/mL streptomycin) och 0,5 mL gentamicin (40 mg/mL) i varje 500 mL av pre-optimerade odlingssubstrat. Dessutom, komplettera varje 500 mL odlingssubstrat med 0,6 mL insulin (10 mg/mL), 100 μL av insulin-liknande tillväxtfaktor (0,1 μg/μL), och 25 μL fibroblasttillväxtfaktor (0,1 μg/μL).
- Samla in cellerna i 1,5 mL rör, Omsuspendera dem med 200 μL av indikerat medium, och Pipettera dem i φ 4 cm rätter.
- Odla cellerna i en inkubator och tillsätt 2,0 mL indikerat medium till cell odlingsrätterna efter 6 h. ändra hälften av mediet varje 12 h tills de når nästa steg.
Anmärkning: hantera medelförändringen försiktigt, eftersom cellerna inte är knutna till rätterna tätt. Poly-D-Lysine-belagda rätter kan användas för löst fästa till skålen celler.
-
Andra etappen cellkultur
- För att minska de negativa effekterna av antibiotika till de odlade cellerna, minska koncentrationen av indikerade antibiotika (penicillin, streptomycin, och gentamicin) i odlingsmediet med hälften.
Observera: användningen av insulin och tillväxtfaktorer beror på cell odlingsförhållandena och är frivillig. - Byt ut cell odlingsmediet; genomför medel förändringar varannan till tre dagar beroende på celltäthet.
Obs: Observera odlade celler dagligen under ett mikroskop och registrera tillväxtförhållanden.
- För att minska de negativa effekterna av antibiotika till de odlade cellerna, minska koncentrationen av indikerade antibiotika (penicillin, streptomycin, och gentamicin) i odlingsmediet med hälften.
-
Cell passaging
Anmärkning: passage och subkultur cellerna, när den primära CELLTÄTHETEN når 60%.- Tvätta de odlade cellerna två gånger med PBS i rumstemperatur. Tillsätt 200 μL trypsin-lösning (0,25%) till varje maträtt och manuellt agitera skålen se till att hela botten är täckt. Kassera trypsinlösningen och inkubera cellerna i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna med 1,0 mL färskt odlingsmedium genom att Pipettera och omlägga cellerna. Överför 0,5 mL cellsuspension till en ny maträtt, tillsätt 1,5 mL färskt medium och inkubera cellerna vid 18 ° c.
Obs: cell skrapor kan användas för cellinsamling när trypsin lösningen inte smälta och lossa celler från disken (vissa cellinjer är för lim). Dock inte utföra båda metoderna samtidigt. - Ändra mediet efter 12 h och observera cellerna under ett mikroskop för att utvärdera villkoren. Odla cellerna för ytterligare experimentella analyser.
4. apoptos induktion och detektion i A. japonicus tarmceller
-
Cell kultur och dexametason-behandling
- Förbered tarmcellerna efter det tidigare införda protokollet och tillsätt cellerna droppvis till en 12-brunn tallrik på en cell volym av 2 x 106 per brunn.
- Efter tre dagar i kulturen, efter stegen i "första etappen cellkultur", tvätta cellerna tre gånger med PBS och ersätta mediet med optimerad medium (utan antibiotika och tillväxtfaktorer).
- Späd dexametason (DXMS) i odlingsmedium för beredning av nya 2 μM och 200 μM DXMS-lösningar innan experimenten påbörjas.
- Lägg till DXMS-lösningar i olika koncentrationer till odlade celler som odlas med samma volym odlingssubstrat; Ställ in tre experimentella grupper inklusive kontroll (CTL), 1 μM och 100 μM DXMS.
-
Hoechst färgning
- Tvätta cellerna med PBS tre gånger efter inkubering med/utan DXMS för de angivna tidsperioderna (0 h, 24 h, och 48 h).
- Tillsätt 300 μL av Hoechst 33258 lösning per brunn till en 12-brunn tallrik och inkubera vid 18 ° c i 30 min. skaka försiktigt plattan för att täcka alla celler som säkerställer deras färgning.
- Ta bort Hoechst färgning lösning och fixera cellerna genom att tillsätta 300 μL av en 4% paraformaldehydlösning (i PBS) till varje brunn. Skaka försiktigt i 15 minuter.
Försiktighet: PARAFORMALDEHYD är måttligt giftigt vid hudkontakt eller inandning, och det betecknas som en sannolik cancerframkallande hos människor. Kemiska dragkåpor, ventilerade balans höljen eller andra skyddsåtgärder bör användas vid vägning och hantering av PARAFORMALDEHYD. - Tvätta de fasta cellerna tre gånger i PBS. Kassera inte PBS efter tvättning för att hålla cellerna täckta.
-
Fluorescerande mikroskopi analys
- Slå på fluorescerande Mikroskop hårdvara inklusive Mercury LAMP Power, fluorescerande ljus makt, och PC. Logga in på operativsystem kontot, starta programvaran och kontrollera dess konfiguration.
- Placera den preparerade plattan på Mikroskop stadiet. Placera provet över objektivlinsen med hjälp av scenkontrollanten.
- Hitta cellerna av intresse under ljusmikroskop, växla till fluorescerande mikroskopi, och fånga bilderna genom att trimma parametrarna.
Anmärkning: för att observera Hoechst 33258 fluorescerande signal bunden till nuklei DNA, fluorescens mikroskopi bör genomföras med excitation och emission vid cirka 352 nm och 461 nm, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här etablerade vi primär intestinal cellkultur av A. japonicus och passerade cellerna. Figur 1 visar runda celler i olika stadier av odling. Och EdU färgning analyser ger direkta bevis för att avslöja den proliferativa aktiviteten av dessa runda celler i senare skede (figur 2). Vi justerade också något protokollet, odling av malet vävnad block i stället för filtrerat celler; Dessutom kan en spindel celltyp odlas framgångsrikt. Denna celltyp inträffade runt tarm vävnad blocken och kunde observeras efter fyra dagar av kultur; men det gick inte att vara blint (figur 3).
De odlade cellerna kan användas för olika biologiska experimentella tillämpningar. Vi behandlade cellerna med DXMS för olika tidsperioder, följt av Hoechst 33258 färgning för apoptotisk cell detektering. Figur 4 indikerar den inducerade apoptotiska signalen som upptäcks från sjögurka tarmceller genom Hoechst 33258 färgning och fluorescerande mikroskopi. Figur 5 visar de apoptotiska cellpriserna för indikerade tidsperioder under stimulering med dxms.
Figur 1: mikroskopi av odlade hav gurka tarm runda celler i olika stadier. (A) celler som är fästa på botten av rätter på tredje dagen efter att ha seedade. B) cellproliferation på den sjunde dagen. (C) celler som är fästa på botten av rätter efter passaging. Dceller som har förlorat sin verksamhet och som dör efter tio passager. "CM" indikerar cellmassa, som uppstår under cellproliferation. "BT" indikerar det svarta spåret, som lämnades av döda celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: cellproliferation som upptäckts av EdU-infärgningsanalyser. Cell proliferation analyser utfördes med hjälp av Kit (tabell över material) enligt tillverkarens protokoll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mikroskopi av odlade hav gurka tarm vävnad block och cell spridning. (A) vävnads block (TB) fäst vid skålen botten den första dagen efter kulturen. Bvävnads block och celler som fästs vid skålen under den andra dagen efter kulturen. Cvävnads block och perifera celler inträffade på fjärde dagen efter kulturen. D) prolifererade spindel celler på sjunde dagen efter kultur. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: fluorescerande mikroskopi av tarm runda celler med inducerad apoptos. "NC" indikerar nukleär kondenserande fluorescerande signal. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: statistisk analys av Hoechst-positiva tarm runda celler. Fördelning av andelen kärn kondensation fluorescerande signal-positiva celler bland Hoechst färgade A. japonicus tarmceller tillsammans med dos eller tidsförlopp experimentet (n = 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omfattande forskningsinsatser har ägnats åt att etablera cellinjer under de senaste decennierna, men det är fortfarande svårt att göra framsteg på långsiktig kultur av celler från Marina ryggradslösa djur14,22. Det har rapporterats att odlade celler från regenererande holothurian vävnader var livskraftiga under en lång tidsperiod och hög aktivitet av proliferation kan upptäckas i specifika celler17,23. Men för den normala Marina ryggradslösa celler, det finns ännu ingen praktisk cellkultur synsätt beskrivits. Det protokoll som presenteras här ger en effektiv och lätt tolkningsbar metod för odling och passaging tarmceller från de marina ryggradslösa arter A. japonicus. Metoden kan enkelt anpassas för primär cellodling av många olika Marina ryggradslösa organismer såsom bläckfisk och krabba.
En rad nyckelfaktorer påverkar den framgångsrika tillämpningen av detta förfarande. Förebyggande av mikrobiell kontaminering är av största vikt under hela processen, särskilt under den första Kulturveckan. Vattenlevande djur brukar kontakta många mikrober från miljön, som kolonisera deras vävnader, såsom Gill, tarmen, fin, och hud. Sålunda, det kommer att vara omöjligt att sterilisera vävnadsprover innan cellodling initiering. För att minimera risken för mikrobiell kontaminering under cellkulturen är 75% etanol nedsänkning för vävnadsprov sterilisering nödvändig; behandlingstiden bör dock optimeras för olika vävnadstyper. Dessutom spelar tillämpningen av höga antibiotiska koncentrationer under de tidiga stadierna av cellkulturen också en viktig roll i hämningen av mikrobiell tillväxt. Vidare är mediet formuleringen en viktig faktor som avgör spridningen och livslängden av odlade celler. Eftersom näringsbehoven hos Marina ryggradslösa celler fortfarande är okända, har det nuvarande cell odlingsmediet använts huvudsakligen för ryggradsdjur eller insekt cellinjer14. För att leverera tillräckligt näringsmässiga material, kan förbehandlade coelomic vätska från sjögurkor användas som liknar FBS i däggdjurscell kultur. Under tiden, för att underlätta cellproliferation, kan flera tillväxtfaktorer för däggdjur också tillämpas på odlingssubstrat. Eftersom inkubations temperaturen är en faktor som påverkar framgången för den marina invertebratcellkulturen, bör inkuberande celler under den optimala tillväxt temperaturen hos målorganismen övervägas. Till exempel kan temperaturen för A. japonicus cellkultur ställas in vid 18 ° c, som är lämplig för sin tillväxt24.
Vävnad förbehandling kan påverka framgångsrikt odlade och prolifererande celltyper. Mycket olika A. japonicus tarmceller, runda eller spindel, kan erhållas från sådd filtrerat celler eller vävnads block under exakt samma odlings förfarande (jämförande data från figur 1 och figur 3). Således bör optimera vävnads förbehandling metod för specifik cellkultur typ också utföras i början; det optimala tillvägagångssättet bör avgöras enligt den biologiska experimentella designen.
Här tillämpade vi DXMS behandling för apoptos induktion i A. japonicus tarmceller efter tre dagar i kulturen, och vi genomförde Hoechst färgning för apoptotiska signaldetektering. Framgångsrik detektion av Hoechst positiva celler, efter 48 h stimulering av 1 μM DXMS, som ett praktiskt exempel för ett biologiskt experiment baserat på de odlade cellerna.
Det beskrivna protokollet är lätt att hantera och kan användas för att etablera en Marina ryggradslösa cellkultur. De odlade cellerna bör ge biologiskt material med konsekvent genetisk bakgrund för olika ytterligare biologiska experimentella tillämpningar. Dessutom kan något justerade protokoll förfaranden ändra framgångsrikt prolifererande celltyper under kulturen och ge olika cell material för biologiska experiment. Så, optimering av vissa steg i protokollet kommer att behövas, beroende på den riktade djurarter och de specifika celltyper som behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka prof. Naiming Zhou från Zhejiang universitet för hans tekniska råd och för att göra utrustningen av hans laboratorium tillgängliga för användning. Detta arbete stöddes ekonomiskt av National Natural Science Foundation i Kina (Grant nummer 41876154, 41606150 och 41406137) och de grundläggande forskningsfonderna för Zhejiang provinsiella universitet och forskningsinstitut [Grant Number 2019JZ00007 ].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
