Här presenteras ett protokoll för generering av en encellig kultur av mänskliga embryonala stamceller och deras efterföljande differentiering till neurala stamcells celler. Protokollet är enkelt, robust, skalbar och lämplig för läkemedels screening och regenerativ medicin applikationer.
In vitro differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har förändrat förmågan att studera mänsklig utveckling på både biologiska och molekylära nivåer och som celler för användning i regenerativa tillämpningar. Standard metoder för hESC kultur med hjälp av kolonin typ kultur för att bibehålla odifferentierade hESCs och embryoid kropp (EB) och rosett formation för differentiering i olika köns lagren är ineffektiva och tidskrävande. Här presenteras en encellig kultur metod med hjälp av hESCs istället för en koloni-typ kultur. Denna metod möjliggör underhåll av de karakteristiska dragen i odifferentierade hESCs, inklusive uttryck av hESC markörer på nivåer jämförbara med kolonin typ hESCs. Dessutom, protokollet presenterar en effektiv metod för neurala progenitorceller (NPC) generation från Single-celltyp hESCs som producerar NPC inom 1 vecka. Dessa celler uttrycker högt flera NPC markörgener och kan differentiera till olika neurala celltyper, inklusive dopaminerga neuroner och astrocyter. Detta encellig kultur system för hESCs kommer att vara användbart för att undersöka de molekylära mekanismerna i dessa processer, studier av vissa sjukdomar, och Drug discovery skärmar.
Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har potential att differentiera till de tre primära bakterie lagren, som sedan differentieras till olika multipotenta stamcellslinjer. Dessa härstamningar ger därefter upphov till alla celltyper i människokroppen. In vitro har hESC kultur system förändrat förmågan att studera mänsklig embryonal utveckling och har fungerat som ett värdefullt verktyg för att få nya insikter i hur dessa processer regleras på biologisk och molekylär nivå. På samma sätt ger studier av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) som genereras från omprogrammering av somatiska celler isolerade från mänskliga patienter nya insikter i olika sjukdomar. Dessutom kan stamceller och differentierade celler som härrör från hESCs vara användbara för forskning som involverar stamcellsterapi och läkemedels screening1,2,3,4.
hESCs kan induceras för att differentiera till neurala progenitorceller (NPCs), som är multipotentialceller med en omfattande självförnyelse kapacitet. Därefter kan dessa celler differentieras till nervceller, astrocyter, och oligodendrocyter5,6. NPCs erbjuder också ett cellsystem för in vitro-studier av neuroutvecklingsbiologi och olika neurologiska sjukdomar. Men nuvarande koloni typ kultur metoder som involverar hESCs och deras differentiering i NPC är ineffektiva och ofta involverar samodling samt embryoid kropp (EB) och rosett formation5,7,8,9. Dessa protokoll uppvisar lägre överlevnadsgrad och spontan differentiering och är mer tidskrävande.
Presenteras här är ett förbättrat och robust kultur system som är lätt skalbar och använder hög densitet Single-celltyp kultur av hESCs10. Införandet av Roh-Kinas (Rock) hämmare bidragit till signifikant ökad överlevnad effektivitet under Single celltyp kultur av hESC10,11,12,13,14. I detta kultur system kan hESCs lätt underhållas och utökas. Dessutom utgör protokollet en effektiv metod för att skapa NPC-er från encellig typ kultur av hESCs, som gör det möjligt att tillverka mycket rena NPC: er. hämning av BMP/tgfβ/Activin signalering vägar med ALK-hämmare inducera effektivt differentiering av encellig typ hESCs i NPCs15,16, som sedan kan induceras för att differentiera till funktionella neurala linjer, såsom dopaminerga neuroner och astrocyter.
Sammanfattnings, den Single-celltyp kultur protokoll med hjälp av hESCs erbjuder en attraktiv modell för att studera differentiering av dessa celler i olika linjer, inklusive NPCs. Detta protokoll är lätt att skalbart och lämpar sig därför för att generera celler för forskning som involverar regenerativ terapi och läkemedels screening.
Skalbara och effektiva metoder för differentiering av hESCs i olika linjer och generering av tillräckligt antal differentierade celler är viktiga kriterier för läkemedels screening och stamcellsterapi. Olika Single-cell passerar metoder har publicerats, där celler odlas i närvaro av sten-hämmare eller andra små molekyler för att förbättra överlevnaden, men de slutliga produkterna av dessa kultur metoder är kolonin typ hESCs17,18,<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) för hans hjälp med FACS-analysen. Denna forskning stöddes av intramural forsknings program av National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Z01-ES-101585 till AMJ.
35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
6-well plates | Corning | 3516 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
bFGF | Peprotech | 100-18C | |
Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
IGF | Peprotech | 100-11 | |
Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
SB431542 | Tocris | 1614 | |
SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |