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Cancer Research

Identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su Dual-Luciferase

Published: March 27, 2020 doi: 10.3791/60582
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

Summary

Per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione, abbiamo sviluppato un approccio per lo screening delle librerie di arumani lentivirali o retrovirali con array utilizzando un saggio di reporter trascrizionale basato sulla doppia luciferasi. Questo approccio offre un modo rapido e relativamente poco costoso per vagliare centinaia di candidati in un unico esperimento.

Abstract

I fattori di trascrizione possono alterare l'espressione di numerosi geni bersaglio che influenzano una varietà di processi a valle, rendendoli buoni bersagli per le terapie anti-cancro. Tuttavia, il targeting diretto dei fattori di trascrizione è spesso difficile e può causare effetti collaterali negativi se il fattore di trascrizione è necessario in uno o più tessuti adulti. Identificare i regolatori a monte che attivano aberrantei i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali offre un'alternativa più fattibile, in particolare se queste proteine sono facili da sottofare. In questo articolo, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per combinare librerie di lentivirali di media portata in serie e un saggio di reporter trascrizionale a doppia luciferasi per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. Il nostro approccio offre un modo rapido, semplice ed economico per testare centinaia di geni in un unico esperimento. Per dimostrare l'uso di questo approccio, abbiamo eseguito uno schermo di una libreria di RNAi lentivirale con array con diversi regolatori di proteine associate sì (YAP) e co-attivatore trascrizionale con motivo legante PD , due co-attivatori trascrizionali che sono gli effetti a valle del percorso di Ippona. Tuttavia, questo approccio potrebbe essere modificato per lo screening per i regolatori di praticamente qualsiasi fattore di trascrizione o co-fattore e potrebbe anche essere utilizzato per lo screening delle librerie CRISPR/CAS9, cDNA o ORF.

Introduction

Lo scopo di questo saggio è quello di utilizzare librerie virali per identificare i regolatori di fattori di trascrizione in modo relativamente rapido e poco costoso. L'attività trascrizionale aberrante è associata al cancro e alla metastasi1,2,3,4,5,6, quindi prendere di mira i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali è un promettente approccio terapeutico. Tuttavia, i fattori di trascrizione sono spesso difficili da indirizzare farmacologicamente7 e molti sono necessari per la normale funzione cellulare nei tessuti adulti8,9,10. Puntare sulle vie associate al cancro che attivano aberrante i fattori di trascrizione per guidare la malattia è un approccio più fattibile con il potenziale di avere effetti collaterali meno gravi. La disponibilità commerciale di librerie di RNAi lentivirali e retrovirali con matrice, CRISPR/CAS9, cDNA o ORF consente ai ricercatori di testare l'importanza di numerosi geni in un singolo esperimento. Tuttavia, è necessaria una lettura affidabile per l'attività trascrizionale alterata.

Qui, descriviamo l'uso di un saggio di saggio di prosaggio di un giornalista trascrizionale a doppia luciferasi e di librerie lentivirali di matrice per identificare le proteine che regolano i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. In questo saggio, gli shRNA che colpiscono i geni associati al cancro vengono consegnati alle cellule tumorali dei mammiferi tramite la trasduzione lentivirale e le cellule vengono selezionati per un'integrazione stabile utilizzando la micina. Le cellule vengono successivamente trascate con un costrutto reporter che esprime luciferasi di lucciole guidate da un promotore specifico per il fattore di trascrizione che viene studiato e un costrutto di controllo che esprime Renilla luciferasi da un promotore di vulcaniamente attivo che non risponde al fattore di trascrizione in fase di studio. Dimostriamo questo approccio con uno schermo proof-of-concept per i regolatori di YAP e TA, gli eftrattieri critici a valle del percorso Hippo8,10,11. L'attività anomala di YAP e TAz promuove diversi passaggi della cascata metastatica11 ed è osservata in molti tumori11,12,13. Tuttavia, il modo in cui YAP e TAa diventano attivati aberrantemente in alcune cellule tumorali non è ancora completamente compreso. YAP e TAA non legano il DNA, ma vengono reclutati per promuovere da altri fattori di trascrizione. I membri della famiglia di fattori di trascrizione del dominio TEA (TEAD) sono i principali partner di associazione per YAP e TAA e sono fondamentali per la maggior parte delle funzioni dipendenti da YAP e TAz. Il nostro costrutto reporter esprime luciferasi di lucciole da parte di un promotore yAP/TAz-TEAD-responsive e studi precedenti hanno dimostrato che rileva fedelmente i cambiamenti nell'attività trascrizionale YAP-TEAD2,14,15.

Il nostro approccio è rapido, medio-velocità, e non richiede strutture di screening, robot automatizzati, o sequenziamento profondo di librerie in pool. I costi sono relativamente bassi e ci sono numerose librerie disponibili in commercio tra cui scegliere. Le attrezzature e i reagenti necessari sono relativamente standard nella maggior parte dei laboratori. Può essere utilizzato per lo screening per i regolatori di praticamente qualsiasi fattore di trascrizione se un reporter basato su luciferate esiste o viene generato. Usiamo questo approccio per vagliare gli shRNA nelle cellule tumorali, ma qualsiasi linea cellulare che può essere trasfetata con una ragionevole efficienza potrebbe essere utilizzata con qualsiasi tipo di libreria in serie.

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Protocol

NOTA: un riepilogo schematico di questo protocollo è illustrato nella Figura 1.

1. Preparazione della libreria vettoriale lentivirale

NOTA: lo schermo dimostrato ha utilizzato una libreria di shRNA disposti acquistati come scorte di glicerolo in piastre di 96 pozze, ma le librerie possono anche essere assemblate manualmente sulla base di un elenco di candidati. Controlli appropriati devono essere considerati e inclusi in qualsiasi libreria. Ciò include uno shRNA di controllo non targeting (shNTC), uno shRNA di controllo che colpisce il fattore di trascrizione in fase di studio e, se possibile, una lucifera lelina mirata a shRNA.

  1. Aggiungere 1,3 mL di Luria Broth (LB) (1% bacpton bacpton, 0,5% di estratto di lievito, 1% NaCl, pH 7,5) contenente 100 g/mL di anchilina a ciascun pozzo di una piastra di pozzo profondo 96. Inoculare ogni pozzo con 2 oltere di lesicerolo e crescere a 37 gradi durante la notte con agitazione costante a 225 giri/min.
  2. Trasferire ogni coltura batterica in un tubo centrifuga di 1,5 ml e pellet i batteri per centrifugazione a 21.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min.
  3. Purificare ogni vettore utilizzando un mini-prekit kit batterico seguendo il protocollo del produttore.
  4. Determinare la concentrazione di ogni vettore utilizzando uno spettrofotometro.
  5. Conservare i plasmidi a -20 gradi centigradi.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Imballaggio della biblioteca lentivirale in serie

NOTA: Tutti i lavori che coinvolgono il lentivirus, tra cui imballaggi, infezioni e successive colture di cellule infette, devono seguire rigorosamente le norme e i regolamenti istituzionali in materia di biosicurezza.

  1. Espandere le celle 293FT utilizzando supporti a crescita completa (il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 4 mM L-glutamine, 4.500 mg/L di glucosio e pirevate di sodio, integrati con 10% di siero bovino fetale (FBS), 100 unità/mL di penicillina, 100 streptomici e 2 mM di siero-glutamina lmutuale).
  2. Per ogni vettore nella libreria dal passaggio 1.4, eseguire il seeding di un 24-po 'con 1 x 105 293FT celle.
    NOTA: Si raccomanda di confezionare alcuni pozzi aggiuntivi di un vettore virale di controllo per testare il tipero del virus prima di procedere al passaggio 3 (vedi sotto).
  3. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h.
    NOTA: Un protocollo generale per l'imballaggio del lentivirus descritto in precedenza14 è stato scalato a 24 pozzi per questo protocollo. Utilizza psPAX2 per l'imballaggio lentivirale e VSVG come proteina del cappotto. Se si desidera il virus ectropico, un vettore che fornisce Eco può essere utilizzato al posto di VSVG. Si raccomanda vivamente che questo protocollo è ottimizzato per ottenere un titer virale che dà tra 30%-70% efficienza infezione delle cellule bersaglio (vedi Discussione). Vedere la Tabella supplementare 1 per un elenco di tutti i vettori utilizzati.
  4. Impostare una miscela di trasfezione per ogni vettore virale dal passaggio 1.4 come descritto di seguito. Ogni trasfezione deve contenere 250 ng del vettore virale, 125 ng di psPAX2, 125 ng di VSVG, 1,25 l di reagente di trasfezione 1 e 23,75 l di buffer di trasfezione (vedi Tabella dei materiali).
    1. Diluire ogni vettore lentivirale a 50 ng/L con acqua priva di nuclenonsi, quindi trasferire 5 (250 ng) in un pozzo di una piastra PCR di 96 pozze.
    2. Fare in modo che la super miscela di trasfezione si munti di 1,25 x di reagente di trasfezione 1 e 23,75 X del buffer di trasfezione preriscaldato, dove "X" è il numero totale di trasfettanti più diversi in più per tenere conto della perdita di volume durante la pipettaggio.
    3. Incubare la super miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Aggiungere 125 ng X di psPAX2 e 125 ng - X di VSVG al tubo di trasfezione super mix da Passo 2.4.3 e pipet delicatamente su e giù per mescolare. Procedere rapidamente al passaggio 2.4.5.
    5. Immediatamente aliquota la miscela dalla fase 2.4.4 in ogni tubo di una striscia PCR, quindi utilizzare pipetta multicanale per trasferire 25 : la miscela in ogni pozzo contenente vettore virale dalla fase 2.4.1.
    6. Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
    7. Trasferire tutti i 30 gradi da ogni 96-po da Passo 2.4.6 in un pozzo del 24-pozzo contenente 293 celle FT dal Passo 2.3.
  5. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per 24 h e quindi sostituire i supporti in ogni pozzo della piastra di 24 pozze con 500 gradi di supporti di crescita completa. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per altri 24 h.
  6. Utilizzando una pipetta multicanale, raccogliere il supernatante virale da ogni pozzo e 220 L (abbastanza per 1 infezione aliquota nel Passo 3 più qualche volume extra) in due 96-pozzi ciascuno. Queste sono le placche supernatali virali schierate.
  7. Conservare le placche supernate virali in serie a -80 gradi centigradi.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Si consiglia inoltre di testare alcuni dei virus di controllo supplementare che è stato confezionato (vedi sopra) sulle cellule da infettare prima di procedere al passo 3. Questo per garantire che il titolo sia sufficiente per ottenere almeno il 30% di efficienza dell'infezione.

3. Infezione delle cellule per lo schermo

NOTA: Le cellule del melanoma umano (A375) sono state utilizzate per dimostrare questo approccio, ma questo metodo può essere applicato a tutte le cellule aderenti che infettano con lentivirus. Tuttavia, la coltura cellulare e le condizioni di placcatura devono essere ottimizzate per ogni riga di cella (vedere Discussione).

  1. Espandere le cellule per essere infettati in mezzi di crescita completa.
  2. Seme 24-bene piastre con 1 x 105 celle in 0,5 ml di supporti di crescita completa per bene. Seme uno bene per ogni vettore virale da testare (compresi i controlli) e includere un pozzo extra che non sarà infettato che servirà come un controllo per la selezione di droga nel Passo 3.7.
  3. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h.
  4. Infettare ogni bene dalla Fase 3.2 con un supernatante virale diverso dal supernatante lentivirale congelato array come segue.
    1. Preparare un supporto di crescita completo che contenga 20 g/mL di polibrene.
    2. Scongelare i supernatani della biblioteca lentivirale dalla fase 2.7 alla temperatura ambiente.
    3. Aspirare i mezzi di crescita dalle lastre di 24 pozzetti della Fase 3.2 e aggiungere immediatamente 200 l di supporti di crescita contenenti polibrene ad ogni pozzo.
    4. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 200 l di supernatante virale da ogni 96-po dal passo 3.4.2 ai 24 pozzi dal Passo 3.4.3.
  5. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 - 48 h.
    NOTA: Alcune linee cellulari possono richiedere più di 24 h per esprimere gli shRNA e diventare resistenti alla panina. Il vettore virale qui utilizzato fornisce un Turbo-GFP-IRES-puro-puror con uno shRNA a base di miR30 nel 3'UTR di puroR (Figura 1). L'efficienza dell'infezione e l'espressione del gene di resistenza alla puromicina e dello shRNA sono stati monitorati da proteine fluorescenti verdi.
  6. Preparare un supporto di crescita completo che contenga 2,5 g/mL di puromycina.
    NOTA: la concentrazione di selezione della puromicina varia da una cella all'altra. Si raccomanda di eseguire una curva di uccisione antibiotica per ogni linea cellulare da disattendere prima dello schermo.
  7. Aspirare i media da ogni pozzo e sostituirli con 500 - L di puromycin contenenti supporti di crescita completi.
    NOTA: Assicurarsi di aggiungere anche la puromicina a un pozzo di controllo non infetto che può essere utilizzato nei passaggi successivi per garantire che la selezione della puromicina sia completa.
  8. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 48 h.
    NOTA: È meglio selezionare per 48 h, quindi la densità di placcatura e il titer virale devono essere ottimizzati in modo che le cellule non siano sovraconfluenti prima di 48 h.
  9. Assicurarsi che le cellule infette siano verdi al microscopio fluorescente e che le cellule di un controllo non infettate siano tutte trattate con puromycinsiano siano tutte morte prima di procedere al passaggio 4.

4. Semina le cellule per la trasfezione del giornalista a doppia luciferasi

NOTA: una trasfezione di prova deve essere eseguita per determinare la densità di semina ottimale per ogni nuova linea cellulare.

  1. Orpsinizzare ogni pozzo dal passo 3.9 e trasferire circa 1 x 105 celle in pozzi nella posizione corrispondente sulla nuova piastra 24-well come segue.
    NOTA: Questo protocollo è progettato per lo screening di librerie con centinaia di shRNA, quindi non è possibile contare ogni pozzo di cellule infette. Pertanto, i passaggi seguenti sono stati utilizzati per stimare il numero di celle in ogni pozzo per contribuire a garantire una densità di placcatura approssimativamente uguale.
    1. Raggruppare i pozzi da Passo 3.9 in 3 - 4 gruppi in modo che tutti i pozzi in un gruppo hanno una densità di cellule simile.
    2. Provate bene 1 rappresentativo da ogni gruppo con 200 gradi L di trypsin-EDTA (1x PBS integrati con 0,5 mM EDTA e 0,1% di prova) per 5 min a 37 . Quindi neutralizzare la trypsin-EDTA aggiungendo 400 l di puromycina contenente supporti di crescita completa.
    3. Contare bene ogni rappresentante per determinare il numero totale di celle e diluire la sospensione cellulare da ogni rappresentante a 2 x 105 celle/mL dell'utilizzo di supporti di crescita completi.
    4. Seme 0,5 mL (1 x 105 celle) di ciascuno bene dalla fase 4.1.3 nella posizione corrispondente su una nuova piastra di 24 pozze e incubare questa nuova piastra di 24 pozze a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per 24 h.
    5. Per ogni gruppo dal passaggio 4.1.1, utilizzare il numero di cella totale determinato nel passaggio 4.1.3 per calcolare il volume di trypsin-EDTA da aggiungere a ogni pozzo in modo che la sospensione delle celle risultante sia 1 x 106 celle / mL.
    6. Aggiungere il volume appropriato di trypsin-EDTA ad ogni pozzo e incubare per 5 min a 37 gradi centigradi.
      NOTA: Per lo schermo più grande si consiglia di provare e riaffiorare le piastre a 24 pozzetti in gruppi piuttosto che tutte in una volta per garantire la vitalità delle cellule.
    7. Durante l'incubazione di cui sopra, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 400 l di mezzi di crescita completa contenenti puromicina ai pozzi corrispondenti su una nuova piastra di 24 pozzetti.
    8. Trasferire 100 l di sospensione cellulare (circa 1 x 105 celle) da ogni pozzo alla posizione corrispondente sulle nuove piastre da 24 pozze preparate nel passo 4.1.7.
    9. Ripetere i passaggi da 4.1.6 a 4.1.8 per tutte le piastre di pozze raggruppate dal passaggio 4.1.1, una piastra alla volta.
  2. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h.

5. Trasfezione del giornalista a doppia luciferalità

  1. Transfect ogni bene dal Passo 4.2 con il reporter dual-luciferate costruisce come segue.
    NOTA: La quantità totale di DNA e il rapporto ottimale di vettore reporter luciferasi lucciole al controllo Renilla luciferase vettore deve essere determinato prima di iniziare questo saggio. Qui, 400 ng di una miscela di DNA che contiene 20 parti firefly luciferasi reporter e 1 parte di controllo Renilla luciferase è stato utilizzato.
    1. Effettuare la miscela di diluizione di trasfezione (Tube A) e la miscela di diluizione del reporter (Tube B) mescolando i volumi indicati di ciascun reagente (Tabella 1) moltiplicato per il numero totale di trafetti (più diversi extra).
      NOTA: questo protocollo è ottimizzato per il reagente 2 (vedere Tabella dei materiali). Se viene utilizzato un reagente di trasfezione diverso, la trasfezione deve essere ottimizzata prima di questo passaggio.
    2. Mescolare la miscela di diluizione di trasfezione (Tube A) con la miscela di diluizione del reporter (Tube B) e incubare a temperatura ambiente per 15 min per produrre la miscela di trasfezione.
    3. Durante l'incubazione di cui sopra, sciacquare ogni 24-po dal Passo 4.2 con 0.25 mL di salina buffer fosfato (PBS), e aggiungere 447 L di supporti di crescita completa ad ogni pozzo.
    4. Dopo l'incubazione di 15 minuti, utilizzare una pipetta multicanale per distribuire 53 ll di miscela di trasfezione in ogni pozzetto delle piastre di 24 pozze.
  2. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 24 h.

6. Quantificazione dell'attività a doppia luciferalità

  1. Misurare l'attività luciferasi utilizzando un lettore di lamiere e un kit di prova reporter a doppia luciferalasi come descritto di seguito.
    NOTA: questo protocollo è ottimizzato per il kit di analisi reporter indicato (vedere Tabella dei materiali) e segue il protocollo consigliato dal produttore.
    1. Preparare abbastanza 1x buffer di lisi passiva per tutti i pozzi più diversi extra (75 è necessario per bene) diluindo 5x buffer di lisi passiva (fornito in kit) 1 a 5 con acqua deionizzata. Anche scongelare il reagente A e il buffer B del reagente (fornito nel kit, per ogni pozzo è necessario 100 l di ciascuno).
    2. Aspirare il supporto da ogni pozzo della piastra 24-po' dal Passo 5.2.
    3. Aggiungere 75 luna di 1x tampone di lisi passiva ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per 30 min con occasionalmente agitazione.
    4. Preparare il reagente B diluindo il substrato 50x reagente B (fornito in kit) 1:50 con buffer reagente B scongelato.
    5. Aggiungere 30 l di 1x buffer di lisi passiva a 4 pozze per lo svuotamento (vedere la tabella supplementare 2).
    6. Trasferire 30 luna di lispetto dalla fase 6.1.3 in pozze duplicate di una piastra di analisi bianca inferiore piatta 96-well.
    7. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 -L di reagente A ad ogni pozzo e leggere il segnale luciferasi lucciola con un lettore di piastre.
    8. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 -L di reagente B da Passo 6.1.4 a ogni pozzo e leggere il segnale Di Renilla luciferaree con un lettore di piastre.
  2. Elaborare i dati non elaborati come segue (per una descrizione dettagliata, vedere la tabella supplementare 2).
    1. Escludere i campioni con un segnale molto basso di Renilla luciferate come valori bassi indicano che il costrutto virale era tossico o che troppo poche cellule trasfette sono state valutate.
      NOTA: Come spiegato nella discussione, il segnale di Renilla luciferase significativamente "basso" può portare a risultati anomali. Qui sono stati esclusi i pozzi in cui il segnale di Renilla luciferate era superiore a 1 deviazione standard al di sotto della media (cfr. tabella supplementare 2). Questo si basava su studi precedenti eseguiti utilizzando questo sistema di reporter in queste cellule14, ma può differire in altre linee cellulari.
    2. Normalizzare il valore di luciferasi lucciola cruda di ogni pozzo per il valore crudo Renilla luciferase dello stesso pozzo per ottenere il rapportoluccio/Renilla.
    3. Calcolare laRenilla media dei rapporti lucciola/Renilla di tutti i pozzi di controllo di replica e quindi dividere bene il rapporto lucciola/Renilla di ogni altro con quel numero per ottenere un cambio di piega.Renilla
    4. Assegnare il campione di controlloRenilla e impostare il suo valore del rapporto lucciola/Renilla a 1.
    5. Calcolare laRenilla media dei rapporti lucciola/Renilla dei pozzi duplicati e tracciare con la deviazione standard.
      NOTA: La deviazione standard non viene utilizzata per l'analisi statistica, ma come mezzo per identificare i pozzi in cui le repliche differiscono in modo significativo.

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Representative Results

Il nostro costrutto reporter YAP/TAz-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contiene un promotore SV-49 minimo con 5 ripetizioni dell'elemento di legame TEAD canonico (MCAT)15 che guida il gene luciferasi della lucciola ( Figura1). È co-transfettato in cellule insieme al vettore di controllo PRL-TK (Promega), che esprime Renilla luciferate dal promotore HSV TK attivo in modo distituazionale (Figura 1). È fondamentale garantire che il costrutto di reporter YAP/TAz-TEAD si comporti come previsto nelle linee cellulari in fase di test. Pertanto, abbiamo prima co-transinfettato i costrutti PRL-TK e pGL3-5xMCAT (SV)-49 in cellule A375 che esprimono stabilmente un vettore di controllo, un mutante INsensibile LATS altamente attivo di YAP (YAP2SA)o un mutante di YAP2SA incapace di legare I TEAD (YAP2SA,S94A). Come previsto, l'attività di luciferasi delle lucciole è stata notevolmente aumentata da YAP2SA, ma non il vettore di controllo o YAP2SA,S94A (Figura 2A). Ciò suggerisce che YAP aumenta l'attività del reporter YAP/TAz-TEAD in modo dipendente da TEAD. È importante sottolineare che YAP2SA non ha alterato in modo significativo i livelli della Luciferasi di Renilla. Come ulteriore controllo, abbiamo anche confermato che yAP2SA non altera l'attività di un costrutto promotore minimo che manca degli elementi di associazione MCAT TEAD (Figura 2B).

Un secondo esperimento di controllo è stato anche fatto in cui le cellule A375 sono state infettate da costrutti virali che forniscono uno shRNA di controllo non targeting (shNTC) o un costrutto con tandem YAP e TA , shRNA. Dopo una selezione stabile, le cellule sono state co-trascate con il costrutto PRL-TK e con il costrutto di reporter YAP/TAz-TEAD o con il costrutto promotore minimo. Nelle cellule trasinfettate dal costrutto di reporter YAP/TAz-TEAD, lo shRNA YAP/TAz ha ridotto significativamente i livelli di luciferasi delle lucciole, ma il controllo shNTC non lo ha fatto (Figura 2C). I livelli di luciferasi delle lucciole non sono stati modificati né dallo shNTC né dallo shRNA YAP/TAz nelle cellule trafette con il promotore minimo (Figura 2C). Coerentemente con i risultati di cui sopra, anche il segnale Renilla in ogni pozzo non è stato alterato in modo significativo dal controllo shNTC o dallo shRNA YAP/TA (Figura 2C), indicando ulteriormente che il costrutto di controllo PRL-TK non risponde a YAP o TA. Collettivamente, questi esperimenti dimostrano che il sistema reporter si comporta come previsto nelle cellule A375, il che è coerente con gli studi precedenti utilizzando questi vettori2,14.

Come esperimento proof-of-concept, abbiamo esaminato una piccola libreria di shRNA lentivirale in cellule A375. La nostra libreria di test conteneva shRNA mirati a diversi geni che in precedenza erano stati dimostrati per regolare la funzione YAP/TAz in altri tipi di cellule. Tuttavia, il ruolo di molti di questi geni nella regolazione di YAP e TA nel melanoma è sconosciuto. La nostra libreria comprendeva i geni necessari per l'attività di YAP/TAz, come RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, E'H2, PDK1, ERBB4, e CCNE216,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29. 30,31,32,33,34,35,36,37,38 ,38, e i geni previsti per inibire l'attività di YAP / TAz, come CSK, ERBB2, ATM, CDH1, Gelsolin (GSN), PTEN, ATR, e RB139,40,41,42,43,44, 45,46,47,48,49,50,51,52,53,54. Come controlli, abbiamo incluso uno shRNA di controllo di 3aP/TAz14,uno shRNA di controllo non targeting (shNTC) e uno Src di puntamento shRNA, che abbiamo precedentemente mostrato era necessario per la massima attività YAP/TAz nelle cellule A37514.

I dati grezzi e l'analisi per questa schermata sono riportati nella Tabella supplementare 2. Diversi shRNA (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 e shMAPK8-2) hanno ridotto significativamente il segnale di Renilla luciferares (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 e shMAPK8-2) ha ridotto significativamente il segnale di Renilla luciferase rispetto al segnale medio di Renilla per tutti i pozzi, suggerendo che questi shRNA causavano citotossicità nelle cellule A375. Infatti questi pozzi avevano significativamente meno cellule al momento dell'esecuzione (non mostrato). Questo rende molto difficile distinguere i candidati che possono regolare YAP / TA Az da quelli che sono essenziali per la sopravvivenza delle cellule. Pertanto, i risultati di questi campioni sono esclusi da un'ulteriore analisi dei dati. Come previsto, gli shRNA destinati a YAP e TA-o Src hanno ridotto significativamente l'attività di YAP/TA-TEAD (Figura 3). Coerentemente con il lavoro pubblicato che mostra che PIK3CA promuove l'attività DiOP e TAA21,26,31, abbiamo trovato che shRNA mirati PIK3CA ridotto i livelli normalizzati di luciferasi di lucciola. shRNA mirati ATM, CDH1, CSK, ERBB2, GSN ciascuno aumentato livelli normalizzati luciferasi di lucciola, che è coerente con gli studi pubblicati che dimostrano che queste proteine reprimono YAP e/o TA3939,41,42,43,45,46,47,48,50,51,53,54 . Nonostante i ruoli stabiliti per ATR, CCNE2 ed ERBB4 in altri tipi di cellule27,28,35,36,38,49 ,,shRNAmirati questi geni non hanno cambiato in modo significativo i livelli di luciferasi di lucciole normalizzate nelle cellule A375.35 ShRNA che prendono di mira l'EH2 e l'RB1 hanno mostrato un effetto sui livelli di luciferasi di lucciola che era opposto a quello che ci si aspettava sulla base di studi in altri tipi di cellule32,34,40,52. Sia PTEN che RAF1 sono stati presi di mira da due shRNA distinti che hanno avuto effetti opposti sull'attività luciferasi. Risultati incoerenti con studi precedenti potrebbero indicare che l'influenza di queste proteine sulla funzione YAP/TA-TEAD è dipendente dal tipo di cellula; tuttavia, può anche essere dovuto a scarsa efficienza di abbattimento o effetti fuori bersaglio da alcuni shRNA. Come uno schermo n - 1 "cieco", ci si aspetterebbero anche alcuni falsi positivi e falsi negativi. Come discusso più dettagliatamente nella discussione, ulteriori esperimenti di convalida dovrebbero essere effettuati utilizzando altri saggi come qPCR per i geni che sono regolati da YAP e TAz e macchie occidentali per le modifiche post-traduzionali che influenzano la funzione YAP/ TA. Questa convalida includerebbe anche la conferma di quali shRNA hanno effettivamente abbattuto il proteine di interesse. È anche importante notare che, poiché il nostro reporter è sensibile al TEAD, tutti i geni identificati dal nostro schermo potrebbero influenzare direttamente i TEAD, ma non direttamente YAP e TA. Studi meccanicistici di follow-up sarebbero necessari per determinare se è stato YAP e/o TA O i TEAD che la proteina identificata sta regolando. Tuttavia, YAP e TAA sono i principali motori della trascrizione mediata da TEAD, quindi è probabile che la maggior parte di questi geni stia nocela come YAP e TA. Infatti, come detto sopra, la maggior parte degli shRNA che colpiscono nello schermo le proteine di destinazione che sono noti per regolare direttamente YAP e/o TA.

Figure 1
Figura 1: Diagramma schematico del flusso di lavoro. I passaggi critici di questo protocollo sono riepilogati con numeri di passaggio corrispondenti ai numeri nel protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Ottimizzazione del sistema di reporter trascrizional a doppia luciferasi YAP/TA-TEAD. (A) Cellule A375 che esprimono stabilmente vettori di controllo (MSCV-IRES-Hygro), YAP (YAP2SA)insensibili a LATS o YAP indipendenti dalla LATS che non sono in grado di legare i TEAD (YAP2SA,, S94A) sono stati co-transfettati con i costrutti PRL-TK (Renilla) e pGL3-5xMCAT (SV)-49 (giornalista YAP/TA-TEAD) e il segnale luciferasi è stato misurato 24 ore dopo. n - 7 esperimenti indipendenti. ((B) Le cellule A375 sono state co-trascate con YAP2SA o vettore di controllo, il costrutto PRL-TK, e il costrutto pGL3-5xMCAT (SV)-49 o il costrutto pGL3 (SV)-49 (promotore minimo) e il segnale luciferaree è stato misurato 24 ore dopo. n - 1 esperimento trasinfezione in quadruplicato. (C) Le cellule A375 sono state infettate da retrovirus che codificano uno shRNA di controllo non targeting (shNTC) o tandem YAP e TA A shRNA (shYAP/TA). Dopo una selezione stabile, le cellule sono state co-trascate con il costrutto PRL-TK e il costrutto pGL3-5xMCAT (SV)-49 o il costrutto pGL3 (SV)-49 e il segnale luciferasi sono stati misurati 24 ore dopo. n - 4 infezioni indipendenti; La significatività statistica è stata determinata utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo di Tukey; n.s. : p>0,05, p<0,05, p<0,01, >p<0.0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Risultati della schermata rappresentativa. Il risultato di ogni vettore di knock down viene confrontato con shNTC e presentato come differenza di piegatura. Il grafico a barre mostra la media di luciferata di lucciola /Renilla luciferasi rapporto - deviazione standard. n - 1 esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tubo A – Diluizione della trasfezione
Reagente Volume
Buffer di trasfezione 25 l per reazione
Reagente di trasfezione 2 (aggiungi secondo) 1,5 l per reazione
Tubo B – Diluizione Reporter
Reagente Volume
Buffer di trasfezione 25 l per reazione
20:1 Firefly luciferase reporter: controllo Renilla mix (aggiungere secondo) 400 ng per reazione
Reagente di trasfezione 3 (aggiungi terzo) 1 l per reazione
Totale: 26,5 l per reazione

Tabella 1: Preparazione del mix di trasfezione. Per la trasfezione in ogni pozzetto delle piastre a 24 pozze, 1,5 l di reagente 2 della trasfezione viene diluito in 25 - L di buffer di trasfezione per produrre la diluizione della trasfezione (tubo A); mentre 400 ng di 20:1 firefly luciferasi reporter: controllo Renilla mix e 1 :L di reagente di trasfezione 3 viene diluito in 25 :L di Transfection Buffer per produrre la diluizione reporter (tubo B).

Vettori esistenti/acquistati/regali
Vettore fonte
Vettori lentivirali shRNA umani GE Healthcare
VSVG Laboratorio Hynes [2]
psPAX2 (in base al sistema psPAX2) Addgene (#12260)
gag/pol Addgene (#14887)
pGL3-(SV)-49 Iain Farrance [15]
pGL3-5xMCAT(SV)-49 Iain Farrance [15]
PRL-TK Promega
MSCV-IRES-Hygro LAB LAMAR [2]
MSCV-YAP-S127A,S381A-IRES-Hygro LAB LAMAR [2]
MSCV-'SGreen-2A-Puro-hYAP7/hT-A3 LABORATORIO DI LAMAR [14]
Nuovi vettori
Vettore Backbone di origine
MSCV-YAP-S94A,S127A,S381A-IRES-Hygro MSCV-IRES-Hygro

Tabella supplementare 1: Tabella dei vettori. Tutti i vettori utilizzati sono elencati con i nuovi vettori descritti. Sono state utilizzate tecniche di biologia molecolare standard per generare nuovi vettori.

Tabella supplementare 2: Analisi dei dati di analisi di Luciferase. La disposizione della libreria shRNA è mostrata nella prima tabella. Il secondo e il terzo tavolo mostrano i segnali di lucciola e Renilla luciferasi, rispettivamente. La media e la deviazione standard per il segnale di Renilla luciferate per tutti i pozze sono indicate nelle caselle gialle. I pozzi con un segnale Di Renilla luciferaree più di 1 deviazione standard al di sotto della media sono evidenziati con testo rosso ed esclusi da ulteriori analisi. Il rapportolucciola/Renilla di ogni pozzo è stato ottenuto dividendo il segnale di luciferasi della lucciola grezza per il segnale crudo di Luciferasi Renilla (quarta tabella). Il rapportolucciola/Renilla di ogni pozzo è stato poi normalizzato alla media del rapporto luccio/Renilla dei pozzi di controllo (shNTC) (quinta tabella).Renilla I pozzi duplicati sono stati calcolati nella media successiva per ogni costrutto ed è stata calcolata la deviazione standard (sesta tabella). Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

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Discussion

In questo studio, dimostriamo un approccio per lo screening a medio velocità delle librerie virali di serie in combinazione con un saggio di reporter trascrizionale a doppia luciferasi che può essere utilizzato per identificare e testare nuovi regolatori di fattori di trascrizione. È fondamentale caratterizzare e ottimizzare il sistema di reporter per ogni riga di cella prima di qualsiasi schermata. Gli esperimenti dovrebbero essere fatti per confermare che il reporter risponde all'attività alterata del fattore di trascrizione in fase di studio e che l'entità del cambiamento nell'attività deve essere testata rispetto ai vettori di controllo. La co-trasfezione del costrutto PRL-TK insieme al costrutto reporter è importante perché aiuta a controllare il numero di cellule trascate con il reporter e il numero di copie del costrutto reporter, che possono alterare la grandezza del segnale luciferasi. Gli esperimenti di ottimizzazione dovrebbero anche garantire che il fattore di trascrizione non influenzi l'attività del costrutto costitutivo di Renilla o un costruttore promotore minimo in quanto ciò potrebbe complicare l'interpretazione dei risultati. Anche i controlli da includere nella libreria devono essere attentamente considerati. Questo protocollo è progettato per uno "schermo cieco" di librerie con centinaia di shRNA, dove non è possibile confermare un knockdown efficace da parte di ogni shRNA. Pertanto, alcuni falsi positivi e negativi sono probabili. Aumentare il numero di repliche tecniche e/o biologiche sullo schermo potrebbe contribuire a ridurre il numero di falsi positivi e negativi. Tuttavia, questo aumenterà anche significativamente il numero di pozzi alla cultura e pure si dovrebbe fare attenzione a garantire che ciò non si traduca in condizioni culturali non ottimali (vedi sotto). Un altro approccio per ridurre i falsi positivi e negativi sarebbe quello di ripetere l'intero schermo nella stessa linea cellulare o linee cellulari aggiuntive, o di vagliare una libreria più piccola che include solo i "colpi" utilizzando 3 repliche biologiche. In tutti i casi, qualsiasi hit deve essere convalidato utilizzando letture oltre al reporter, come qPCR per i geni bersaglio noti. L'abbattimenti efficaci del gene mirato dovrebbe essere confermato anche in questi passaggi di convalida. Non si devono trarre conclusioni sugli shRNA che non alterano l'attività a meno che non sia confermato un efficace abbattimenti da parte dello shRNA. Gli esperimenti di convalida dovrebbero anche garantire che il fattore di trascrizione in fase di studio sia ciò che è regolato dai geni bersaglio e che questi geni non influenzino i costrutti renili o minimi promotori.

È inoltre importante ottimizzare le condizioni di coltura cellulare per ogni linea cellulare per evitare condizioni non ottimali come sovra-confluenza, troppo poche cellule, scarsa vitalità cellulare o capacità proliferale variabile. La densità di semina delle cellule è particolarmente importante al momento della trasfezione del costrutto di reporter a doppia luciferasi (passaggio 5) e quando viene misurata l'attività del reporter (passaggio 6). L'efficienza della trasfezione può variare in modo significativo con la densità cellulare e una scarsa efficienza della trasfezione può portare a risultati anomali se solo una piccola frazione della popolazione cellulare viene saggiata. La maggior parte delle linee cellulari testate mostra la massima efficienza di trasfezione quando si raggiunge la confluenza del 40 - 60%, ma si raccomanda che le condizioni di trasfezione e la densità di semina siano ottimizzate per una determinata linea cellulare utilizzando un vettore che fornisce una proteina fluorescente. Le linee cellulari difficili da infettare e/o transfettali, come le cellule primarie, potrebbero non essere adatte a questo schermo. Scarsa efficienza di trasfezione reporter o scarsa vitalità cellulare in genere provocare molto basso Renilla luciferaree segnale. Tuttavia, un esperimento pilota dovrebbe essere eseguito per determinare la gamma di segnale Renilla luciferasis per una linea cellulare. È importante che il tipero del virus prodotto dalla libreria arrayed sia abbastanza alto da dare un'efficienza dell'infezione di almeno il 30% nella linea cellulare che viene analizzata. L'efficienza dell'infezione può variare notevolmente e diversi fattori possono influenzare il titro virale. La quantità di supernatante virale utilizzato dovrebbe essere ottimizzata per ogni linea cellulare e, se necessario, Passo 2 può essere ottimizzato ulteriormente per migliorare i titers virali.

La densità cellulare e la vitalità cellulare possono anche influenzare l'attività delle vie cellulari che regolano i fattori di trascrizione, quindi è fondamentale seeding delle cellule per la trasfezione reporter in modo che siano tutti ad una densità simile il giorno in cui viene letto il saggio dual-luciferate (Passaggio 6). È anche importante assicurarsi che le cellule aderiscano uniformemente attraverso il pozzo piuttosto che raggrupparsi in una macchia densa al centro. Come descritto in precedenza, variazioni significative nel segnale di Renilla luciferate da pozzo a pozzo possono portare a dati difficili da interpretare. E 'meglio escludere pozzi che mostrano una significativa riduzione del segnale Renilla luciferate rispetto a tutti gli altri pozzi come questo suggerisce che sia il vettore virale sta riducendo la vitalità cellulare o l'efficienza di trasfezione per quel pozzo era molto bassa. Qui abbiamo escluso pozzi superiori a 1 deviazione standard dal segnale medio di Renilla luciferate, ma gli esperimenti di ottimizzazione dovrebbero essere fatti per determinare i tagli appropriati per ogni linea cellulare. È anche possibile che gli shRNA che riducono la vitalità cellulare lo facciano alterando l'attività del fattore di trascrizione che viene analisi. Se questo è un problema, shRNA che riducono il segnale di Renilla luciferase potrebbe essere nuovamente testato utilizzando shRNA inducibili o altri saggi. È inoltre fondamentale limitare la quantità di tempo che le cellule aderenti sono in sospensione dopo la prova. Utilizzare una pipetta multicanale per la maggior parte dei passaggi durante la prova e la semina delle celle e per schermi più grandi, lavorare con le piastre in lotti. Inoltre, è meglio limitare il tempo tra l'infezione delle cellule e il saggio reporter. Ciò è particolarmente importante se il fattore di trascrizione che viene analisi regola la proliferazione cellulare o la sopravvivenza. In questo caso, le cellule con un knockdown efficace sarebbero superate dalle cellule con knockdown meno efficiente.

Sono possibili diverse modifiche del protocollo descritto. Questo approccio può essere utilizzato in modo efficace per identificare i regolatori di qualsiasi fattore di trascrizione se viene generato un reporter basato su luciferasi e per molti dei fattori di trascrizione più comuni che esistono già costrutti di reporter. Questo protocollo può essere modificato per l'uso di un'ampia varietà di librerie disponibili in commercio o assemblate manualmente, tra cui RNAi, CRISPR/CAS9, ORF o cDNA. In fatti, in precedenza abbiamo usato una strategia simile per testare una piccola libreria cDNA per i regolatori YAP/TAz14. Le librerie possono essere fornite utilizzando retrovirus, lentivirus, adenovirus o trasfezione transitoria. La proteina del mantello virale utilizzata qui (VSVG) genera lentivirus che è umano-infettivo. Se si utilizzano cellule di roditori e si desidera un virus ecotropico infettivo non umano, è possibile utilizzare un vettore che fornisce la proteina Eco coat al posto di VSVG.

Altri metodi possono essere utilizzati per le librerie di schermo per i regolatori di un fattore di trascrizione. L'accesso a una struttura di screening ad alto contenuto di velocità di lettura consentirebbe lo screening di librerie molto più grandi in modo automatizzato. Allo stesso modo, gli schermi a livello di genoma possono essere fatti utilizzando librerie raggruppate con sequenziamento profondo come mezzo per identificare i "colpi". Tuttavia, entrambi questi approcci richiedono apparecchiature che non sono accessibili a molti ricercatori e le tariffe per lo screening ad alta produttività o il sequenziamento profondo possono essere proibitive. Inoltre, gli schermi raggruppati richiederebbero lo smistamento delle cellule utilizzando un reporter fluorescente o un altro modo per arricchire le cellule che mostrano i cambiamenti desiderati nell'attività trascrizionale. Lo screening di grandi librerie di espressioni a matrice utilizzando un test di reporter trascrizionale a doppia luciferasi è stato dimostrato in precedenza utilizzando un robot da banco55, ma questo non è comunemente disponibile per tutti i ricercatori. Al contrario, il metodo qui descritto è rapido, medio-velocità, relativamente poco costoso e utilizza attrezzature e reagenti che sono probabilmente accessibili alla maggior parte degli investigatori. Questo metodo può rivelare più regolatori in un unico esperimento, che è un modo conveniente e conveniente per scoprire potenziali percorsi normativi a monte di un fattore di trascrizione.

Nell'approccio descritto, i geni candidati sono stati abbattuti stabilmente e poi, dopo la selezione, i costrutti dei reporter sono stati trascate transitoriamente nelle cellule. Tuttavia, l'efficienza della trasfezione è scarsa in molte linee cellulari e può introdurre variabilità e causare tossicità cellulare. Un approccio alternativo migliorato sarebbe quello di integrare stabilmente il costrutto del reporter nel genoma della linea di interesse cellulare e quindi infettare le cellule che esprimono il reporter con le librerie virali per lo screening. Questo miglioramento ridurrebbe la variabilità introdotta dalla trasfezione transitoria e impedirebbe eventuali cambiamenti nell'attività dei fattori di trascrizione a causa della prolungata coltura post-infezione. Come accennato in precedenza, l'uso di un piccolo robot da banco sarebbe notevolmente semplificare il processo e aumentare le dimensioni delle librerie che potrebbero essere schermati. Un'altra notevole modifica consiste nell'utilizzare librerie vettoriali indotbili in serie, che ridurrebbero la probabilità di selezione rispetto alle cellule con un knockdown più efficace e ridurrebbero la variabilità causata da cambiamenti nella fattibilità cellulare.

Una sfida significativa che impedisce il trattamento efficace di molti tumori è che le cellule tumorali acquisiscono resistenza anche alle terapie mirate più efficaci. L'identificazione delle proteine necessarie per questa resistenza terapeutica è necessaria per migliorare l'esito del paziente. L'approccio descritto potrebbe essere facilmente utilizzato in combinazione con terapie mirate per rivelare i geni che causano una maggiore sensibilità o resistenza a questi composti. Un'altra potenziale applicazione futura di questo approccio sarebbe quella di utilizzare questo screening in serie per testare gli obiettivi terapeutici candidati in combinazione. Per questo, le cellule sarebbero infettate da due vettori virali ciascuno con l'obiettivo di identificare le proteine che hanno un effetto sinergico sull'attività del fattore di trascrizione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Emily Norton e Mikaelan Cucciarre-Stuligross per aver assistito nella preparazione dei vettori shRNA. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una Susan G. Komen Career Catalyst Grant che ha assegnato a J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate USA Scientific 1896-2000 For bacterial mini-prep
Trypsin - 2.50% Gibco 15090-046 Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For dual-luciferase assay
Ampicillin - 100 mg/ml Sigma-Aldrich 45-10835242001-EA For bacterial mini-prep
Bacto-tryptone - powder Sigma-Aldrich 95039 Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit Promega E1960 For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L Himedia TS1006 For PBS
EDTA - 0.5 M VWR 97061-406 Component of trypsin-EDTA
Ethanol - 100% Pharmco-AAPER 111000200 For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum - 100% VWR 97068-085 Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml Sigma-Aldrich 45-H9268 For virus infection
HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For dual-luciferase assay
L-Glutamine - 200 mM Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% Life technologies L3000008 For transfections
Molecular Biology Water - 100% VWR 02-0201-0500 For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl - powder BDH BDH9286 Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo scientific For measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% Gibco 31985-062 For transfections
Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) Gibco 15140-122 Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit Thermo Fisher Scientific K210010 For bacterial mini-prep
Puromycin - 2.5 mg/ml Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counter Bio-Rad For cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% Roche 6365787001 For virus packaging
Yeast extract - powder VWR J850 Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% Life technologies L3000008 For transfections

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References

  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

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Ricerca sul cancro numero 157 fattore di trascrizione schermo RNAi a matrice YAP TA TEAD reporter a doppia luciferasi saggio di reporter trascrizionale cancro
Identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su Dual-Luciferase
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Xiao, Y., Lamar, J. M.… More

Xiao, Y., Lamar, J. M. Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter. J. Vis. Exp. (157), e60582, doi:10.3791/60582 (2020).

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