Summary

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

Published: January 18, 2020
doi:

Summary

Aquí se presenta un protocolo para la generación de un cultivo de una sola célula de células madre embrionarias humanas y su posterior diferenciación en células progenitoras neuronales. El protocolo es simple, robusto, escalable y adecuado para aplicaciones de detección de drogas y medicina regenerativa.

Abstract

La diferenciación in vitro de células madre embrionarias humanas (HESC) ha transformado la capacidad de estudiar el desarrollo humano a nivel biológico y molecular y ha proporcionado células para su uso en aplicaciones regenerativas. Los enfoques estándar para el cultivo de hESC utilizando el cultivo de tipo colonia para mantener los hESC indiferenciados y la formación de rosetas y cuerpo embrionario (EB) para la diferenciación en diferentes capas germinales son ineficientes y consumen mucho tiempo. Aquí se presenta un método de cultivo de una sola célula que utiliza hESC en lugar de una referencia cultural de tipo colonia. Este método permite el mantenimiento de las características características de los hESC indiferenciados, incluida la expresión de marcadores hESC a niveles comparables a los hESC de tipo colonia. Además, el protocolo presenta un método eficaz para la generación de células progenitoras neuronales (NPC) a partir de hESC de tipo de una sola célula que produce NPC dentro de 1 semana. Estas células expresan altamente varios genes marcadores NPC y pueden diferenciarse en varios tipos de células neurales, incluyendo neuronas dopaminérgicas y astrocitos. Este sistema de cultivo de una sola célula para hESCs será útil para investigar los mecanismos moleculares de estos procesos, estudios de ciertas enfermedades y pantallas de descubrimiento de fármacos.

Introduction

Las células madre embrionarias humanas (HESC) tienen el potencial de diferenciarse en las tres capas primarias de gérmenes, que luego se diferencian en varios linajes de células progenitoras multipotentes. Estos linajes posteriormente dan lugar a todos los tipos de células en el cuerpo humano. Los sistemas de cultivo hESC in vitro han transformado la capacidad de estudiar el desarrollo embrionario humano y han servido como una valiosa herramienta para obtener nuevos conocimientos sobre cómo estos procesos se regulan a nivel biológico y molecular. Del mismo modo, los estudios de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) generadas a partir de la reprogramación de células somáticas aisladas de pacientes humanos proporcionan nuevos conocimientos sobre diversas enfermedades. Además, el progenitor y las células diferenciadas derivadas de los HEC pueden ser útiles para la investigación que involucra terapia con células madre y detección de drogas1,2,3,4.

Los hESC se pueden inducir a diferenciarse en células progenitoras neuronales (NCC), que son células multipotenciales con una amplia capacidad de autorenovación. Posteriormente, estas células se pueden diferenciar en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos5,6. Los PNJ también ofrecen un sistema celular para estudios in vitro de biología del neurodesarrollo y diversas enfermedades neurológicas. Sin embargo, los métodos actuales de cultivo de tipo colonia que implican heSC y su diferenciación en NNP son ineficientes y a menudo implican cocultivo, así como formación de cuerpo embrionario (EB) y formación de rosetas5,7,8,9. Estos protocolos presentan tasas de supervivencia más bajas y diferenciación espontánea y consumen más tiempo.

Aquí se presenta un sistema de cultivo mejorado y robusto que es fácilmente escalable y utiliza el cultivo de tipo de una sola célula de alta densidad de hESCs10. La inclusión del inhibidor de la roh-quinasa (ROCK) contribuyó a mejorar significativamente la eficiencia de supervivencia durante el cultivo de tipo de célula única de hESC10,11,12,13,14. En este sistema de cultivo, los hESC se pueden mantener y ampliar fácilmente. Además, el protocolo presenta un método eficiente para generar PNJ a partir del cultivo de tipo de una sola célula de hESC, lo que permite la producción de PNJ altamente puros.

En resumen, el protocolo de cultivo de tipo de una sola célula que utiliza hESCs ofrece un modelo atractivo para estudiar la diferenciación de estas células en varios linajes, incluidos los PNJ. Este protocolo es fácilmente escalable y por lo tanto adecuado para generar células para la investigación que involucra terapia regenerativa y cribado de drogas.

Protocol

1. Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana de sótano calificadas por hESC Descongelar lentamente la matriz de membrana de sótano calificada por hESC (ver Tabla de Materiales)solución a 4 oC durante al menos 2-3 h o durante la noche para evitar la formación de un gel. Para preparar placas recubiertas con matriz de membrana de sótano, diluya la matriz en frío DMEM/F12 a una concentración final del 2%. Mezclar bien y cubrir cada pocal de una placa de 6 pocillos co…

Representative Results

Aquí se presenta un protocolo mejorado para el mantenimiento y la expansión del cultivo de tipo de una sola célula de hESC y su diferenciación eficiente en células progenitoras neuronales, que posteriormente se diferencia en varios linajes neuronales aguas abajo, incluyendo neuronas dopaminérgicas y astrocitos. Las imágenes representativas de contraste de fase muestran la morfología celular en diferentes pasos durante la adaptación de los hESC de tipo colonia al cultivo de tipo de una…

Discussion

Los métodos escalables y eficientes para la diferenciación de los HEC en varios linajes y la generación de un número suficiente de células diferenciadas son criterios importantes para la detección de fármacos y la terapia con células madre. Se han publicado varios métodos de paso de una sola célula, en los que las células se cultivan en presencia de inhibidores de LA NAdo u otras moléculas pequeñas para mejorar la supervivencia, pero los productos finales de estos métodos de cultivo son los hESC de tipo col…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) por su asistencia con el análisis FACS. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, los Institutos Nacionales de Salud, Z01-ES-101585 a AMJ.

Materials

35 mm m-dishes ibidi 81156 Cell culture dish
6-well plates Corning 3516
Accutase Innovative Cell Technologies AT104-500 Cell detachment solution
Activin A R&D system 338-AC-050
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4403
B27 supplement Thermo Fisher 17504044
B27 supplement (-Vit A) Thermo Fisher 12587010
BDNF Applied Biological Materials Z100065
bFGF Peprotech 100-18C
Centrifuge DAMON/ICE 428-6759
CO2 incubator Thermo Fisher 4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) Corning 354277 Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)
Cryostor CS 10 Stemcell Technologies 7930 Cell freezing solution
Dispase Stemcell Technologies 7923
DMEM Thermo Fisher 10569-010
DMEM/F12 Thermo Fisher 10565-018
Dorsomorphin Tocris 3093
EGF Peprotech AF-100-16A
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3007003HI
FGF8 Applied Biological Materials Z101705
GDNF Applied Biological Materials Z101057
Geltrex matrix Thermo Fisher A1569601 Basement membrane matrix
GlutaMax Thermo Fisher 35050061 Glutamine supplement, 100X
H9 (WA09) human embryonic stem cell line WiCell WA09
Heregulin b-1 Peprotech 100-3
IGF Peprotech 100-11
Knockout DMEM Thermo Fisher 10829018
Knockout Serum Replacement Thermo Fisher 10828028
Laminin Sigma Aldrich L2020
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850 hESC culture medium
N2 supplement Thermo Fisher 17502001
NEAA Thermo Fisher 11140050
Neurobasal Thermo Fisher 21103049
Poly-L-ornithine Sigma Aldrich P3655
ROCK inhibitor Tocris 1254
SB431542 Tocris 1614
SHH Applied Biological Materials Z200617
Stemdiff Neural Progenitor medium Stemcell Technologies 5833 NPC expansion medium

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Cite This Article
Jeon, K., Park, K., Jetten, A. M. Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (155), e60571, doi:10.3791/60571 (2020).

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