Per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione, abbiamo sviluppato un approccio per lo screening delle librerie di arumani lentivirali o retrovirali con array utilizzando un saggio di reporter trascrizionale basato sulla doppia luciferasi. Questo approccio offre un modo rapido e relativamente poco costoso per vagliare centinaia di candidati in un unico esperimento.
I fattori di trascrizione possono alterare l’espressione di numerosi geni bersaglio che influenzano una varietà di processi a valle, rendendoli buoni bersagli per le terapie anti-cancro. Tuttavia, il targeting diretto dei fattori di trascrizione è spesso difficile e può causare effetti collaterali negativi se il fattore di trascrizione è necessario in uno o più tessuti adulti. Identificare i regolatori a monte che attivano aberrantei i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali offre un’alternativa più fattibile, in particolare se queste proteine sono facili da sottofare. In questo articolo, descriviamo un protocollo che può essere utilizzato per combinare librerie di lentivirali di media portata in serie e un saggio di reporter trascrizionale a doppia luciferasi per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. Il nostro approccio offre un modo rapido, semplice ed economico per testare centinaia di geni in un unico esperimento. Per dimostrare l’uso di questo approccio, abbiamo eseguito uno schermo di una libreria di RNAi lentivirale con array con diversi regolatori di proteine associate sì (YAP) e co-attivatore trascrizionale con motivo legante PD , due co-attivatori trascrizionali che sono gli effetti a valle del percorso di Ippona. Tuttavia, questo approccio potrebbe essere modificato per lo screening per i regolatori di praticamente qualsiasi fattore di trascrizione o co-fattore e potrebbe anche essere utilizzato per lo screening delle librerie CRISPR/CAS9, cDNA o ORF.
Lo scopo di questo saggio è quello di utilizzare librerie virali per identificare i regolatori di fattori di trascrizione in modo relativamente rapido e poco costoso. L’attività trascrizionale aberrante è associata al cancro e alla metastasi1,2,3,4,5,6, quindi prendere di mira i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali è un promettente approccio terapeutico. Tuttavia, i fattori di trascrizione sono spesso difficili da indirizzare farmacologicamente7 e molti sono necessari per la normale funzione cellulare nei tessuti adulti8,9,10. Puntare sulle vie associate al cancro che attivano aberrante i fattori di trascrizione per guidare la malattia è un approccio più fattibile con il potenziale di avere effetti collaterali meno gravi. La disponibilità commerciale di librerie di RNAi lentivirali e retrovirali con matrice, CRISPR/CAS9, cDNA o ORF consente ai ricercatori di testare l’importanza di numerosi geni in un singolo esperimento. Tuttavia, è necessaria una lettura affidabile per l’attività trascrizionale alterata.
Qui, descriviamo l’uso di un saggio di saggio di prosaggio di un giornalista trascrizionale a doppia luciferasi e di librerie lentivirali di matrice per identificare le proteine che regolano i fattori di trascrizione nelle cellule tumorali. In questo saggio, gli shRNA che colpiscono i geni associati al cancro vengono consegnati alle cellule tumorali dei mammiferi tramite la trasduzione lentivirale e le cellule vengono selezionati per un’integrazione stabile utilizzando la micina. Le cellule vengono successivamente trascate con un costrutto reporter che esprime luciferasi di lucciole guidate da un promotore specifico per il fattore di trascrizione che viene studiato e un costrutto di controllo che esprime Renilla luciferasi da un promotore di vulcaniamente attivo che non risponde al fattore di trascrizione in fase di studio. Dimostriamo questo approccio con uno schermo proof-of-concept per i regolatori di YAP e TA, gli eftrattieri critici a valle del percorso Hippo8,10,11. L’attività anomala di YAP e TAz promuove diversi passaggi della cascata metastatica11 ed è osservata in molti tumori11,12,13. Tuttavia, il modo in cui YAP e TAa diventano attivati aberrantemente in alcune cellule tumorali non è ancora completamente compreso. YAP e TAA non legano il DNA, ma vengono reclutati per promuovere da altri fattori di trascrizione. I membri della famiglia di fattori di trascrizione del dominio TEA (TEAD) sono i principali partner di associazione per YAP e TAA e sono fondamentali per la maggior parte delle funzioni dipendenti da YAP e TAz. Il nostro costrutto reporter esprime luciferasi di lucciole da parte di un promotore yAP/TAz-TEAD-responsive e studi precedenti hanno dimostrato che rileva fedelmente i cambiamenti nell’attività trascrizionale YAP-TEAD2,14,15.
Il nostro approccio è rapido, medio-velocità, e non richiede strutture di screening, robot automatizzati, o sequenziamento profondo di librerie in pool. I costi sono relativamente bassi e ci sono numerose librerie disponibili in commercio tra cui scegliere. Le attrezzature e i reagenti necessari sono relativamente standard nella maggior parte dei laboratori. Può essere utilizzato per lo screening per i regolatori di praticamente qualsiasi fattore di trascrizione se un reporter basato su luciferate esiste o viene generato. Usiamo questo approccio per vagliare gli shRNA nelle cellule tumorali, ma qualsiasi linea cellulare che può essere trasfetata con una ragionevole efficienza potrebbe essere utilizzata con qualsiasi tipo di libreria in serie.
In questo studio, dimostriamo un approccio per lo screening a medio velocità delle librerie virali di serie in combinazione con un saggio di reporter trascrizionale a doppia luciferasi che può essere utilizzato per identificare e testare nuovi regolatori di fattori di trascrizione. È fondamentale caratterizzare e ottimizzare il sistema di reporter per ogni riga di cella prima di qualsiasi schermata. Gli esperimenti dovrebbero essere fatti per confermare che il reporter risponde all’attività alterata del fattore di tr…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Emily Norton e Mikaelan Cucciarre-Stuligross per aver assistito nella preparazione dei vettori shRNA. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una Susan G. Komen Career Catalyst Grant che ha assegnato a J.M.L. (#CCR17477184).
2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |