Summary

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

Published: January 18, 2020
doi:

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

Abstract

בבידול חוץ גופית של תאי גזע האדם העובריים (hESCs) הפכה את היכולת ללמוד התפתחות אנושית על רמות ביולוגיות ומולקולרי וסיפק תאים לשימוש ביישומים משובי. גישות סטנדרטיות עבור תרבות hESC באמצעות תרבות סוג המושבה כדי לשמור על מובחן hESCs ו embryoid הגוף (EB) ו שושנת היווצרות עבור בידול לתוך שכבות נבט שונות הם יעילים זמן רב. המוצג כאן הוא שיטת תרבות חד-תאית באמצעות hESCs במקום תרבות מסוג מושבה. שיטה זו מאפשרת תחזוקה של התכונות האופייניות של hESCs מובחן, כולל ביטוי של סמנים hESC ברמות הדומות לסוג המושבה hESCs. בנוסף, הפרוטוקול מציג שיטה יעילה תא מחולל קדמון (NPC) הדור מסוג תא יחיד hESCs המייצרת NPCs בתוך שבוע 1. תאים אלה מאוד לבטא מספר הגנים NPC סמן והוא יכול להבדיל לתוך סוגים שונים של תאים עצביים, כולל נוירונים ומיאסטאלוגיים ו astrocytes. זו מערכת התרבות היחידה עבור hESCs יהיה שימושי בחקירת מנגנונים מולקולריים של תהליכים אלה, מחקרים של מחלות מסוימות, מסכי גילוי סמים.

Introduction

האדם תאים גזע עובריים (hESCs) יש את הפוטנציאל להבדיל לתוך שלוש שכבות הנבט הראשי, אשר לאחר מכן להבדיל לתוך שונים מרובי עוצמה מחולל שורה של תאים. לאחר שנים אלה מעניקים את כל סוגי התאים בגוף האדם. ב מערכות התרבות hESC הפכה את היכולת ללמוד פיתוח עובריים האדם שימשו ככלי רב ערך לקבלת תובנות חדשות לגבי איך תהליכים אלה מוסדרים ברמות הביולוגי והמולקולרי. באופן דומה, מחקרים של תאי גזע פלוריטי המושרה (iPSCs) שנוצרו מתאים סומלי מחדש מבודדים מחולים אנושיים לספק תובנות הרומן לתוך מחלות שונות. בנוסף, התאים מחולל והבדיל שנגזר מ hESCs יכול להיות שימושי עבור מחקר מעורבים טיפול בתאי גזע והקרנת סמים1,2,3,4.

hESCs יכול להיות המושרה להבדיל לתוך תאים מחולל קדמון (NPCs), שהם תאים פוטנציאליים רב עם קיבולת עצמית לחידוש עצמי. לאחר מכן, תאים אלה יכולים להיות מובחנים לנוירונים, astrocytes, ו oligodendrocytes הפוך5,6. NPCs מציעים גם מערכת סלולרית ללימודי חוץ גופית של ביולוגיה נוירו-התפתחותית ומחלות נוירולוגיות שונות. עם זאת, המושבה הנוכחית סוג שיטות תרבות מעורבים hESCs והבידול שלהם לתוך npcs הם יעילים ולעתים קרובות כרוכים התרבות, כמו גם embryoid הגוף (EB) ו שושנת המערך5,7,8,9. פרוטוקולים אלה מציגים שיעורי הישרדות נמוכים יותר והבחנה ספונטנית והיא צורכת זמן רב יותר.

מוצג כאן היא מערכת תרבותית משופרת ואיתנה, כי הוא מדרגי בקלות ומשתמש בצפיפות גבוהה תא בודד התרבות סוג של hESCs10. הכללת roh-קינאז (רוק) מעכב תרמו באופן משמעותי יעילות ההישרדות במהלך התרבות סוג תא יחיד של hesc10,11,12,13,14. במערכת זו של התרבות, hESCs ניתן לשמור ולהרחיב בקלות. בנוסף, הפרוטוקול מציג שיטה יעילה להפקת npcs מתרבות סוג תא בודד של hESCs, אשר מאפשר את הייצור של npcs טהור מאוד. עיכוב של BMP/TGFβ/פעילות מסלולים איתות עם מעכבי האלק ביעילות לגרום בידול של תא יחיד סוג hESCs לתוך npcs15,16, אשר לאחר מכן יכול להיות המושרה להבדיל לתוך שורה עצבית תפקודית, כגון נוירונים מתוגיים ו astrocytes.

לסיכום, פרוטוקול התרבות סוג תא בודד באמצעות hESCs מציע מודל אטרקטיבי ללמוד את הבידול של תאים אלה לתוך הגילאים שונים, כולל NPCs. פרוטוקול זה הוא מדרגי בקלות ולכן מתאים ליצירת תאים למחקר מעורבים טיפול משובי והקרנת סמים.

Protocol

1. הכנת ממברדת מרתף מוסמכת-צלחות מצופות הפשרת לאט את מטריצת קרום המרתף של hESC-מוסמך (ראה טבלת חומרים) ב -4 ° c עבור לפחות 2 – 3 h או לילה כדי למנוע היווצרות של ג’ל. כדי להכין ממברדת מרתפים לוחות מצופים, לדלל את המטריצה ב-DMEM קר/F12 2% הריכוז הסופי. מערבבים היטב ומעילים כל באר של 6 היט?…

Representative Results

מוצג כאן הוא פרוטוקול משופר עבור תחזוקה והתרחבות של תרבות אחת סוג תא של hESCs והבידול יעיל שלהם לתוך תאים מחולל קדמון, אשר מבדיל לאחר מכן לתוך שונים במורד הזרם העצבי, כולל נוירונים. תמונות חדות שלב מייצגים מציגות מורפולוגיה של תאים בשלבים שונים במהלך ההסתגלות של סוג המושבה hESCs …

Discussion

שיטות מדרגי ויעיל עבור הבידול של hESCs לתוך ליננים שונים והדור של מספר מספיק של תאים הבדיל הם קריטריונים חשובים לסינון סמים וטיפול בתאי גזע. שונים של תא יחיד שיטות העברת פורסמו, שבו התאים הם מתורבתים בנוכחות של מעכב סלע או מולקולות קטנות אחרות כדי לשפר את ההישרדות, אבל המוצרים הסופיים של שיטו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד ר קארל ד. בורטנר על עזרתו בניתוח ה-FACS. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של המכון הלאומי למדעי הסביבה, המוסדות הלאומיים לבריאות, Z01-ES-101585 ל AMJ.

Materials

35 mm m-dishes ibidi 81156 Cell culture dish
6-well plates Corning 3516
Accutase Innovative Cell Technologies AT104-500 Cell detachment solution
Activin A R&D system 338-AC-050
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4403
B27 supplement Thermo Fisher 17504044
B27 supplement (-Vit A) Thermo Fisher 12587010
BDNF Applied Biological Materials Z100065
bFGF Peprotech 100-18C
Centrifuge DAMON/ICE 428-6759
CO2 incubator Thermo Fisher 4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) Corning 354277 Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)
Cryostor CS 10 Stemcell Technologies 7930 Cell freezing solution
Dispase Stemcell Technologies 7923
DMEM Thermo Fisher 10569-010
DMEM/F12 Thermo Fisher 10565-018
Dorsomorphin Tocris 3093
EGF Peprotech AF-100-16A
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3007003HI
FGF8 Applied Biological Materials Z101705
GDNF Applied Biological Materials Z101057
Geltrex matrix Thermo Fisher A1569601 Basement membrane matrix
GlutaMax Thermo Fisher 35050061 Glutamine supplement, 100X
H9 (WA09) human embryonic stem cell line WiCell WA09
Heregulin b-1 Peprotech 100-3
IGF Peprotech 100-11
Knockout DMEM Thermo Fisher 10829018
Knockout Serum Replacement Thermo Fisher 10828028
Laminin Sigma Aldrich L2020
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850 hESC culture medium
N2 supplement Thermo Fisher 17502001
NEAA Thermo Fisher 11140050
Neurobasal Thermo Fisher 21103049
Poly-L-ornithine Sigma Aldrich P3655
ROCK inhibitor Tocris 1254
SB431542 Tocris 1614
SHH Applied Biological Materials Z200617
Stemdiff Neural Progenitor medium Stemcell Technologies 5833 NPC expansion medium

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
  3. Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
  4. Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
  5. Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
  6. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  7. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).
  10. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
  11. Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
  12. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
  13. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  14. Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
  17. Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
  18. Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
  19. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  20. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
  21. Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
  22. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
  23. Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
  24. Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
  25. Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
  26. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).

Play Video

Cite This Article
Jeon, K., Park, K., Jetten, A. M. Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (155), e60571, doi:10.3791/60571 (2020).

View Video