Summary
此处提供了一个协议,详细说明了建立慢性缺血后疼痛(CPIP)动物模型的步骤。这是一个公认的模型,模仿人类复杂的区域疼痛综合征I型。进一步评价机械和热超敏感性,以及在CPIP大鼠模型中观察到的辣椒素引起的角感行为。
Abstract
复杂的区域疼痛综合征I型(CRPS-I)是一种神经系统疾病,在患者中引起剧烈疼痛,并且仍然是一个未解决的医疗状况。然而,CRPS-I的基本机制尚未透露。众所周知,缺血/再灌注是导致CRPS-I的主要因素之一。通过长期缺血和后肢再灌注,建立了大鼠慢性缺血后疼痛(CPIP)模型,以模仿CRPS-I。CPIP模型已成为研究CRPS-I机制的公认动物模型。该协议描述了建立CPIP大鼠模型所涉及的详细程序,包括麻醉,然后是后肢缺血/再灌注。通过测量后肢的机械和热超敏感性以及急性辣椒素注射的角质反应,进一步评价大鼠CPIP模型的特征。大鼠CPIP模型表现出几种CRPS-I样的表现,包括建立后早期后肢水肿和高血症,持续热和机械过敏,以及急性辣椒素注射增加的角质反应。这些特性使其成为进一步研究CRPS-I中涉及的机制的合适动物模型。
Introduction
复杂的区域疼痛综合征 (CRPS) 引起骨折、创伤、手术、缺血或神经损伤1、2、3引起的复杂和慢性疼痛症状。CRPS分为2个子类别:CRPS类型I和II型(CRPS-I和CRPS-II)4。流行病学研究表明,CRPS的流行率约为1:20005。CRPS-I,显示没有明显的神经损伤,可能导致慢性疼痛,并极大地影响患者的生活质量。目前可用的治疗方法显示治疗效果不足。因此,CRPS-I 仍然是一个需要解决的重要且具有挑战性的临床问题。
建立模仿CRPS-I的临床前动物模型对于探索CRPS-I背后的机制至关重要。为了解决这个问题,Coderre等人设计了一个大鼠模型,将长期缺血和再灌注到后肢,以重述CRPS-I6。据了解,缺血/再灌注损伤是CRPS-I7的主要原因之一。大鼠CPIP模型表现出许多CRPS-I样的症状,包括后肢水肿和高血症在模型建立后的早期阶段,其次是持续热和机械高灵敏度6。在此模型的帮助下,建议中央疼痛敏化、外周TRPA1通道激活和活性氧物种生成等对CRPS-I8、9、10作出贡献。我们最近成功地建立了CPIP大鼠模型,并进行了背根结核(DRGs)的RNA测序,内骨对受影响的后爪11进行内脏测序。我们发现了一些潜在的机制,可能参与调解CRPS-I11的疼痛过度敏感。我们进一步确定DRG神经元中的瞬态受体电位万能1(TRPV1)通道是CRPS-I12的机械和热超灵敏度的重要原因。
在这项研究中,我们描述了建立CPIP的老鼠模型所涉及的详细程序。通过测量机械和热超敏感性及其对急性辣椒素挑战的反应能力,我们进一步评估了大鼠CPIP模型。提出大鼠CPIP模型是进一步研究CRPS-I中相关机制的可靠动物模型。
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Protocol
动物规程经浙江医科大学动物伦理委员会批准。
1. 动物
- 从上海实验室动物中心获得雄性斯普拉格-道利(SD)大鼠(280~320克,8-10周龄)。在浙江中医药大学动物实验室动物中心饲养动物。请注意,繁殖条件应包括 12 h/ 2h 的光/暗周期,并保持温度稳定在 24°C。提供水和食物。请注意,本研究共使用了48只大鼠。有一点,在这个模型中,我们需要观察整个过程中的疼痛反应。如果应用止痛药,我们就无法成功建立疼痛模型。实验结束后,老鼠被牺牲了。
2. CPIP模型建立
- 用苯巴比妥钠(50毫克/千克,腹内注射[i.p.])麻醉所有大鼠(包括假鼠和CPIP模型组)。如有必要,使用高达 20 mg/kg/h 苯巴比妥 [i.p.] 维持麻醉。检查每只动物的反应,用钳子捏它的后爪或尾尖。确保大鼠在建立模型之前没有响应。在眼睛上放置兽医膏,以避免在手术过程中干燥。将麻醉大鼠放在37°C的加热垫上,进行以下操作。
-
缺血和后爪的再灌注
- 一旦大鼠被麻醉,用甘油润滑右后爪和脚踝。
- 将内径为 7/32 英寸(5.5 毫米)的 Nitrile 70 Durometer O 型环滑入 1.5 mL Eppendorf 管的较大侧(使用前切断卡帽)。小心地将后爪插入空心的 Eppendorf 管中,直到到达底部。
- 逐渐将O环从管子滑到靠近踝关节的右后肢,并放置3小时。
- 在缺血步骤后切断 O 型环 3 小时。仔细观察大鼠,直到它恢复足够的意识,以保持胸腔。请注意,接受麻醉的大鼠在完全恢复之前,不应将其放回其他大鼠的陪伴中。
3. 规范行为测试
- 将大鼠放在一个透明的Plexiglas室中,这个房间位于网状地板上。在任何行为测试之前,将大鼠活动0.5小时。
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机械过敏症
- 在测试中使用 von Frey 灯丝(0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 和 26.0 g 灯丝)。从中间灯丝 (4.0 g) 开始测试。垂直地将灯丝涂在后爪的中间平面上。稍微施加适当的力,将灯丝弯曲长达 5 s。突然收回后爪对刺激的反应被认为是一种尖利行为。在 -3、-2、-1 天每隔一天进行机械异位测试,直到第 13 天。
- 应用上下测试方法来测试阈值。应用迪克森方法计算50%爪提取阈值(PWT)13,14,15。
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热超阿尔基西亚
- 使用哈格里夫斯的方法检查热超热性。直接将灯泡(50 W)发射的光束对准后爪,以测量爪子提取延迟 (PWL)。将 20 s 设置为截止阈值,以避免加热造成过度伤害。
- 每个后爪以 5 分钟间隔重复每个测试 3 倍。以这三个测试的平均数作为每只大鼠的PWL16。在 -3、-2、-1 天每隔一天进行热超节性测试,直到第 13 天。
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辣椒素诱发急性角化行为
- 使用二甲基硫酸盐(DMSO)制备辣椒素原料溶液(200 mM),并在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进一步稀释至1:1000,用于后爪注射。PBS 中的最终 DMSO 浓度为 0.1%(仅在 PBS 中车辆包含 0.1% DMSO)。使用连接到 1 mL 注射器的 30 G 针头,以 50 μL 的体积将辣椒素或车辆注射到后爪(内平面内注射)。
- 记录注射后10分钟的电感行为(即舔、咬或退缩注射的爪子),然后像前面描述17、18、19那样进行量化。
- 动爪水肿评价:通过测量爪径的增加来评估后爪水肿。使用数字卡钳测量,并计算基基值与在不同时间点观察到的测试值之间的差异。在模型建立后,评估 15 分钟、24 小时、48 小时和 72 h 的爪子厚度变化。
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Representative Results
在脚踝上放置O环后,叶侧后爪皮肤出现青紫,指示组织缺氧(图1A)。切割O环后,叶侧后爪开始充满血液,并表现出强健的肿胀,这显示了高血症的强烈迹象(图1A)。爪子肿胀逐渐减少,并在缺血/再灌注程序后恢复正常的48小时(与Sidak的双向ANOVA,即位测试,图1B)。所有这些迹象都符合以前的研究6,12。
然后,使用冯·弗雷头发测试测量机械过敏症。与假组相比,CPIP组的后爪在模型建立后1天表现出明显的机械性全侧。益西侧后爪的机械性异位肌一直持续到观察时间范围的13天(双向ANOVA与Sidak的后点测试,图1C)。CPIP组的反向后爪也表现出类似于益边后爪的机械超节,持续13天(双向ANOVA与Sidak后测试,图1D)。
然后,使用哈格里夫斯测试测量热超节。与假组大鼠相比,CPIP大鼠的双边后爪表现出显著减少的戒断延迟,以回应有害的热刺激,这是热增节症的标志(与假组大鼠相比(双向ANOVA与Sidak后特级测试,图1E,F)。这一观察结果与先前的研究11、12一致。益西侧后爪的热超节一直持续到观测时间范围结束,而反向后爪的热超节持续7天(与西达克的双向ANOVA,即点后测试,图1E,F)。上述结果表明,CPIP大鼠产生强健和持久的机械和热超敏性,与先前的观测结果11,12一致。
CRPS患者在20日对辣椒素引起的疼痛表现出明显增加的反应。然后,研究CPIP大鼠模型是否可以重述这一现象。在CPIP大鼠的角性行为被观察到响应植物内辣椒素(TRPV1激动剂)注射到ipsi侧后爪。首先,对注射车辆时大鼠的感知反应进行了测试。假组对车辆喷射表现出轻微的轻微反应,而 CPIP 组表现出比假组高得多的响应(带有 Sidak 的单向 ANOVA,即点后测试,图 2)。此外,辣椒素注射导致在假组强健的角性反应(图2)。更重要的是,CPIP大鼠对辣椒素注射的反应明显高于假组(图2)。这些数据表明,CPIP大鼠对辣椒素表现出更强的抗性反应,这是一种模仿CRPS-I的人类患者的现象。
图1:CPIP大鼠模型显示双后肢的热和机械疼痛过度敏感。(A) 在不同时间点(缺血期间,再灌注后10分钟,7天后)拍摄的典型图像。(B) CPIP 和假组的后爪厚度测量。(C,D) 50% 爪子提取阈值 (50% PWT, 机械超脂指数) 的益边 (C) 和反向 (D) 后爪的大鼠.(E,F)爪子戒断延迟(PWL,热超节指数)的益边(E)和反向(F)后爪大鼠(n = 8大鼠每组,\p <0.01)。结果表示为均值 = SEM(双向 ANOVA 后跟 Sidak 的特次测试)。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:CPIP大鼠在将辣椒素注射到叶西侧后爪中时,表现出与假大鼠相比更多的角性行为。大鼠在车辆后10分钟内(PBS,普天间0.1%DMSO)或辣椒素(50μL体积为10 nmol,普天间)注射(n = 每组8只大鼠,μp <0.01)后计算了大鼠舔、咬或退缩的累积时间。结果表示为均值 = SEM(单向方差分析后,Sidak 后特次测试)。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议描述了通过在大鼠后肢应用缺血/再灌注来建立大鼠CPIP模型的详细方法。它涉及评估后肢外观,水肿,机械/热过敏性,和急性角质行为,以回应辣椒素注射。
肢体缺血/再灌注是导致CRPS-I在人类患者12的常见因素。该协议描述了如何建立大鼠CPIP模型,这是一个常用的动物模型来概括人类CRPS-I6。在麻醉下,在大鼠的后肢诱导了缺血,在麻醉下用紧的O环在脚踝上涂了3小时。O 型环已移除,并发生重新灌注。模型建立后,CPIP模型大鼠在后肢出现早期高血症和水肿。该模型还显示神经病痛行为,包括持续的机械/热过敏。这些症状都模仿人类CRPS-I 21的典型特征。
CRPS患者表现出明显增加的反应,在受影响的四肢的辣椒素引起的疼痛20。然而,目前还不清楚CPIP模型动物是否表现出类似的反应。因此,在这项研究中,对CPIP大鼠的角性行为进行了检查,以响应将辣椒素注射到叶侧后爪中。结果发现,与假大鼠相比,CPIP模型大鼠对辣椒素注射的角性反应明显较高。据我们所知,这是CPIP模型大鼠首次报告这种现象。
在以前的研究中,TRPV1通道表达被证明在叶侧后爪组织和DRG神经元中向上调节,这些神经元对后爪12进行内侧分析。此外,还发现脊髓胶质细胞在CPIP模型大鼠中被激活,导致中央疼痛敏感和疼痛感知和传递9,12。因此,在CPIP模型大鼠中,对辣椒素注射的增角性行为可能同时涉及外周和中枢疼痛敏化。未来的研究是必要的,以测试辣椒素注射是否导致增强反应的逆后爪的CPIP模型大鼠,以及。在这里进行的测试中,我们没有观察到CPIP模型大鼠的自切除术。这与经过坐骨切片的老鼠形成对比,它们除了慢性疼痛过度敏感性22、23外,通常还发展为自体切除术。此外,CRPS-I患者或CPIP模式动物没有转诊疼痛反应报告。
模型中的关键步骤之一是在整个过程中保持麻醉。在这项研究中,麻醉是由苯巴比妥钠(50毫克/千克)的腹内注射引起的。这种剂量经常用于许多涉及大鼠麻醉的研究,包括与CPIP大鼠模型建立9,12,24的研究。此外,麻醉应通过20毫克/千克/小时(i.p.)苯巴比妥钠在必要时保持,以保证成功实施程序12,24。
在Coderre等人建立的初始CPIP模型中,当后爪尽可能地放入注射器的桶中时,O-ring实际上从3厘米3注射器的外侧滑落(切成两半)。在这里,在我们的研究中,我们对此方法做了一些小的修改。我们使用1.5 mL Eppendorf管(事先切断卡帽),而不是注射器,因为这种材料更容易接近,正好适合大鼠后爪的直径。O 型环可以很方便地放置在大鼠的脚踝部分,这种经过修改的方法无需受伤,便于建立模型。
目前,CPIP大鼠模型完全建立在雄鼠的基础上,包括我们目前的研究25。然而,应该指出,根据流行病学分析26、27,女性CRPS-I的发病率比男性患者更频繁。这进一步支持了发现,女性动物表现出更多的疼痛反应比雄性动物,当CPIP成立28。因此,今后有必要在雄性动物和雌性动物中建立CPIP模型。这对研究该模型的转化意义具有重要意义。
最后,这里介绍了建立大鼠CPIP模型的方法。该CPIP大鼠模型概括了人类CRPS-I的许多临床特征,其性质可使其成为研究CRPS-I的合适动物模型。
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Disclosures
作者声明在这项工作中没有利益冲突。
Acknowledgments
该项目由中国国家自然科学基金(81873365和81603676)、浙江省杰出青年自然科学基金(LR17H270001)和浙江中医药大学()资助。Q2019J01, 2018ZY37, 2018ZY19).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 ml Eppendorf tube | Eppendorf | 22431021 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D1435 | |
Capsaicin | APEXBIO | A3278 | |
Digital caliper | Meinaite | NA | |
O-ring | O-Rings West | Nitrile 70 Durometer | 7/32 in. internal diameter |
Plantar Test Apparatus | UGO Basile, Italy | 37370 | |
von Frey filaments | UGO Basile, Italy | NC12775 |
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