Summary

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

Published: January 18, 2020
doi:

Summary

Burada sunulan insan embriyonik kök hücrelerinin tek hücreli kültür ve nöral progenitor hücrelere sonraki farklılaşma için bir protokoldür. Protokol basit, sağlam, ölçeklenebilir ve ilaç tarama ve rejeneratif tıp uygulamaları için uygundur.

Abstract

İnsan embriyonik kök hücrelerinin (HESC’ ler) in vitro farklılaşması, insan gelişimini hem biyolojik hem de moleküler düzeylerde inceleme yeteneğini dönüştürmüş ve rejeneratif uygulamalarda kullanılmak üzere hücreler sağlamıştır. Farklılaşmamış hESC’leri ve embriyoid gövdeyi (EB) korumak için koloni tipi kültürünü kullanan hESC kültürü için standart yaklaşımlar ve farklı mikrop katmanlarına farklılaşma için rozet oluşumu verimsiz ve zaman alıcıdır. Burada sunulan bir koloni tipi kültür yerine hESCs kullanarak tek hücreli bir kültür yöntemidir. Bu yöntem, koloni tipi hESC’lere benzer düzeylerde hESC belirteçlerinin ekspresyonu da dahil olmak üzere, farklılaşmamış hESC’lerin karakteristik özelliklerinin sürdürülmesini sağlar. Buna ek olarak, protokol 1 hafta içinde NPC’ler üreten tek hücreli tip hESC’lerden nöral progenitor hücre (NPC) üretimi için etkili bir yöntem sunar. Bu hücreler son derece çeşitli NPC marker genleri ifade ve çeşitli nöral hücre tipleri ayırt edebilirsiniz, dopaminerjik nöronlar ve astrositler de dahil olmak üzere. HSS’ler için bu tek hücreli kültür sistemi, bu süreçlerin moleküler mekanizmalarının, bazı hastalıkların çalışmalarının ve ilaç keşif ekranlarının araştırılmasında yararlı olacaktır.

Introduction

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) daha sonra çeşitli çok güçlü progenitor hücre soyları ayırt üç birincil mikrop katmanları, ayırt etme potansiyeline sahip. Bu soylar daha sonra insan vücudunda tüm hücre tipleri neden. In vitro hESC kültür sistemleri insan embriyonik gelişimini inceleme yeteneğini dönüştürmüş ve bu süreçlerin biyolojik ve moleküler düzeyde nasıl düzenlendiğine dair yeni bilgiler edinmek için değerli bir araç olarak hizmet vermiştir. Benzer şekilde, insan hastalardan izole edilen somatik hücrelerin yeniden programlanmasından elde edilen indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) çalışmaları çeşitli hastalıklar hakkında yeni bilgiler sağlamaktadır. Buna ek olarak, atave ve hESCtt türetilen farklılaşmış hücreler kök hücre tedavisi ve ilaç tarama içeren araştırma için yararlı olabilir1,2,3,4.

hESC’ler, geniş bir kendini yenileme kapasitesine sahip çok potansiyelli hücreler olan nöral progenitor hücrelere (NPC) farklılaşmak için indüklenebilir. Daha sonra, bu hücreler nöronlar, astrositler ve oligodendrocytes5,6içine ayırt edilebilir. NDC’ler ayrıca nörogelişimsel biyoloji ve çeşitli nörolojik hastalıkların in vitro çalışmaları için bir hücresel sistem sunuyoruz. Ancak, hESCs ve NPCs içine farklılaşma içeren mevcut koloni tipi kültür yöntemleri verimsiz ve genellikle coculture yanı sıra embriyoid vücut (EB) ve rozet oluşumu5,7,8,9içerir. Bu protokoller daha düşük sağkalım oranları ve spontan farklılaşma sergiler ve daha fazla zaman alır.

Burada sunulan kolayca ölçeklenebilir ve hESCs10yüksek yoğunluklu tek hücreli türü kültür kullanan gelişmiş ve sağlam bir kültür sistemidir. Roh-kigaz (ROCK) inhibitörü dahil hESC10,11,12,13,14tek hücre tipi kültür sırasında önemli ölçüde geliştirilmiş sağkalım verimliliği katkıda bulunmuştur. Bu kültür sisteminde, HESC’ler kolayca korunabilir ve genişletilebilir. Buna ek olarak, protokol hESC’lerin tek hücreli tip kültüründen NCD oluşturmak için etkili bir yöntem sunar, son derece saf NPCs üretimine olanak sağlar. ALK inhibitörleri ile BMP / TGFβ / aktivin sinyal yollarının inhibisyonu verimli npcs içine tek hücreli tip hESCs farklılaşmasıneden15,16, daha sonra dopaminerjik nöronlar ve astrositler gibi fonksiyonel nöral soyları, ayırt etmek için indüklenebilir.

Özetle, hESC’ler kullanarak tek hücreli tip kültür protokolü, bu hücrelerin NP’ler de dahil olmak üzere çeşitli soylara farklılaşmasını incelemek için cazip bir model sunar. Bu protokol kolayca ölçeklenebilir ve bu nedenle rejeneratif tedavi ve ilaç tarama içeren araştırma için hücre oluşturmak için uygundur.

Protocol

1. HESC nitelikli Bodrum Membran Matris Kaplı Plakaların Hazırlanması Bir jel oluşumunu önlemek için hESC nitelikli bazal membran matrisini (Bkz. Malzeme Tablosu)çözeltisini en az 2-3 saat veya bir gecede 4 °C’de yavaşça eritin. Bodrum membran matris kaplı plakalar hazırlamak için, soğuk DMEM/F12’de seyreltik matris %2 nihai konsantrasyona kadar. İyi bir şekilde karıştırın ve seyreltilmiş matris çözeltisinin 1 mL’si ile 6 kuyulu bir plakanın her kuyusunu kapl…

Representative Results

Burada sunulan bakım ve hESC’lerin tek hücreli tip kültürünün genişletilmesi ve nöral progenitor hücrelere verimli farklılaşma için geliştirilmiş bir protokol, daha sonra çeşitli downstream nöral soylar halinde ayırt, dopaminerjik nöronlar ve astrositler de dahil olmak üzere. Temsili faz kontrast görüntüleri, koloni tipi hESC’lerin tek hücreli tip kültüre uyarlaması sırasında hücre morfolojisini farklı basamaklarda göstermektedir(Şekil 1</s…

Discussion

HSK’ların çeşitli soylara farklılaşması ve yeterli sayıda farklılaştırılmış hücre nin üretilmesi için ölçeklenebilir ve etkili yöntemler ilaç taraması ve kök hücre tedavisi için önemli kriterlerdir. Çeşitli tek hücreli geçiş yöntemleri, hangi hücrelerin ROCK inhibitörü veya diğer küçük moleküllerin varlığında hayatta kalmayı artırmak için kültürlü, ancak bu kültür yöntemlerinin son ürünleri koloni tipi hESCs17,18</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Carl D. Bortner’e (NIEHS) FACS analizine yaptığı yardımlar için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Z01-ES-101585 ve AMJ’nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Materials

35 mm m-dishes ibidi 81156 Cell culture dish
6-well plates Corning 3516
Accutase Innovative Cell Technologies AT104-500 Cell detachment solution
Activin A R&D system 338-AC-050
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4403
B27 supplement Thermo Fisher 17504044
B27 supplement (-Vit A) Thermo Fisher 12587010
BDNF Applied Biological Materials Z100065
bFGF Peprotech 100-18C
Centrifuge DAMON/ICE 428-6759
CO2 incubator Thermo Fisher 4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) Corning 354277 Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)
Cryostor CS 10 Stemcell Technologies 7930 Cell freezing solution
Dispase Stemcell Technologies 7923
DMEM Thermo Fisher 10569-010
DMEM/F12 Thermo Fisher 10565-018
Dorsomorphin Tocris 3093
EGF Peprotech AF-100-16A
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3007003HI
FGF8 Applied Biological Materials Z101705
GDNF Applied Biological Materials Z101057
Geltrex matrix Thermo Fisher A1569601 Basement membrane matrix
GlutaMax Thermo Fisher 35050061 Glutamine supplement, 100X
H9 (WA09) human embryonic stem cell line WiCell WA09
Heregulin b-1 Peprotech 100-3
IGF Peprotech 100-11
Knockout DMEM Thermo Fisher 10829018
Knockout Serum Replacement Thermo Fisher 10828028
Laminin Sigma Aldrich L2020
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850 hESC culture medium
N2 supplement Thermo Fisher 17502001
NEAA Thermo Fisher 11140050
Neurobasal Thermo Fisher 21103049
Poly-L-ornithine Sigma Aldrich P3655
ROCK inhibitor Tocris 1254
SB431542 Tocris 1614
SHH Applied Biological Materials Z200617
Stemdiff Neural Progenitor medium Stemcell Technologies 5833 NPC expansion medium

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
  3. Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
  4. Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
  5. Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
  6. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  7. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).
  10. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
  11. Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
  12. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
  13. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  14. Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
  17. Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
  18. Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
  19. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  20. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
  21. Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
  22. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
  23. Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
  24. Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
  25. Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
  26. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).

Play Video

Cite This Article
Jeon, K., Park, K., Jetten, A. M. Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (155), e60571, doi:10.3791/60571 (2020).

View Video