Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז

Published: March 27, 2020 doi: 10.3791/60582
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

Summary

כדי לזהות והרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק, פיתחנו גישה למסך מסודר או לספריות RNAi ויראלי באמצעות שימוש כפול-לוציפראז מבוסס מבוססת הכתב. גישה זו מציעה דרך מהירה וזולה יחסית להקרין מאות מועמדים בניסוי אחד.

Abstract

גורמים שעתוק יכול לשנות את הביטוי של גנים היעד רבים המשפיעים על מגוון של תהליכים במורד הופך אותם מטרות טובות נגד סרטן טיפולים. עם זאת, מיקוד ישירות גורמי שעתוק הוא לעתים קרובות קשה יכול לגרום לתופעות לוואי שליליות אם גורם שעתוק הוא הכרחי ברקמות אחת או יותר מבוגר. זיהוי במעלה והרגולטורים כי באופן מיוחד להפעיל את גורמי התמלול בתאים סרטניים מציע חלופה אפשרית יותר, במיוחד אם אלה חלבונים הם קלים לתרופה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לשלב ספריות ויראליות בקנה מידה בינוני ומבוסס כפול-לluciferase מבוססי הכתב לזהות הרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק בתאים סרטניים. הגישה שלנו מציעה דרך מהירה, קלה וזולה לבחון מאות גנים בניסוי אחד. כדי להדגים את השימוש בגישה זו, ביצעת מסך של ספריית RNAi ויראלי מסודר המכיל מספר הרגולטורים של חלבון הקשורים כן (לצ) ו transcript co-activator עם מוטיב PDZ-כריכה (TAZ), שני ההמרה שיתוף מפעילי כי הם הזרם המורד של מסלול היפו. עם זאת, גישה זו יכול להיות שונה למסך עבור הרגולטורים של כמעט כל גורם שעתוק או שיתוף פקטור והוא יכול לשמש גם למסך CRISPR/CAS9, cDNA, או ORF ספריות.

Introduction

מטרת השיטה היא להשתמש בספריות ויראליות לזיהוי הרגולטורים של גורמי שעתוק בצורה מהירה וזולה יחסית. הפעילות החריגה מזוהה עם סרטן גרורות1,2,3,4,5,6, כך המיקוד גורמים שעתוק בתאים סרטניים היא גישה טיפולית מבטיחה. עם זאת, גורמים שעתוק הם לעתים קרובות קשה למקד את היעד של השימוש ב-פרמקואובולוגית7 ורבים נדרשים עבור פונקציה סלולרית נורמלית ברקמות למבוגרים8,9,10. מיקוד המסלולים הקשורים לסרטן, כי בדרך מאוד להפעיל גורמי תמלול כדי לנהוג במחלה היא גישה אפשרית יותר עם פוטנציאל יש תופעות לוואי חמורות פחות. הזמינות המסחרית של מערך מסודר ונגיפי RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA, או ORF ספריות מאפשר לחוקרים לבדוק את החשיבות של גנים רבים בניסוי אחד. עם זאת, נדרש בדיקה אמינה לפעילות הטרנסדפורמציה ששונתה.

כאן, אנו מתארים את השימוש בשיטת הכתב המבוסס על כפול-לוציפראזה ובספריות מבוססות-ויראליות כדי לזהות חלבונים המסדירים את גורמי התמלול בתאי הסרטן. בתוך מעשה זה, משרין כי היעד הקשורים לסרטן הגנים מועברים לתאי סרטן היונקים באמצעות התמרה ויראלי תאים נבחרים עבור אינטגרציה יציבה באמצעות puromycin. התאים הם הטרנסג הבאה עם מבנה עיתונאי המבטא גחלילית לוציפראז מונע על ידי יזם ספציפי לגורם שעתוק כי הוא נחקר מבנה שליטה המבטא Renilla לוציפראז מיזם פעיל באופן מכונן שאינו מגיב לגורם שעתוק נחקר. אנו מדגימים גישה זו עם מסך הוכחה של קונספט עבור הרגולטורים של לנבוח ו TAZ, המטה הקריטי העריקים של מסלול היפו8,10,11. פעילות חריגה של לנבוח ו TAZ מקדמת מספר שלבים של אשד גרורתי11 והוא נצפה בסרטן רבים11,12,13. עם זאת, כיצד להפוך את באופן מאוד מתאים ל-, מפעיל בתאי סרטן לא מובנים עדיין. במקום זאת, לא לקשור את ה-DNA, אלא מגויס ליזמים על ידי שעתוק אחרים. חברים בתחום התה (TEAD) המשפחה של גורמי שעתוק הם שותפי האיגוד העיקריים ל-לנבוח ו-TAZ, והם קריטיים עבור רוב הפונקציות מתלוות ו TAZ. העיתונאי שלנו לבנות מביע מבטא גחלילית לוציפראז מתוך מיזם לנבוח/TAZ-tead תגובה ומחקרים קודמים הפגינו כי הוא בנאמנות מזהה שינויים ב-2לנבוח-tead ו TAZ-tead פעילותמעבר 2,14,15.

הגישה שלנו היא מהירה, תפוקה בינונית, ואינו דורש מתקני הקרנה, רובוטים אוטומטיים או רצף עמוק של ספריות במאגר. העלויות נמוכות יחסית וקיימות ספריות מסחריות זמינות רבות לבחירה. הציוד הנדרש והריאגנטים הינם גם סטנדרטיים יחסית ברוב המעבדות. זה יכול לשמש למסך עבור הרגולטורים כמעט כל גורם שעתוק אם העיתונאי מבוסס לוציפראז קיים או נוצר. אנו משתמשים בגישה זו כדי להקרין מרין בתאים סרטניים, אבל כל קו תא שניתן לשנות עם יעילות סבירה יכול לשמש עם כל סוג של ספריית מסודר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: סיכום סכמטי של פרוטוקול זה מוצג באיור 1.

1. הכנה לספרייה וקטורית לגבי הנגיף

הערה: המסך הפגינו השתמשו בספריית מסודר שניתן לרכוש כמלאי גליצרול ב-96-צלחות, אך ניתן גם להרכיב ספריות באופן ידני על פי רשימת מועמדים. יש לשקול ולכלול פקדים מתאימים בספריה כלשהי. זה כולל שליטה ללא המיקוד מרין (shNTC), מרין שליטה מיקוד הגורם שעתוק נחקר, ואם אפשר, שרין מיקוד גחלילית לluciferase.

  1. הוסף 1.3 מ ל לוריא ציר (ליברות) (1% bacto-טריקטון, 0.5% שמרים לחלץ, 1% הנאגל, pH 7.5) המכיל 100 באמפיצילין μg/mL של הטוב ביותר של לוחית היטב של 96. מחסן כל טוב עם 2 μL של מלאי גליצרול וגדלים ב 37 ° c לילה עם עצבנות מתמדת ב 225 סל ד.
  2. להעביר את כל התרבות החיידקית לתוך שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL ו הגלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 21,000 x g ב 4 ° c עבור 10 דקות.
  3. לטהר כל וקטור באמצעות ערכת הכנה מיני חיידקי על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן.
  4. לקבוע את הריכוז של כל וקטור באמצעות ספקטרוסקופיה.
  5. אחסן את הפלמידים ב-20 ° c.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. אריזות של הספרייה המתקדמת

הערה: כל העבודה הכוללת וירוס, כולל אריזה, זיהום, ו culturing הבאים של תאים נגועים צריך בהחלט לעקוב אחר כללי ותקנות אבטחה טיחות מוסדיים.

  1. הרחב את התאים 293FT באמצעות מדיה צמיחה מלאה (מדיום שונה של מאוד הנשר (DMEM) המכיל 4 מ"מ L-גלוטמין, 4,500 mg/L גלוקוז ו-נתרן פירובט, שיושלם עם 10% סרום שור עוברי (FBS), 100 יחידות/mL של פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין ו-2 מ"מ L-גלוטמין
  2. עבור כל וקטור בספרייה משלב 1.4, הזרע 1 24-ובכן עם 1 x 105 293ft תאים.
    הערה: מומלץ כי כמה בארות נוספות של שליטה וקטור ויראלי להיות ארוזים ומשמש כדי לבדוק את סיכוייו של הווירוס לפני שתמשיך לשלב 3 (ראה להלן).
  3. מודיית את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 שעות.
    הערה: פרוטוקול כללי לאריזת וירוס שתואר בעבר14 הוקטן ל-24 בארות עבור פרוטוקול זה. הוא משתמש ב-psPAX2 עבור אריזות ויראליות ו-VSVG כחלבון מעיל. אם וירוס ectropic רצוי, וקטור מספק Eco ניתן להשתמש במקום VSVG. מומלץ מאוד כי פרוטוקול זה ממוטב כדי להשיג סיכוייו נגיפי המעניקה בין 30%-70% יעילות הזיהום של תאי היעד (ראה דיון). ראה טבלה משלימה 1 עבור רשימה של כל הווקטורים הנמצאים בשימוש.
  4. הגדר תערובת העברה לכל וקטור ויראלי משלב 1.4 כמתואר להלן. כל מעבר צריך להכיל 250 ng של וקטור ויראלי, 125 ng של psPAX2, 125 ng של VSVG, 1.25 μL של העברה מגיב 1, ו-23.75 μL של מאגר החצייה (ראה טבלת חומרים).
    1. לדלל כל וקטור לויראלי כדי 50 ng/μL עם nuclease-מים ללא תשלום, ולאחר מכן להעביר 5 μL (250 ng) לתוך באר של הצלחת 96-טוב PCR.
    2. הפוך את התערובת סופר לערבב על ידי ערבוב 1.25 μL * X של מגיב העברה 1 ו 23.75 μL * X של מאגר טרום-הזיהום מראש שבו "X" הוא המספר הכולל של העברה בתוספת מספר נוסף לחשבון אובדן העוצמה במהלך pipetting.
    3. משלב את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    4. הוסף 125 ng * X של psPAX2 ו 125 ng * X של VSVG לתוך הצינורית של שילוב סופר לערבב משלב 2.4.3 ובעדינות pipet למעלה ולמטה כדי לערבב. . המשך במהירות לשלב 2.4.5
    5. מיד סדרת מחלקים את התערובת משלב 2.4.4 לתוך כל שפופרת של רצועת ה-PCR, ולאחר מכן להשתמש בצינורות מרובת ערוצים כדי להעביר 25 μl את התערובת לתוך כל היטב המכיל וקטור ויראלי משלב 2.4.1.
    6. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 20 דקות.
    7. העברת כל 30 μLs מכל 96-ובכן מ Step 2.4.6 לתוך באר של 24-גם המכיל 293 תאים FT משלב 2.3.
  5. מודקת את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 שעות ולאחר מכן להחליף את המדיה בכל באר של הצלחת 24-באר עם 500 μl של מדיה הצמיחה השלמה טריים. מודטה את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור עוד 24 h.
  6. באמצעות הצינורות מרובת הערוצים, לאסוף את supernatant ויראלי מן היטב סדרת מחלקים 220 μl (מספיק עבור 1 זיהום בשלב 3 ועוד כמה נפח נוסף) לתוך 2 96-בארות כל אחד. אלו לוחיות הזיהוי. הנגיפי המגולפות
  7. אחסן את לוחיות הזיהוי הנגיפי הנבחנות ב-80 ° c.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. מומלץ גם לבדוק כמה וירוס בקרת נוסף שנארז (ראה לעיל) על התאים להידבק לפני שתמשיך שלב 3. זה כדי להבטיח כי סיכוייו מספיק כדי להשיג לפחות 30% יעילות הזיהום.

3. זיהום התאים למסך

הערה: תאים מלנומה האדם (A375) שימשו כדי להפגין גישה זו, אבל שיטה זו יכולה להיות מוחלת על כל התאים חסיד להדביק עם הנגיף. עם זאת, יש למטב את תנאי התרבות והציפוי של התאים עבור כל קו תא (ראה דיון).

  1. הרחב את התאים שיהיו נגועים במדיית גדילה מלאה.
  2. זרעים 24-צלחות עם 1 x 105 תאים ב 0.5 מ ל של מדיה צמיחה מלאה לכל טוב. זרע אחד טוב עבור כל וקטור ויראלי להיבדק (כולל פקדים) וכוללים גם היטב כי לא יהיה נגוע אשר ישמש כפקד עבור בחירת סמים בשלב 3.7.
  3. מודיית את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 שעות.
  4. להדביק כל באר משלב 3.2 עם supernatant ויראלי שונים מן הסופר הקפוא המכונה supernatant כדלקמן.
    1. להכין מדיה צמיחה מלאה המכילה 20 μg/mL polybrene.
    2. הפשרת הספרייה המתקדמת של הספריה משלב 2.7 לטמפרטורת החדר.
    3. מנושף את מדיית הגדילה מן הצלחות 24-היטב משלב 3.2 ומיד להוסיף 200 μL של polybrene-המכיל מדיית גדילה לכל טוב.
    4. באמצעות הצינורות מרובת ערוצים, להעביר 200 μL של supernatant ויראלי מכל אחד 96-ובכן מ Step 3.4.2 אל 24 בארות משלב 3.4.3.
  5. מודיית את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24-48 h.
    הערה: קווי תא מסוימים עשויים לדרוש יותר מ -24 שעות כדי לבטא את מספר הpuromycin ולהפוך לעמידים. וקטור ויראלי משמש כאן מספק טורבו-GFP-IRES-puroR עם מmiR30 מבוסס מרין ב 3 ' UTR של puroR (איור 1). היעילות הזיהום והביטוי של הגן ההתנגדות הpuromycin והמרין מנוטרים על ידי חלבון פלורסנט ירוק.
  6. הכינו מדיית גדילה מלאה המכילה 2.5 μg/mL puromycin.
    הערה: ריכוז הבחירה של puromycin משתנה בין קווי התאים. מומלץ לבצע עקומת להרוג אנטיביוטי עבור כל קו תא להיות החוליה לפני המסך.
  7. מחלק את המדיה מכל באר ולהחליף עם 500 μL של puromycin-המכיל מדיה צמיחה מלאה.
    הערה: הקפד גם להוסיף puromycin לפקד שאינו נגוע היטב שניתן להשתמש בהם בשלבים הבאים כדי להבטיח שהבחירה הpuromycin תושלם.
  8. דגירה את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 48 h.
    הערה: מומלץ לבחור עבור 48 h, כך צפיפות הציפוי, סיכוייו ויראלי צריך להיות ממוטב כך התאים אינם שוטפת לפני 48 h.
  9. ודא כי התאים הנגועים הם ירוקים תחת מיקרוסקופ פלורסנט, וכי תאים בפקד שאינם נגועים היטב מטופלים עם puromycin כולם מתים לפני שממשיכים לשלב 4.

4. זריעת תאים לצורך העברה של כתב כפול-לוציפראז

הערה: יש לבצע העברה של מבחן כדי לקבוע את צפיפות הזריעה המיטבית עבור כל קו תא חדש.

  1. טריסילזציה כל הטוב משלב 3.9 והעברת בערך 1 x 105 תאים לתוך בארות במיקום המקביל על הצלחת החדשה 24-טוב כדלקמן.
    הערה: פרוטוקול זה נועד להקרנה של ספריות עם מאות מרין ולכן לא ניתן לספור כל טוב של תאים נגועים. לכן, השלבים שלהלן שימשו להערכת מספרי התאים בכל הבאר כדי להבטיח צפיפות שווה לציפוי.
    1. לקבץ את הבארות משלב 3.9 לתוך 3-4 קבוצות כגון כל הבארות בקבוצה יש צפיפות תא דומה.
    2. טריסינזציה 1 מייצגת כל קבוצה עם 200 μL של טריפסין-EDTA (1x PBS בתוספת 0.5 מ"מ EDTA ו 0.1% טריפסין) עבור 5 דקות ב-37 ° c. לאחר מכן לנטרל את טריפסין-EDTA על ידי הוספת 400 μL של puromycin המכיל מדיה צמיחה מלאה.
    3. לספור כל נציג היטב כדי לקבוע את מספר התא הכולל לדלל את ההשעיה התא מכל נציג היטב 2 x 105 תאים/mL של שימוש במדיה צמיחה מלאה.
    4. הזרע 0.5 mL (1 x 105 תאים) של כל באר משלב 4.1.3 לתוך המיקום המתאים על צלחת חדשה 24-באר ו-דגירה זו צלחת 24-הבאר החדשה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 h.
    5. עבור כל קבוצה משלב 4.1.1, השתמש במספר התאים הכולל שנקבע בשלב 4.1.3 כדי לחשב את עוצמת הקול של טריפסין-EDTA כדי להוסיף לכל באר כדי שההשעיה של התאים המתקבלת תהיה 1 x 106 תאים/mL.
    6. הוסף את הנפח המתאים של טריפסין-EDTA לכל הטוב והדגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c.
      הערה: לקבלת מסך גדול יותר, מומלץ לוחיות הרישוי של 24 הצלחות להיות טריסינטזציה ולציפוי מחדש בקבוצות ולא בבת אחת כדי להבטיח את הכדאיות של התאים.
    7. במהלך הדגירה לעיל, להשתמש בצינורות מרובת ערוצים כדי להוסיף 400 μL של puromycin-המכיל מדיה צמיחה מלאה לבארות המתאימות על צלחת חדשה 24-היטב.
    8. העבר 100 μL של השעיית תא (כ 1x 10 בתאים) מכל טוב למיקום המקביל על הצלחות החדשות 24-היטב שהוכנו בשלב 4.1.7.
    9. חזור על שלבים ה4.1.6 באמצעות 4.1.8 עבור כל הלוחות של בארות מקובצות משלב 4.1.1, צלחת אחת בכל פעם.
  2. מודיית את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 שעות.

5. העברה של כתב כפול-לוציפראז

  1. Transfect כל טוב משלב 4.2 עם העיתונאי כפול לוציפראז מבנים כדלקמן.
    הערה: הסכום הכולל של ה-DNA ואת היחס האופטימלי של גחלילית העיתונאי ללוציפראז לשלוט renilla לוציפראז וקטור צריך להיקבע לפני התחלת הקביעה הזאת. כאן, 400 ng של תערובת DNA המכילה 20 חלקים גחלילית הכתב לוציפראז ו 1 בקרת חלק renilla ללוציפראז היה בשימוש.
    1. הפוך את התערובת לדילול העור (צינור A) ודילול הכתב לתערובת (Tube B) על ידי ערבוב הכרכים המצוינים של כל מגיב (שולחן 1) כפול מהמספר הכולל של הטרנסלימות (ועוד כמה).
      הערה: פרוטוקול זה מותאם במיוחד לצורך העברה מגיב 2 (ראה טבלת חומרים). אם נעשה שימוש בשימוש מגיב שונה, יש למטב את ההעברה לפני שלב זה.
    2. מערבבים את התערובת לדילול העור (צינור A) עם שילוב של כתבת דילול (Tube B) ומודריאט בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לייצר תערובת הזיהום.
    3. במהלך הדגירה לעיל, לשטוף כל 24-טוב משלב 4.2 עם 0.25 mL של פוספט מאגר פוספטים (PBS), ולהוסיף 447 μL של מדיית צמיחה מלאה לכל טוב.
    4. לאחר הדגירה של 15 דקות, השתמש בפיפטה מרובה ערוצים כדי להפיץ 53 μL של ערבוב העברה לכל הטוב של הצלחות 24.
  2. מודיית את התאים ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 24 שעות.

6. קוונפיקציה של פעילות כפולה לוציפראז

  1. למדוד פעילות לוציפראז באמצעות קורא לוחית ומערכת שיטת כפול ללוציפראז הכתב כמתואר להלן.
    הערה: פרוטוקול זה ממוטב עבור ערכת המידע המצוינת של העיתונאי (ראה טבלת חומרים) ומעקב אחר הפרוטוקול המומלץ של היצרן.
    1. להכין מספיק 1 x מאגר לפירוק פסיבי עבור כל בארות פלוס מספר נוסף (75 μL נדרש לכל טוב) על ידי דילול מאגר לפירוק פסיבי 5x (שסופקו בערכה) 1 אל 5 עם מים מוהים. גם להפשיר מגיב A ו מגיב B מאגר (שסופקו בערכה, 100 μL של כל אחד נדרש עבור כל טוב).
    2. מחלק את התקשורת מכל באר של הצלחת 24-היטב משלב 5.2.
    3. הוסף 75 μL של מאגר פירוק פסיבי של 1x לכל טוב ומארג בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות עם טלטול מדי פעם.
    4. הכנת B מגיב על ידי לדלל 50x מגיב B המצע (שסופקו בערכה) 1:50 עם מאגר מגיב הופר B.
    5. הוסף 30 μL של מאגר פירוק פסיבי של 1x ל -4 בארות לפריסה (ראה טבלה משלימה 2).
    6. העברה 30 μL של ליפוסט משלב 6.1.3 לתוך בארות כפולות של 96-היטב שטוח התחתון לוחית שטוחה לבנה.
    7. השתמש בצינורות מרובי ערוצים כדי להוסיף 50 μL של מגיב לכל טוב ולקרוא את האות גחלילית לוציפרז עם קורא צלחת.
    8. השתמש בפיפטה מרובה ערוצים כדי להוסיף 50 μL של מגיב B משלב 6.1.4 לכל טוב ולקרוא את האות Renilla לוציט עם קורא צלחת.
  2. עבד את הנתונים הגולמיים כדלקמן (לקבלת תיאור מפורט, ראה טבלה משלימה 2).
    1. אל תכלול דגימות עם אות מאוד נמוך Renilla לוציפראז כמו ערכים נמוכים מצביעים על כך המבנה הנגיפי היה רעיל או כי מעטים מדי התאים היו מזוהמים.
      הערה: כפי שהוסבר בדיון, משמעותית "נמוך" האות renilla ללוציפראז יכול לגרום לתוצאות חריגות. כאן, בארות שבו האות Renilla לוציפראז היה יותר מ 1 סטיית תקן מתחת לממוצע לא נכללו (ראה טבלה משלימה 2). זה היה מבוסס על מחקרים קודמים שבוצעו באמצעות מערכת כתבת אלה בתאים14, אבל יכול להיות שונה קווי תאים אחרים.
    2. לנרמל את הערך הגולמי גחלילית לוציפראז של כל טוב לערך Renilla raw לוציפראז של אותו היטב כדי לקבל את היחס גחלילית/renilla .
    3. ממוצע את היחס גחלילית/Renilla של כל שכפול בארות בקרה ולאחר מכן לחלק את היחס גחלילית/renilla של כל היתר גם על ידי מספר זה כדי לקבל שינוי מתקפל.
    4. הקצה את דגימת הבקרה וקבע את ערך היחס שלה לגחלילית/Renilla ל-1.
    5. ממוצע יחסי גחלילית/Renilla של בארות כפולות ועלילה עם סטיית התקן.
      הערה: סטיית התקן אינה משמשת לניתוח סטטיסטי, אלא כאמצעי לזיהוי בארות בהן המשכפלת שונות באופן משמעותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שלנו מבנה הכתב שלנו, שלנו (pGL3-5xmcat (SV)-492,14,15) מכיל מינייזם sv-49 מינימלי עם 5 חוזר של אלמנט האיגוד הקאנוני (mcat)15 המניע את הגנים גחלילית לוציפראז (איור 1). זה שיתוף מעורב לתוך תאים יחד עם PRL-TK שליטה וקטור (Promega), אשר מבטאת Renilla לוציפראז מן היזם הפעיל HSV TK (איור 1). חשוב להבטיח שבניית הכתב של הכתבת מתנהגת כמצופה בקווי התא (s) שנבדקו. לכן, אנחנו הראשון שיתוף המשותף PRL-TK ו-pGL3-5xMCAT (SV)-49 בנייה לתוך A375 תאים באופן בלתי סביר ביטוי או וקטור שליטה, מוטציה פעילה מאוד-לט של לנבוח (לקשקש2sa), או מוטציה של יאפ2sa לא יכול לאגד TEADS (מS94A). כצפוי, הפעילות לוציא גחלילית הוגדלה באופן משמעותי על ידי שיטת ה-2Sa, אך לא את וקטור הבקרה או את2SA, S94A (איור 2א). הדבר מרמז כי מגביר את הפעילות של כתבת מסוג מסוים של ה-, התלוי ב-TEAD-TEAD. חשוב מכך,לשנות את הרמות של שינוי הצורה באופן משמעותי. כפקד נוסף, אנו אישר גם כי מזהה האבטחה של ה-2sa אינו משנה את הפעילות של מבנה מקדם מינימלי שחסר בו רכיבי איגוד ה-mcat (איור 2B).

ניסוי בקרה שנייה נעשה גם בו תאים A375 נדבקו מבנים ויראליים לספק או מטרה שליטה שאינה מיקוד בקרה (shNTC) או בונה עם הטנדם ומים טאז מרין. לאחר בחירה יציבה, התאים היו שיתוף עם מעבר PRL-TK בונה או את הכתבת לבנה/TAZ-TEAD או את בניית היזם מינימלי. בתאים המנוכר עם מבנה הכתב של העיתונאי, מצומצם באופן משמעותי את הרמות של גחלילית/TAZ, הקטינה את הרמה הנמוכה ביותר של גחליליות לוציפראז, אבל השליטה של shNTC לא היתה (איור 2ג). גחליליות לוציפראז רמות לא שונו על ידי shNTC או מרין/TAZ בתאים באמצעות היזם מינימלי (איור 2ג). תואם את התוצאות לעיל, את האות renilla בכל הבאר היה גם לא שונה באופן משמעותי על ידי שליטה shntc או את מרין מארג/TAZ (איור 2ג), נוסף המציין כי בניית prl-TK לבנות אינו מגיב ל-, או TAZ. באופן קולקטיבי, ניסויים אלה מראים כי מערכת העיתונאי מתנהג כצפוי בתאי A375, אשר עקבית עם מחקרים קודמים באמצעות אלה וקטורים2,14.

כהוכחה לניסוי המושג, הוקרן ספריית שרין קטנה ויראלית בתאי A375. ספריית הבדיקה שלנו הכיל מיקוד מספר גנים שהיו מוצגים בעבר כדי להסדיר את הפונקציה של יאפ/TAZ בסוגי תאים אחרים. עם זאת, את התפקיד של כמה גנים אלה בוויסות של לנבוח ו TAZ ב מלנומה אינו ידוע. הספרייה שלנו כללה גנים הנדרשים עבור פעילות לנבוח/TAZ, כגון RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4, ו CCNE216,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38, ו גנים החזוי כדי לעכב את הפעילות של יאפ/TAZ, כגון csk, ERBB2, כספומט, CDH1, gelsolin (gsn), pten, atr, ו RB139,40,41,42,43,44, 45,46,47,48,49,50,51,52,53,54. כמו פקדים, אנו כללנו הדו הדו/TAZ שרין14, המטרה שלנו שליטה שאיפה (shNTC), ו מיקוד של מחפש מראה, אשר אנו בעבר הראו היה נדרש עבור המקסימלית מקסימלית/taz פעילות ב A375 תאים14.

הנתונים והניתוח הגולמיים עבור מסך זה מוצגים בטבלה משלימה 2. שרין מספר (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 ו-shMAPK8-2) הופחת באופן משמעותי האות Renilla לוציפראז יחסית לאות renilla מתכוון עבור כל הבארות, הרומז כי אלה המים האלה הם גורמים לרעילות בתאי A375. אכן, בארות אלה היו פחות משמעותית מהתאים בזמן האמת (לא הוצג). זה עושה את זה קשה מאוד להבחין מועמדים שעשויים לווסת את ה-, מאלה שחיוניים להישרדות תאים. לכן, התוצאות מדגימות אלה אינן נכללות בניתוח נתונים נוסף. כצפוי, שרין מיקוד המיקוד, TAZ או Src מופחת באופן משמעותי את הפעילות מופחתת באמצעות הפעולה (איור 3). בעקביות בעבודה שפורסמה מראה כי PIK3CA מקדמת את הפעילות לנבוח ו TAZ21,26,31, מצאנו כי שאיפה מיקוד PIK3CA הפחתת מנורמל גחלילית רמות לוציפראז. המיקוד מיקוד,53,54 כספומט,, CDH1, csk, ERBB2, gsn כל מוגבר מנורמל גחלילית רמות לוציפראז, אשר עקבית עם מחקרים שפורסמו מראה כי חלבונים אלה לדכא את ו/או TAZ39,41,42,43,45,46,47,48,48,50,51, 53, 54 . למרות התפקידים הקבועים עבור atr, CCNE2, ו ERBB4 סוגים אחרים של תאים27,28,35,36,38,49, המיקוד מיקוד גנים אלה לא שינוי באופן משמעותי רמות מנורמלות לוציפראז בתאי A375. המיקוד EZH2 ו RB1 הראו השפעה על לוציי הרמות של גחלילית שהיה הפוך מה צפוי מבוסס על מחקרים בסוגי תאים אחרים32,34,40,52. שניהם PTEN ו RAF1 היו ממוקדות על ידי שתי מרין ברורים שהיו השפעות הפוכה על פעילות לוציפראז. תוצאות לא עקביות עם מחקרים קודמים יכול להצביע על כך את ההשפעה של חלבונים אלה על הפונקציה של יאפ/TAZ-TEAD הוא סוג תא תלוי; עם זאת, זה יכול להיות גם בגלל להוריד המסכן יעילות או תופעות מחוץ ליעד על ידי מספר מרין Nas. כמסך n = 1 "עיוור", כמה תוצאות חיוביות מוטעות ושליליות שווא צפוי גם כן. כפי שנדון בפירוט רב יותר בדיון, ניסויים באימות נוסף צריך להיעשות באמצעות בחני אחרים כגון הגנים כי הם מוסדרים על ידי מוסדר על ידי בלוק taz ו-מערבי הכלים עבור שינויים לאחר translational המשפיעים על הפונקציה משפיעה. אימות זה יכלול גם אישור אשר שרין הפיל ביעילות את חלבון הריבית. חשוב גם לציין כי מאז העיתונאי שלנו הוא TEAD תגובה, כל הגנים המזוהים על ידי המסך שלנו יכול להיות השפעה Tead אבל לא לנבוח ו TAZ ישירות. המשך מחקרים מכניסטיים יידרשו כדי לקבוע אם זה היה לנבוח ו/או TAZ או TEADs כי החלבון המזוהה הוא ויסות. עם זאת, מנהלי ההתקנים העיקריים של התעתיק העיקרי של TEAD-תיווך, ולכן סביר להניח כי רוב הגנים הללו מוויסות את ה-אני ו-TAZ. אכן, כאמור לעיל, רוב מרין שפגע במסך היעד חלבונים הידועים כדי לווסת את ה-, והוא/או TAZ ישירות.

Figure 1
איור 1: דיאגרמת סכמטית של זרימת העבודה. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה מסוכמים עם מספרי צעדים המתאימים למספרים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אופטימיזציה של מערכת הכתב הכפולה של ה-sli/TAZ-TEAD. (A) A375 תאיםבאופןבלתי נשכח וקטור שליטה (mscv-IRES-hygro), בונה לוציט (לילה2sa), או מקשקש בלתי תלוי-בלתי מסוגל לאגד מודעות (לילה2sa, S94A) היו שיתוף המשותף עם prl-TK (renilla) ו pGL3-5xmcat (SV)-49 (הכתבת לוצ/TAZ-teads) בנייה והאות הלוציפר n = 7 ניסויים עצמאיים. (ב) A375 תאים שכונתיות עם או וקטור בקרה2sa או שליטה, prl-TK לבנות, ו או PGL3-5XMCAT (SV)-49 לבנות או pGL3 (SV)-49 לבנות (מינימלית מקדם) ו האות לוציפראז נמדדו 24 שעות מאוחר יותר. n = 1 ניסוי מנוכר בתוך מרובע. (ג) תאים A375 נדבקו בקידוד וירוס שאינו מיקוד בקרת המטרה (shNTC) או טנדם מרין ו Taz (sh, taz). לאחר בחירה יציבה, תאים היו שכונתיות עם בניית prl-TK ו-pGL3-5xmcat (sv)-49 לבנות או pGL3 (sv)-49 לבנות ואות ללוציפראז נמדדו 24 שעות מאוחר יותר. n = 4 זיהומים עצמאיים; מובהקות סטטיסטית נקבע באמצעות ANOVA חד כיוון ואחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey; נ = p > 0.05, * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * * p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תוצאות מסך הנציג. התוצאה של כל להפיל למטה וקטור מושווה shNTC והציג כהפרש מתקפל. גרף הבר מראה את הממוצע של גחלילית לוציפראז/Renilla יחס לוציפראז ± סטיית התקן. n = 1 ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

צינור A-העברה דילול
ריאגנט אמצעי אחסון
מאגר החצייה 25 μl לכל תגובה
הזיהום השני (להוסיף שנייה) 1.5 μl לכל תגובה
צינור B – כתבת דילול
ריאגנט אמצעי אחסון
מאגר החצייה 25 μl לכל תגובה
20:1 לוציז כתב גחלילית: שליטה מערבבים Renilla (להוסיף שנייה) 400 ng לתגובה
העברה מגיב 3 (להוסיף שלישי) 1 μl לכל תגובה
סך הכל: 26.5 μl לכל תגובה

שולחן 1: הכנת תערובת התמזגות. עבור הגלגול בכל באר של הצלחות 24-באר, 1.5 μL של מגיב הזיכרון 2 מדולל לתוך 25 μL של מאגר החצייה כדי לייצר את דילול החצייה (צינור A); בעוד 400 ng של 20:1 גחלילית כתבת לוציפראז: שליטה מערבבים Renilla ו-1 μl של הזיהום מגיב 3 מדולל לתוך 25 μl של מאגר החצייה כדי לייצר את דילול הכתב (צינור B).

וקטורים קיימים/נרכשים/מתנה
וקטור מקור
הגוף האנושי של GIPZ מווקטורים ג ' נרל אלקטריק בריאות
לוג מעבדת היינס [2]
psPAX2 הג (#12260)
לחסום את הג (#14887)
pGL3-(SV)-49 ליין פארנס [15]
pGL3-5xMCAT (SV)-49 ליין פארנס [15]
ליגת העל האנטי-טק פרונגה
מצפה הוראות לאמאר מעבדה [2]
MSCV-S127A, S381A-IRES-Hygro לאמאר מעבדה [2]
MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 למאר מעבדה [14]
ניו וקטורים
וקטור שידרה מקור
MSCV-S94A, S127A, S381A-IRES-Hygro מצפה הוראות

טבלה משלימה 1: טבלה של וקטורים. כל הווקטורים שבשימוש מפורטים בווקטורים חדשים שתוארו. טכניקות סטנדרטיות לביולוגיה מולקולרית שימשו להפקת וקטורים חדשים.

טבלה משלימה 2: שיטת לוציפראז ניתוח נתונים. הסידור של ספריית שרין מוצג בטבלה הראשונה. השולחנות השני והשלישי מראים את הגחלילית הגולמית והאותות הלוציפרתיים, בהתאמה. הממוצע ואת סטיית התקן עבור האות Renilla לוציפראז עבור כל הבארות מסומנים בקופסאות הצהובות. ולס עם אות Renilla לוציפראז יותר מ 1 סטיית תקן מתחת לממוצע מודגשים עם טקסט אדום נשלל מניתוח נוסף. היחס גחלילית/Renilla של כל טוב הושגה על ידי חלוקת האות הגולמיים גחלילית לוציפראז על ידי האות הגולמי renilla לוציפראז (הטבלה הרביעית). היחס גחלילית/renilla של כל טוב היה אז מנורמל לממוצע של גחלילית/renilla יחס של השליטה (shntc) בארות (הטבלה החמישית). הבארות הכפולות היו הממוצע הבא עבור כל מבנה וסטיית התקן חושבה (הטבלה השישית). אנא לחץ כאן כדי להציג טבלה זו (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, אנו מדגימים גישה עבור הקרנת תפוקה בינונית של ספריות ויראליות מסודר בשילוב עם שיטת dual-לוציפראז מבוססי הכתב המבוסס שניתן להשתמש כדי לזהות ולבדוק הרגולטורים הרומן של גורמים שעתוק. זה קריטי לאפיין ולייעל את מערכת הכתב עבור כל קו תא לפני כל מסך. יש לעשות ניסויים כדי לוודא כי העיתונאי מגיב לפעילות ששונתה של גורם התמלול הנחקר והיקף השינוי בפעילות צריך להיבדק ביחס לדרכי השליטה. העברה משותפת של מבנה PRL-TK יחד עם המבנה העיתונאי חשוב משום שהיא מסייעת לשלוט על מספר התאים המנוכר עם העיתונאי ואת מספר העתק של בניית הכתב, שניהם יכולים לשנות את הסדר הגודל של האות לוציפראז. ניסויים אופטימיזציה צריך גם להבטיח כי הגורם שעתוק אינו משפיע על הפעילות של המבנה הקונסטיטוטיבי Renilla או מבנה המקדם מינימלי כמו זה יכול לסבך את הפרשנות של התוצאות. יש לשקול בזהירות גם פקדים להיכלל בספריה. פרוטוקול זה מיועד "מסך עיוור" של ספריות עם מאות של שרין, שם זה לא יהיה אפשרי לאשר מנוק יעיל על ידי כל שרין. לכן, סביר להניח שכמה תוצאות חיוביות שגויות ושליליות. הגדלת מספר השכפל הטכני ו/או הביולוגי במסך עשויה לסייע בהפחתת מספר התוצאות החיוביות והתשלילים השקרית. עם זאת, זה יהיה גם להגדיל באופן משמעותי את מספר בארות לתרבות ושיטת הטיפול כל כך צריך לנקוט כדי להבטיח שזה לא התוצאה בתנאים מיטביים התרבות (ראה להלן). גישה נוספת להפחתת התוצאות החיוביות והתשלילים התותבות תהיה לחזור על המסך כולו באותו קו תא או בקווי תאים נוספים, או כדי להקרין ספריה קטנה יותר, כולל רק את "הלהיטים" באמצעות 3 משכפל ביולוגי. בכל המקרים, יש לאמת כל הכניסות באמצעות הקריאות מלבד הכתב, כגון qPCR עבור גנים מטרה ידועים. הסתרה אפקטיבית של הגן המיועד גם צריך להיות מאושר בצעדי אימות אלה. מסקנות לא צריך להתבצע על מרין כי לא לשנות את הפעילות, אלא אם כן הנוק-אין יעיל על ידי מרין מאושר. ניסויים באימות צריך גם להבטיח כי התהליך שעתוק נחקר הוא מה מוסדר על ידי גנים ממוקדות (s) וכי גנים אלה אינם משפיעים על Renilla או בנייה יזם מינימלי.

חשוב גם למטב את תנאי תרבות התא עבור כל קו תא כדי למנוע תנאים מיטביים כגון המפגש היתר, מעט מדי תאים, הכדאיות הנמוכה של התא, או קיבולת ההתרבות המשתנה. צפיפות התא מהווה חשיבות מיוחדת במיוחד בזמן ההעברה של בניית כתב כפול-לוציפראז (שלב 5) וכאשר הפעילות העיתונאית נמדדת (שלב 6). יעילות החצייה יכולה להשתנות באופן משמעותי עם צפיפות התאים ויעילות החצייה הירודה עלולה לגרום לתוצאות חריגות אם רק חלק קטן מאוכלוסיית התאים מתבצע. רוב קווי התאים שנבדקו מראים את היעילות הגבוהה ביותר כאשר ב-40-60% מזרימה, אך מומלץ להשתמש בתנאי החצייה ובדחיסות הזריעה ממוטבים לקו התאים הנתון באמצעות וקטור המספק חלבון פלורסנט. קווי תאים שקשה להדביק ו/או transfect, כגון תאים ראשיים עשויים שלא להתאים למסך זה. או הכדאיות הנמוכה של הכתב המסכן התוצאה בדרך כלל באות נמוך מאוד Renilla לוציפראז. עם זאת, ניסוי פיילוט יש לבצע כדי לקבוע את טווח האות Renilla לוציפראז לקו התא. חשוב כי סיכוייו של הנגיף המיוצר מן הספרייה מסודר הוא גבוה מספיק כדי לתת יעילות זיהום של לפחות 30% קו התא להיות המאייד. יעילות זיהום יכול להשתנות מאוד ומספר גורמים יכולים להשפיע titer נגיפי. כמות הסופרנטאנט הנגיפי שבשימוש צריכה להיות ממוטבת עבור כל קו תא ובמידת הצורך, שלב 2 יכול להיות מיטבי יותר כדי לשפר את titers ויראלי.

צפיפות התא ואת הכדאיות התאים יכול גם להשפיע על הפעילות של מסלולים סלולריים המווסת את גורמי התמלול, אז זה קריטי לזרע את התאים עבור הכתבת העיתונאי, כך שהם כולם בצפיפות דומה ביום כפול לוציפראז שיטת לקרוא (שלב 6). חשוב גם להבטיח כי התאים לדבוק בצורה אחידה על פני הבאר ולא באשכולות בתיקון צפוף במרכז. כפי שמתואר לעיל, וריאציה משמעותית באות הלוצ של Renilla מבאר גם עשוי לגרום לנתונים קשה לפענוח. עדיף להוציא בארות כי להראות ירידה משמעותית באות Renilla לוציפראז בהשוואה לכל בארות אחרות כפי שהוא מרמז כי או וקטור נגיפי הוא הפחתת הכדאיות של התא או את היעילות של הזיהום עבור אותו טוב היה מאוד נמוך. כאן אנו כללנו בארות גדול יותר 1 סטיית התקן מתוך האות renilla לוציט מתכוון, אבל ניסויים אופטימיזציה יש לעשות כדי לקבוע תפשטחשבתי המתאים עבור כל קו תא. ייתכן גם כי שרין כי להפחית את הכדאיות התאים יכול לעשות זאת על ידי שינוי הפעילות של גורם התמלול להיות מקבל. אם זה דאגה, מרין כי להפחית את האות Renilla לוציפראז יכול להיבדק מחדש באמצעות Inducible מרין או אחרים assays. זה גם קריטי להגביל את כמות הזמן שתאים חסיד הם בהשעיה אחרי טריסיזציה. השתמש בפיפטה רב ערוצית עבור רוב השלבים במהלך הטריסינזציה ובזריעת התאים, ולמסכים גדולים יותר, עבוד עם לוחיות הרישוי בקבוצות. בנוסף, מומלץ להגביל את הזמן בין זיהום התאים לבין שיטת העיתונאי. הדבר חשוב במיוחד אם גורם התמלול מווסת את התפשטות התאים או ההישרדות. במקרה זה, תאים עם הסתרה יעיל יהיה החוצה על ידי תאים עם הסתרה פחות יעיל.

מספר שינויים של הפרוטוקול המתואר הם אפשריים. גישה זו יכולה לשמש ביעילות כדי לזהות הרגולטורים של כל גורם שעתוק אם הכתב מבוסס לוציפראז מופק, ועבור רבים מבין הגורמים הנפוצים ביותר שעתוק העיתונאי כבר קיימים. ניתן לשנות פרוטוקול זה לשימוש במגוון רחב של ספריות מסחריות זמינות או מורכבות באופן ידני, כולל RNAi, CRISPR/CAS9, ORF או cDNA. אכן, השתמשנו בעבר אסטרטגיה דומה כדי לבדוק את ספריית cDNA קטן עבורמרגולטורים מחוקקים שלהיחידה. ספריות ניתן להעביר באמצעות רטרו, וירוס, אדנווירוס, או העברה ארעית. חלבון המעיל הנגיפי המשמש כאן (VSVG) יוצר את הנגיף האנושי מדבק. אם תאים מכרסמים נמצאים בשימוש ולא האדם וירוס אקולוגי מדבק והוא רצוי, וקטור אספקת חלבון המעיל האקולוגי ניתן להשתמש במקום VSVG.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי להקרין ספריות עבור הרגולטורים של גורם שעתוק. גישה למתקן סינון בעל תפוקה גבוהה תאפשר הקרנה של ספריות גדולות יותר באופן אוטומטי. כמו כן, מסכי הגנום-רחב ניתן לעשות שימוש בספריות במאגר עם רצף עמוק כאמצעי לזיהוי "להיטים". עם זאת, שתי גישות אלה דורשות ציוד שאינו נגיש לחוקרים רבים, ואת העמלות עבור הקרנת תפוקה גבוהה או רצף עמוק יכול להיות גבוה באופן גמיש. בנוסף, מסכי במאגר ידרוש מיון תאים באמצעות כתב פלורסנט או דרך אחרת להעשיר את התאים המראים את השינויים הרצויים בפעילות הטרנססקריפט. הקרנה של ספריות ביטוי גדול מסודר באמצעות כפול לluciferase המבוסס על מבוססת הכתב הוכיחה כבר בעבר באמצעות הרובוט שחקן הראשי55, אבל זה לא זמין בדרך כלל עבור כל החוקרים. לעומת זאת, השיטה המתוארת כאן מהירה, תפוקה בינונית, זולה יחסית, ומשתמשת בציוד ובחומרים ריאגנטים הצפויים להיות נגישים לרוב החוקרים. שיטה זו יכולה לחשוף הרגולטורים מרובים בניסוי אחד, שהיא דרך חסכונית ונוחה לגלות מסלולים הרגולציה פוטנציאלי במעלה של גורם שעתוק.

בגישה המתוארת, הגנים המועמדים הפילו למטה ולאחר מכן לאחר הבחירה, המבנה העיתונאי היה מנוכר לתוך התאים. עם זאת, יעילות העברה היא ירודה קווי תאים רבים והוא יכול להציג את השונות ולגרום רעילות סלולרית. גישה חלופית משופרת יהיה לשלב באופן בלתי נשכח את העיתונאי לבנות לתוך הגנום של קו העניין הסלולרי ולאחר מכן להדביק את הכתבים המבטא תאים עם הספריות נגיפי להקרנה. שיפור זה יפחית את השונות שהוצגה על-ידי השינוי החולף וימנע כל שינוי פוטנציאלי בפעילות שעתוק הגורם לתרבות שלאחר ההידבקות ממושכת. כפי שהוזכר לעיל, השימוש ברובוט קטן שחקן ספסל יהיה לייעל מאוד את התהליך ולהגדיל את גודל הספריות שניתן לוקרן. עוד שינוי ניכר הוא להשתמש בספריות וקטורי מסודר inducible, אשר תפחית את הסבירות של בחירה נגד תאים עם הסתרה יעיל יותר ולהפחית את השונות שנגרמו על ידי שינויים בכדאיות התאים.

אתגר משמעותי המונע את הטיפול האפקטיבי של סרטן רבים הוא כי תאים סרטניים לרכוש התנגדות אפילו טיפולים יעילים ביותר ממוקדות. הזיהוי של חלבונים הנדרשים עבור התנגדות טיפולית זו נחוצה כדי לשפר את התוצאה החולה. הגישה המתוארת ניתן בקלות להשתמש בשילוב עם ממוקדות therapeutics לחשוף גנים הגורמים רגישות מוגברת או התנגדות תרכובות אלה. עוד יישום פוטנציאלי עתידי של גישה זו יהיה להשתמש בהקרנה מסודר כדי לבחון מטרות טיפוליות המועמדים בשילוב. בשביל זה, תאים היו נגועים בשני וקטורים ויראליות כל אחד עם המטרה של זיהוי חלבונים בעלי השפעה סינגיסטית על פעילות שעתוק הגורם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

היינו רוצים להודות לאמילי נורטון ומיקילן קוקצ'רי-סטלירוס על כך שהיא עזרה בהכנת וקטורים מרין. עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי המענק סוזן G. Komen Catalyst הוענק J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate USA Scientific 1896-2000 For bacterial mini-prep
Trypsin - 2.50% Gibco 15090-046 Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/ml Sigma-Aldrich 45-10835242001-EA For bacterial mini-prep
Bacto-tryptone - powder Sigma-Aldrich 95039 Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit Promega E1960 For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L Himedia TS1006 For PBS
EDTA - 0.5 M VWR 97061-406 Component of trypsin-EDTA
Ethanol - 100% Pharmco-AAPER 111000200 For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum - 100% VWR 97068-085 Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml Sigma-Aldrich 45-H9268 For virus infection
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mM Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% Life technologies L3000008 For transfections
Molecular Biology Water - 100% VWR 02-0201-0500 For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl - powder BDH BDH9286 Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo scientific For measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% Gibco 31985-062 For transfections
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) Gibco 15140-122 Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit Thermo Fisher Scientific K210010 For bacterial mini-prep
Puromycin - 2.5 mg/ml Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counter Bio-Rad For cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% Roche 6365787001 For virus packaging
Yeast extract - powder VWR J850 Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% Life technologies L3000008 For transfections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Tags

מחקר הסרטן סוגיה 157 שעתוק גורם מסך RNAi מסודר לנבוח TAZ TEAD כפול לוציפראז כתב שיטת הכתב ההמרה סרטן
זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, Y., Lamar, J. M.… More

Xiao, Y., Lamar, J. M. Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter. J. Vis. Exp. (157), e60582, doi:10.3791/60582 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter