Summary

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Published: January 18, 2020
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Summary

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Abstract

A diferenciação in vitro das células-tronco embrionárias humanas (hESCs) transformou a capacidade de estudar o desenvolvimento humano em níveis biológicos e moleculares e forneceu células para uso em aplicações regenerativas. Abordagens padrão para a cultura hESC usando cultura do tipo colônia para manter hESCs indiferenciados e corpo embrionário (EB) e formação de roseta para diferenciação em diferentes camadas germinais são ineficientes e demorados. Apresentado aqui é um método de cultura unicelular usando hESCs em vez de uma cultura do tipo colônia. Este método permite a manutenção das características de hESCs indiferenciados, incluindo a expressão de marcadores hESC em níveis comparáveis aos hESCs tipo colônia. Além disso, o protocolo apresenta um método eficiente para a geração de células progenitoras neurais (NPC) de hESCs do tipo unicelular que produz NPCs dentro de 1 semana. Estas células expressam altamente vários genes marcador NPC e pode se diferenciar em vários tipos de células neurais, incluindo neurônios dopaminérgicos e astrócitos. Este sistema de cultura unicelular para hESCs será útil na investigação dos mecanismos moleculares desses processos, estudos de certas doenças e telas de descoberta de medicamentos.

Introduction

As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm o potencial de se diferenciar em três camadas germinais primárias, que se diferenciam em várias linhagens celulares progenitoras multipotentes. Estas linhagens posteriormente dão origem a todos os tipos de células do corpo humano. Os sistemas de cultura in vitro hESC transformaram a capacidade de estudar o desenvolvimento embrionário humano e serviram como uma ferramenta valiosa para obter novos insights sobre como esses processos são regulados nos níveis biológico e molecular. Da mesma forma, estudos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) gerados a partir da reprogramação de células somáticas isoladas de pacientes humanos fornecem novos insights sobre várias doenças. Além disso, progenitor e células diferenciadas derivadas de hESCs podem ser úteis para pesquisas envolvendo terapia com células-tronco e triagem de medicamentos1,2,3,4.

hESCs podem ser induzidos a se diferenciar em células progenitoras neurais (NPCs), que são células multipotenciais com uma extensa capacidade de auto-renovação. Posteriormente, essas células podem ser diferenciadas em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos5,6. Npcs também oferecem um sistema celular para estudos in vitro de biologia do neurodesenvolvimento e várias doenças neurológicas. No entanto, os métodos atuais de cultura do tipo colônia envolvendo hESCs e sua diferenciação em NPCs são ineficientes e muitas vezes envolvem cocultura, bem como o corpo embrionário (EB) e formação de rosetas5,7,8,9. Esses protocolos apresentam menores taxas de sobrevida e diferenciação espontânea e são mais demorados.

Apresentado aqui é um sistema de cultura melhorado e robusto que é facilmente escalável e usa cultura de alta densidade tipo unicelular de hESCs10. A inclusão do inibidor roh-kinase (ROCK) contribuiu para aumentar significativamente a eficiência de sobrevivência durante a cultura do tipo unicelular do hESC10,11,12,13,14. Neste sistema de cultura, hESCs podem ser facilmente mantidos e expandidos. Além disso, o protocolo apresenta um método eficiente para gerar NPCs a partir da cultura do tipo unicelular de hESCs, que permite a produção de NPCs altamente puros. Inibição de BMP/TGFβ/activin sinalização vias com inibidores alk eficientemente induzir diferenciação de hESCs tipo unicelular em NPCs15,16, que então pode ser induzido a se diferenciar em linhagens neurais funcionais, tais como neurônios dopaminérgicos e astúcias.

Em resumo, o protocolo de cultura do tipo unicelular usando hESCs oferece um modelo atraente para estudar a diferenciação dessas células em várias linhagens, incluindo NPCs. Este protocolo é facilmente escalável e, portanto, adequado para a geração de células para pesquisas envolvendo terapia regenerativa e triagem de medicamentos.

Protocol

1. Preparação de placas revestidas de matriz de membrana de porão qualificadas por hESC Descongele lentamente a matriz de membrana de porão qualificada ao hESC (ver Tabela de Materiais)solução em 4 °C por pelo menos 2-3 h ou durante a noite para evitar a formação de um gel. Para preparar placas revestidas de matriz de membrana de porão, diluir matriz em DMEM/F12 a frio para uma concentração final de 2%. Misture bem e cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL da so…

Representative Results

Apresentado aqui é um protocolo melhorado para a manutenção e expansão da cultura do tipo unicelular de hESCs e sua diferenciação eficiente em células progenitoras neurais, que posteriormente se diferencia em várias linhagens neurais a jusante, incluindo neurônios dopaminérgicos e astrócitos. Imagens representativas de contraste de fase mostram morfologia celular em diferentes etapas durante a adaptação de hESCs tipo colônia para a cultura do tipounicelular</…

Discussion

Métodos escaláveis e eficientes para a diferenciação de hESCs em várias linhagens e a geração de número suficiente de células diferenciadas são critérios importantes para o rastreamento de medicamentos e terapia com células-tronco. Vários métodos de passagem de células únicas foram publicados, nos quais as células são cultivadas na presença de inibidor de ROCHA ou outras pequenas moléculas para melhorar a sobrevivência, mas os produtos finais desses métodos de cultura são os hESCs tipo colônia<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) por sua ajuda na análise facs. Esta pesquisa contou com o apoio do Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental, dos Institutos Nacionais de Saúde, Z01-ES-101585 à AMJ.

Materials

35 mm m-dishes ibidi 81156 Cell culture dish
6-well plates Corning 3516
Accutase Innovative Cell Technologies AT104-500 Cell detachment solution
Activin A R&D system 338-AC-050
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4403
B27 supplement Thermo Fisher 17504044
B27 supplement (-Vit A) Thermo Fisher 12587010
BDNF Applied Biological Materials Z100065
bFGF Peprotech 100-18C
Centrifuge DAMON/ICE 428-6759
CO2 incubator Thermo Fisher 4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) Corning 354277 Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)
Cryostor CS 10 Stemcell Technologies 7930 Cell freezing solution
Dispase Stemcell Technologies 7923
DMEM Thermo Fisher 10569-010
DMEM/F12 Thermo Fisher 10565-018
Dorsomorphin Tocris 3093
EGF Peprotech AF-100-16A
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3007003HI
FGF8 Applied Biological Materials Z101705
GDNF Applied Biological Materials Z101057
Geltrex matrix Thermo Fisher A1569601 Basement membrane matrix
GlutaMax Thermo Fisher 35050061 Glutamine supplement, 100X
H9 (WA09) human embryonic stem cell line WiCell WA09
Heregulin b-1 Peprotech 100-3
IGF Peprotech 100-11
Knockout DMEM Thermo Fisher 10829018
Knockout Serum Replacement Thermo Fisher 10828028
Laminin Sigma Aldrich L2020
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850 hESC culture medium
N2 supplement Thermo Fisher 17502001
NEAA Thermo Fisher 11140050
Neurobasal Thermo Fisher 21103049
Poly-L-ornithine Sigma Aldrich P3655
ROCK inhibitor Tocris 1254
SB431542 Tocris 1614
SHH Applied Biological Materials Z200617
Stemdiff Neural Progenitor medium Stemcell Technologies 5833 NPC expansion medium

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Cite This Article
Jeon, K., Park, K., Jetten, A. M. Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (155), e60571, doi:10.3791/60571 (2020).

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