Summary
为了识别新的转录因子调节器，我们开发了一种使用基于双透明酶的转录报告器测定筛选排列的慢病毒或逆转录病毒RNAi库的方法。这种方法提供了一种快速且相对便宜的方法，在单个实验中筛选数百名候选人。
Abstract
转录因子可以改变许多目标基因的表达，这些基因影响各种下游过程，使它们成为抗癌治疗的良好目标。然而，直接瞄准转录因子通常是困难的，并可能导致不良的副作用，如果转录因子是必要的一个或多个成人组织。识别癌细胞中异常激活转录因子的上游调节器提供了一个更可行的替代方案，特别是如果这些蛋白质容易被药物。在这里，我们描述了一种协议，可用于组合阵列的中等尺度慢病毒库和基于双透明酶的转录报告器测定，以确定癌细胞转录因子的新调节器。我们的方法提供了一种快速、简单且廉价的方法，在单个实验中测试数百个基因。为了证明这种方法的使用，我们执行了一个阵列的慢病毒RNAi库的屏幕，该库包含几个调节器的Yes相关蛋白（YAP）和带PDZ结合图案（TAZ）的转录共活化器，两个转录共激活器，是Hippo通路的下游效应器。但是，这种方法可以修改为几乎所有转录因子或共因子的调节器进行筛选，也可用于筛选 CRISPR/CAS9、cDNA 或 ORF 库。
Introduction
此测定的目的是使用病毒库，以相对快速和廉价的方式识别转录因子的调节器。异常转录活性与癌症和转移11、2、3、4、5、62,3,4,5,6相关，因此靶向癌细胞中的转录因子是一种很有前途的治疗方法。然而，转录因子往往难以瞄准药理学7和许多需要正常细胞功能在成人组织8，9，10。9,108靶向癌症相关途径，异常激活转录因子驱动疾病是一种更可行的方法，有可能有不太严重的副作用。阵列慢病毒和逆转录病毒RNAi、CRISPR/CAS9、cDNA或ORF库的商业可用性使研究人员能够在单个实验中测试许多基因的重要性。但是，需要为更改的转录活动进行可靠的读出。
在这里，我们描述了使用基于双透明酶的转录报告器测定和排列的慢病毒库来识别调节癌细胞转录因子的蛋白质。在此测定中，针对癌症相关基因的shRNA通过慢病毒转导输送到哺乳动物癌细胞，并且选择细胞使用紫杉霉素进行稳定整合。细胞的下一个转染与一个记者构造，表达萤火虫透明酶驱动特定到被调查的转录因子和对照结构，表达雷尼拉透明化从一个产生活性的促进剂，对被调查的转录因子不响应。我们演示了这种方法，为YAP和TAZ的监管机构提供了概念验证屏幕，这是Hippo通路8、10、1110,的关键下游8效应器。11YAP和TAZ的异常活动促进转移级联11的几个步骤，并观察到在许多癌症11，12，13。11,12,13然而，YAP和TAZ如何变得异常激活在一些癌细胞还没有完全了解。YAP 和 TAZ 不绑定 DNA，而是通过其他转录因子招募给促进者。TEA 域 （TEAD） 转录因子系列的成员是 YAP 和 TAZ 的主要绑定合作伙伴，对于大多数 YAP 和 TAZ 相关函数至关重要。本报记者从YAP/TAZ-TEAD反应促进器中构建了萤火虫荧光酶，以往的研究表明，它忠实地检测了YAP-TEAD和TAZ-TEAD转录活动22、14、1514,15的变化。
我们的方法快速、中等吞吐量，不需要筛选设施、自动化机器人或池库的深层测序。成本相对较低，有许多商业上可用的图书馆可供选择。在大多数实验室中，所需的设备和试剂也相对标准。如果存在或生成基于荧光酶的分录器，它可用于筛选几乎任何转录因子的监管机构。我们使用这种方法在癌细胞中筛选shRNA，但任何能以合理效率转染的细胞系都可以用于任何类型的阵列库。
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Protocol
注： 该协议的原理图摘要如图1所示。
1. 伦迪病毒病媒库制备
注：演示的屏幕使用在 96 孔板中作为甘油库存购买的阵列 shRNA 库，但库也可以根据候选列表手动组装。应考虑适当的控件并将其包含在任何库中。这包括非目标控制shRNA（shNTC），一种针对被调查的转录因子的控制shRNA，如果可能的话，一个针对萤火虫荧光酶的shRNA。
- 在96孔深井板的每个孔中加入1.3毫升的Luria溴酸（1%巴托-特里普顿，0.5%酵母提取物，1%NaCl，pH 7.5），含有100微克/mL的安曲霉素。用2 μL的甘油库存接种每口井，并在37°C下生长，在225 rpm时持续搅拌。
- 将每种细菌培养物转移到1.5mL离心管中，在4°C下以21，000 x g的离心将细菌颗粒10分钟。
- 按照制造商的协议，使用细菌迷你制备套件净化每个矢量。
- 使用分光光度计确定每个矢量的浓度。
- 将质粒储存在-20°C。
注： 协议可以在这里暂停。
2. 阵列慢病毒库的包装
注：所有涉及扁病毒的工作，包括包装、感染和随后对受感染细胞的培养，都应严格遵守机构生物安全规则和规定。
- 使用完整的生长介质（Dulbecco的改良鹰中（DMEM）含有4 mM L-谷氨酰胺、4，500毫克/L葡萄糖和丙酮钠，辅以10%的胎儿牛血清（FBS）、100单位/mL青霉素、100微克/mL链球菌素抗生素和2 mM L-谷氨酰胺。
- 对于从步骤 1.4 开始库中的每个矢量，用 1 x 105 293FT 细胞播种一个 24 井。
注：建议在继续步骤3（见下文）之前，包装控制病毒载体的一些额外井，并用于测试病毒的定位器。 - 在37°C下孵育细胞，24小时用5%的CO2孵育。
注：以前描述的用于包装扁病毒的一般协议已缩减为24口。它使用psPAX2进行慢病毒包装，VSVG作为涂层蛋白。如果需要益智病毒，可以使用提供 Eco 的载体来代替 VSVG。强烈建议此协议经过优化，以实现病毒性点分器，使目标细胞的感染效率在 30%-70% 之间（请参阅讨论）。有关使用的所有矢量的列表，请参阅补充表 1。 - 设置步骤 1.4 中的每个病毒载体的转染混合物，如下所述。每次转染应包含250纳克的病毒载体，125纳克psPAX2，125纳克VSVG，1.25μL转染试剂1和23.75μL转染缓冲液（见材料表）。
- 用无核酸水将每个慢病毒载体稀释至50纳克/μL，然后将5μL（250纳克）转移到96孔PCR板的井中。
- 通过混合转染试剂1和23.75 μL ×X的预加热转染缓冲液1.25 μL×X，使转染超级混合，其中"X"是转染的总数，再加上几个额外的，以考虑到移液过程中的体积损失。
- 在室温下孵育转染超级混合物5分钟。
- 添加 125 ng = X psPAX2 和 125 ng = X VSVG 的转染超级混合管从步骤 2.4.3 和轻轻地移液向上和向下混合。快速继续步骤 2.4.5。
- 立即将步骤 2.4.4 中的混合物分出到 PCR 条的每个管中，然后使用多通道移液器将 25 μL 混合物从步骤 2.4.1 转移到每个含有病毒载体的井中。
- 在室温下孵育20分钟。
- 从步骤 2.4.6 将每个 96 井中的所有 30 μL 转移到包含步骤 2.3 的 293 FT 细胞的 24 井的井中。
- 在37°C下用5%的CO2孵育细胞，24小时，然后用500μL的新鲜完整生长介质替换24孔板每个孔中的介质。在37°C下孵育细胞，再孵育5%的CO2，再孵育24小时。
- 使用多通道移液器，从每个井收集病毒上清液和从220 μL（足够1感染步骤3加上一些额外的体积）到两个96井每个。这些是阵列病毒上清板。
- 将阵列病毒上清板储存在-80°C。
注： 协议可以在这里暂停。还建议在继续步骤 3 之前测试一些被包装在要感染的细胞上的附加控制病毒（见上文）。这是为了确保手足之力足以达到至少30%的感染效率。
3. 屏幕细胞感染
注：人类黑色素瘤细胞（A375）被用来证明这种方法，但这种方法可以应用于任何感染扁病毒的粘附细胞。但是，细胞培养和电镀条件应针对每个细胞系进行优化（请参阅讨论）。
- 展开细胞以在完全生长介质中感染。
- 种子24孔板与1 x 105细胞在0.5ml的完整生长介质每孔。种子一井，每个病毒载体进行测试（包括控制），并包括一个额外的井，不会被感染，将作为在步骤3.7的药物选择的控制。
- 在37°C下孵育细胞，24小时用5%的CO2孵育。
- 感染每一个井从步骤3.2与一个不同的病毒上清，从冷冻阵列扁病毒上清液如下。
- 制备含有20微克/mL聚苯乙烯的完整生长介质。
- 将阵列的慢病毒库超子体从步骤 2.7 解冻到室温。
- 从步骤 3.2 中吸出 24 孔板的生长介质，并立即在每个孔中添加 200 μL 的含聚苯乙烯生长介质。
- 使用多通道移液器，从步骤 3.4.3 将每 96 口病毒上清液从步骤 3.4.2 转移到 24 口。
- 在37°C下孵育细胞，24 - 48小时用5%的CO2孵育细胞。
注：某些细胞系可能需要超过 24 小时才能表达 shRNA 并产生抗紫霉素。此处使用的病毒载体在3'UTR的puroR中提供一种涡轮-GFP-IRES-puroR，其基于miR30的shRNA（图1）。通过绿色荧光蛋白监测紫霉素抗药性基因和shRNA的感染效率和表达。 - 制备含有2.5微克/mL紫霉素的完整生长介质。
注：紫杉醇素的选择浓度因细胞系而异。建议对屏幕前要测定的每个细胞行执行抗生素杀灭曲线。 - 从每个井中吸出介质，代之以500μL的含紫霉素的完整生长介质。
注： 一定要也添加紫霉素到控制非受感染的井，可用于后续步骤，以确保紫霉素的选择完成。 - 在37°C下孵育细胞，5%CO2，48小时。
注：最好选择48小时，因此电镀密度和病毒定位应优化，使细胞在48小时之前不会过度收缩。 - 确保受感染的细胞在荧光显微镜下是绿色的，并确保控制未感染的细胞在继续步骤 4 之前全部死亡。"
4. 用于转染双透明酶的种子细胞记者
注：应进行测试转染，以确定每个新细胞系的最佳播种密度。
- 从步骤 3.9 中尝试每个孔，并在新 24 孔板上的相应位置将大约 1 x 105个单元转移到孔中，如下所示。
注：该协议旨在筛选具有数百个 shRNA 的库，因此无法对受感染细胞的每个井进行计数。因此，以下步骤用于估计每个孔中的细胞数，以帮助确保大致相等的电镀密度。- 将步骤 3.9 中的井组为 3 - 4 组，使组中的所有井具有相似的细胞密度。
- 在37°C下，每组有1个代表，每组有200μL的胰蛋白酶-EDTA（1x PBS补充0.5mM EDTA和0.1%胰蛋白酶），5分钟。然后加入含有完整生长介质的400μL的紫霉素，从而中和胰蛋白酶-EDTA。
- 对每个代表进行计数，以确定总细胞数，并使用完整的生长介质将每个代表的细胞悬浮液稀释至2 x 105细胞/mL。
- 从步骤 4.1.3 到新 24 孔板上的相应位置，将每个孔的 0.5 mL（1 x 10 5 细胞）的种子（1 x 105细胞）孵育到新的 24 孔板上，并在 37 °C 下孵育出此新的 24 孔板，24 小时孵育 5% CO2。
- 对于步骤 4.1.1 中的每个组，使用步骤 4.1.3 中确定的总细胞数计算胰蛋白酶-EDTA 添加到每个孔的体积，以便生成的细胞悬浮液为 1 x 106细胞/mL。
- 将适当的胰蛋白酶-EDTA体积添加到每口井中，并在37°C下孵育5分钟。
注：对于更大的屏幕，建议对24孔板进行试晒和重新镀以组，而不是一次重新镀，以确保细胞的可行性。 - 在上述孵化过程中，使用多通道移液器将400μL的含紫霉素的完整生长介质添加到新24孔板的相应孔中。
- 将100 μL的细胞悬浮液（约1 x 105细胞）从每个孔转移到步骤 4.1.7 中准备的新 24 孔板上的相应位置。
- 步骤 4.1.1.1 的所有板（一次一个板）对所有分组井板重复步骤 4.1.6 到 4.1.8。
- 在37°C下孵育细胞，24小时用5%的CO2孵育。
5. 转染双透明酶记者
- 从步骤 4.2 转染每个井与双透明酶报告构造如下。
注：在开始此测定之前，应确定用于控制雷尼拉透明酶载体的DNA总量和萤火虫透明酶报告载体的最佳比率。在这里，400纳克的DNA混合物，包含20部分萤火虫透明酶记者和1部分控制雷尼拉透明拉。- 通过将每种试剂的指定体积混合（表1），使转染稀释混合物（管A）和报告稀释混合物（管B）乘以转染总数（外加几个额外）。
注：此协议针对转染试剂 2 进行了优化（参见材料表）。如果使用不同的转染试剂，则应在此步骤之前优化转染。 - 将转染稀释混合物（管A）与记者稀释混合物（管B）混合，在室温下孵育15分钟，产生转染混合物。
- 在上述孵育过程中，用0.25 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）从步骤4.2冲洗每个24口，并在每个井中加入447μL的完整生长介质。
- 孵育15分钟后，使用多通道移液器将53μL的转染混合物分配到24孔板的每个孔中。
- 通过将每种试剂的指定体积混合（表1），使转染稀释混合物（管A）和报告稀释混合物（管B）乘以转染总数（外加几个额外）。
- 在37°C下孵育细胞，24小时用5%的CO2孵育。
6. 双透明酶活性的量化
- 使用板读取器和双透明酶报告器测定套件测量荧光酶活性，如下所述。
注：此协议针对指示的分料分析套件（参见材料表）进行了优化，并遵循制造商的建议协议。- 通过稀释 5x 无源式水解缓冲液（套件中提供）1 至 5 次，为所有井准备足够的 1x 无源水解缓冲液，外加几个额外的（每口井需要 75 μL）。此外，解冻试剂A和试剂B缓冲液（在套件中提供，每个井需要100μL）。
- 从步骤 5.2 中从 24 孔板的每个孔中吸出介质。
- 在每个井中加入 75 μL 的 1x 无源滑水器缓冲液，并在室温下孵育 30 分钟，偶尔摇动。
- 通过用解冻试剂 B 缓冲液稀释 50x 试剂 B 基板（套件中提供）1：50 制备试剂 B。
- 将 30 μL 的 1x 无源式集液缓冲液添加到 4 口中进行消隐（参见补充表 2）。
- 从步骤 6.1.3 将 30 μL 的落除剂转移到 96 孔平底白色测定板的重复孔中。
- 使用多通道移液器将 50 μL 的试剂 A 添加到每个孔中，并使用板读取器读取萤火虫荧光酶信号。
- 使用多通道移液器将步骤 6.1.4 中的 50 μL 试剂 B 添加到每个孔中，并使用板读取器读取Renilla Luciferase 信号。
- 按照如下方式处理原始数据（有关详细说明，请参阅补充表 2）。
- 排除具有极低的Renilla luciferase信号的样品，因为低值表明病毒构造是有毒的，或者被检测的转染细胞太少。
注：正如讨论中所述，显著"低"的雷尼拉透明酶信号可导致异常结果。在这里，排除了雷尼拉荧光酶信号低于平均值1个标准差的井（见补充表2）。这是基于以前在这些细胞14中使用这个报告系统进行的研究，但可能不同于其他细胞系。 - 将每口井的原始萤火虫透明酶值与同一井的原始雷尼拉透明酶值标准化，以获得萤火虫/雷尼拉比。
- 平均所有复制控制井的萤火虫/雷尼拉比率，然后将其他油井的萤火虫/雷尼拉比率除以该数字，以获得折数变化。
- 分配控制样本并将其萤火虫/雷尼拉比值设置为 1。
- 使用标准差对重复井的萤火虫/雷尼拉比率和绘图平均。
注： 标准差不用于统计分析，而是用作识别复制物显著差异的井的一种方法。
- 排除具有极低的Renilla luciferase信号的样品，因为低值表明病毒构造是有毒的，或者被检测的转染细胞太少。
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Representative Results
我们的YAP/TAZ-TEAD记者构造 （pGL3-5xMCAT （SV）-492，,14，,15） 包含一个最小的SV-49启动器与5个重复的规范TEAD结合元素 （MCAT）15驱动萤火虫透明酶基因 （图1）。它与PRL-TK控制载体（Promega）一起被共转入细胞中，后者表示来自产生活性HSV TK促进剂的Renilla luciferase（图1）。确保 YAP/TAZ-TEAD 报告器构造在测试的单元行中按预期进行至关重要。因此，我们首先将PRL-TK和pGL3-5xMCAT（SV）-49共转送到A375细胞中，稳定地表示控制向量、高活性LATS不敏感的YAP（YAP2SA）突变体或YAP2SA的突变体无法绑定TEAD（YAP2SA，S94A）。不出所料，萤火虫荧光酶活性由YAP2SA显著增加，但对照向量或YAP2SA、S94A（图2A）没有显著增加。这表明YAP以与TEAD相关的方式增加了YAP/TAZ-TEAD记者的活动。重要的是，YAP2SA没有显著改变雷尼拉透明酶的水平。作为附加控件，我们还确认 YAP2SA不会改变缺少 MCAT TEAD 绑定元素的最小启动器构造的活动（图 2B）。
还进行了第二次控制实验，其中A375细胞感染了病毒构造，这些结构提供非靶向控制shRNA（shNTC）或具有串联YAP和TAZ shRNA的构造。经过稳定选择，细胞与PRL-TK构造和YAP/TAZ-TEAD报告器构造或最小启动器构造共转。在与YAP/TAZ-TEAD记者构造的细胞中，YAP/TAZ shRNA显著降低了萤火虫荧光酶水平，但控制shNTC没有（图2C）。萤火虫荧光酶水平没有改变的shNTC或YAP/TAZ shRNA在细胞转染与最小的促进剂（图2C）。与上述结果一致，每个井中的Renilla信号也没有被控制shNTC或YAP/TAZ shRNA（图2C）显著改变，进一步表明PRL-TK控制构造对YAP或TAZ没有响应。总之，这些实验表明，在A375细胞中，报告系统的行为与先前使用这些载体22、1414的研究是一致的。
作为概念实验的证明，我们在A375细胞中筛选了一个小的慢病毒shRNA库。我们的测试库包含 shRNA，这些基因以前显示用于调节其他细胞类型的 YAP/TAZ 功能。然而，其中几个基因在黑色素瘤中YAP和TAZ的调节中的作用是未知的。我们的库包括YAP/TAZ活动所需的基因，如RAF1、MDM2、PIK3CA、MAPK8、PAK4、EZH2、PDK1、ERBB4和CCNE2 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29。16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30，,31，,32，,33，,34，,35，,36，,37，,38，和基因预测抑制YAP/TAZ活性， 如CSK， ERBB2， ATM， CDH1， Gelsolin （GSN）， PTEN， ATR， 和 RB139，,40，,41，,42，,43，,44，, 45,45，46，47，48，49，50，51，52，53，54。46,47,48,49,50,51,52,53,54作为对照，我们包括串联YAP/TAZ shRNA14，非靶向控制shRNA（shNTC），和一个shRNA瞄准Src，我们之前显示，这是A375细胞14中最大YAP/TAZ活性所必需的。
此屏幕的原始数据和分析显示在补充表 2中。几个 shRNA（shPDK-1、shMDM2-1、shMDM2-2、shPAK4、shMAPK8-1 和 shMAPK8-2）显著降低了雷尼拉荧光酶信号相对于所有井的平均Renilla信号，这表明这些 shRNA 导致 A375 细胞中的细胞毒性。事实上，这些井在测定时细胞明显减少（未显示）。这使得很难区分可能调节YAP/TAZ的候选人和细胞生存所必需的候选者。因此，这些样本的结果被排除在进一步的数据分析之外。正如预期的那样，针对 YAP 和 TAZ 或 Src 的 shRNA 显著减少了 YAP/TAZ-TEAD 活动（图 3）。与公布的工作表明，PIK3CA促进YAP和TAZ活动21，26，31，我们发现，shRNA针对PIK3CA降低标准化萤火虫荧光酶水平。21,26,31以ATM、CDH1、CSK、ERBB2、GSN为目标，每个都增加了标准化的萤火虫荧光酶水平，这与已发表的研究表明，这些蛋白质抑制YAP和/或TAZ 39、41、42、43、45、46、47、48、50、51、53、5439,41,42,43,45,46,47,48,50,51,53,54.,尽管在其他细胞类型,27、28、35、36、38、49中建立了ATR、CCNE2和ERBB4的作用，但针对这些基因的shRNA并没有显著改变A375细胞中的标准化萤火虫荧光酶水平。27,28,3538,4936针对EZH2和RB1的shRNA显示，对萤火虫荧光酶水平的影响与基于其他细胞类型32、34、40、5234,40,52的研究相反。32PTEN 和 RAF1 都是两个不同的 shRNA 的目标，对荧光酶活性有相反的影响。与先前研究不一致的结果可以表明，这些蛋白质对YAP/TAZ-TEAD功能的影响与细胞类型相关;然而，它也可能是由于低的击倒效率或一些shRNA的偏离目标效应。作为 n = 1"盲"屏幕，也会预期会有一些误报和假阴性。如讨论中更详细地讨论的那样，还需要使用其他检测进行其他验证实验，例如由 YAP 和 TAZ 调节的基因的 qPCR 和影响 YAP/TAZ 函数的后翻译修饰的西方印迹。这种验证还包括确认哪些 shRNA 有效地击倒了感兴趣的蛋白质。还必须注意，由于我们的记者对TEAD反应灵敏，我们屏幕识别的任何基因都可能影响TEAD，而不是直接影响YAP和TAZ。后续的机械研究将需要确定是YAP和/或TAZ还是识别的蛋白质正在调节的TEAD。然而，YAP和TAZ是TEAD介导转录的主要驱动因素，因此这些基因中的大部分可能是调节YAP和TAZ的。事实上，如上所述，大多数在屏幕中击中的shRNA都针对直接调节YAP和/或TAZ的蛋白质。
图 1：工作流的原理图。该协议的关键步骤用与协议中的数字对应的步骤编号进行总结。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：优化YAP/TAZ-TEAD双透明酶转录报告系统。（A） A375 细胞稳定地表示控制向量 （MSCV-IRES-Hygro）、LATS 不敏感 YAP （YAP2SA）或 LATS 不敏感 YAP 无法绑定 TEAD（YAP2SA，S94 A） 与 PRL-TK （Renilla） 和 pGL3-5xMCAT （SV）-49 （YAP/TAZ-TEAD 报告器） 构造和荧光酶信号在 24 小时后测量。n = 7 个独立实验。（B） A375 细胞与 YAP2SA或控制向量、PRL-TK 构造以及 pGL3-5xMCAT （SV）-49 构造或 pGL3 （SV）-49 构造（最小倍子）和荧光酶信号共转 24 小时后进行测量。n = 1 个四边形转染的实验。（C） A375细胞被感染逆转录病毒编码非靶向控制shRNA （shNTC） 或串联 YAP 和 TAZ shRNA （shYAP/TAZ）。经过稳定选择，细胞与PRL-TK结构共同传递，24小时后测量了pGL3-5xMCAT（SV）-49构造或pGL3（SV）-49构造和荧光酶信号。n = 4个独立的感染;统计显著性是使用单向ANOVA确定的，然后是图基的多重比较测试;n.s. = p>0.05， = p<0.05， = p<0.01， = p<0.0001。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 3：有代表性屏幕的结果。每个向下矢量的结果与 shNTC 进行比较，并作为折叠差表示。条形图显示萤火虫透明酶/雷尼拉透明酶比 = 标准差的平均值。n = 1 个实验。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 管 A = 转染稀释 | |
| 试剂 | 体积 |
| 转染缓冲器 | 每个反应 25 μl |
| 转染试剂 2（添加秒） | 每个反应 1.5 μl |
| 管 B = 记者稀释 | |
| 试剂 | 体积 |
| 转染缓冲器 | 每个反应 25 μl |
| 20：1 萤火虫透明拉塞记者： 控制雷尼拉混合 （添加第二） | 每个反应 400 纳克 |
| 转染试剂 3（添加第三个） | 每个反应 1 μl |
| 总计：每个反应26.5μl | |
表1：转染组合的准备。对于24孔板每个孔的转染，转染试剂2的1.5μL被稀释成25μL的转染缓冲液，以产生转染稀释（管A）;而400 ng的20：1萤火虫荧光酶记者：控制Renilla混合和1μL转染试剂3被稀释成25μL的转染缓冲液，产生记者稀释（管B）。
| 现有/购买/礼品矢量 | |
| 向量 | 源 |
| GIPZ人类shRNA慢病毒载体 | 通用电气医疗保健 |
| VSVG | 海恩斯实验室 [2] |
| psPAX2 | 加金 （#12260） |
| 加格/波尔 | 加金 （#14887） |
| pGL3-（SV）-49 | 伊因·法伦斯 [15] |
| pGL3-5xMCAT（SV）-49 | 伊因·法伦斯 [15] |
| PRL-TK | 普罗梅加 |
| MSCV-IRES-海格罗 | 拉马尔实验室 [2] |
| MSCV-YAP-S127A，S381A-IRES-Hygro | 拉马尔实验室 [2] |
| MSCV-ZSGreen-2A-普罗-hYAP7/hTAZ3 | 拉马尔实验室 [14] |
| 新矢量 | |
| 向量 | 源骨干 |
| MSCV-YAP-S94A，S127A，S381A-IRES-Hygro | MSCV-IRES-海格罗 |
补充表 1：矢量表。使用的所有向量都列出，并介绍了新的矢量。标准分子生物学技术被用来产生新的载体。
补充表2：路西抹酶测定数据分析。shRNA 库的排列图显示在第一个表中。第二和第三个表分别显示原始萤火虫和雷尼拉荧光酶信号。黄盒中指示所有井的Renilla luciferase 信号的均值和标准偏差。具有雷尼拉透明酶信号低于平均值 1 个标准差的井用红色文本突出显示，并排除在进一步分析之外。每个井的萤火虫/雷尼拉比是通过将原始萤火虫透明酶信号除以原始雷尼拉透明酶信号（第四表）获得的。然后，每口井的萤火虫/雷尼拉比值标准化为控制（shNTC）井的平均萤火虫/雷尼拉比（第五表）。重复的井是每个构造的下一个平均值，并计算标准差（第六表）。请点击此处查看此表（右键单击以下载）。
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Discussion
在这项研究中，我们演示了一种将基于双透明酶的转录器检测方法结合在一起，用于识别和测试新的转录因子调节器的中通量筛选方法。在任何屏幕之前，对每个单元行的分型和优化报告系统至关重要。应进行实验，以确认报告者对正在调查的转录因子的活动变化有反应，并且应对照对照载体测试活动变化程度。PRL-TK构造与报告器构造的共转导非常重要，因为它有助于控制与报告器一起转染的细胞数和报告器构造的拷贝数，这两种结构都能改变荧光酶信号的大小。优化实验还应确保转录因子不影响组成Renilla构造或最小启动器构造的活动，因为这可能会使结果的解释复杂化。还应仔细考虑要包含在库中的控件。该协议是为具有数百个 shRNA 的库的"盲屏"而设计的，在其中无法确认每个 shRNA 的有效击倒。因此，一些误报和负数是可能的。增加屏幕中的技术和/或生物复制数量有助于减少误报和阴性数。然而，这也将大大增加水井的数量，并因此进行测定，因此应小心谨慎，确保这不会导致文化条件不理想（见下文）。减少误报和负数的另一种方法是在同一细胞线或其他细胞线中重复整个屏幕，或者筛选较小的库，包括仅使用 3 个生物复制的"命中"。在所有情况下，任何命中都应使用除报告器以外的读出进行验证，例如已知目标基因的 qPCR。在这些验证步骤中，还应确认靶向基因的有效敲除。不应对 shRNA 的结论，除非 shRNA 得到确认，否则不会改变活性。验证实验还应确保所调查的转录因子是由靶向基因调节的，并且这些基因不会影响Renilla或最小启动器结构。
优化每个细胞系的细胞培养条件也很重要，以避免不优条件，如过度汇合、细胞太少、细胞活力差或可变增殖能力。细胞播种密度在双透明酶报告器构造（步骤5）和测量报告器活动（步骤6）时尤为重要。转染效率可能因细胞密度而显著变化，如果只对细胞群的一小部分进行测定，则转染效率低会导致异常结果。大多数测试的细胞系在40-60%汇合时表现出最高的转染效率，但建议使用提供荧光蛋白的载体针对给定的细胞系优化转染条件和播种密度。难以感染和/或转染的细胞系，如原细胞可能不适合此屏幕。差的记者转染效率或细胞生存能力差通常会导致极低的Renilla luciferase信号。但是，应进行试验性实验，以确定细胞线的Renilla luciferase 信号的范围。重要的是，阵列库产生的病毒的度位足够高，在被检测的细胞系中至少具有30%的感染效率。感染效率可能有很大差异，有几个因素会影响病毒性山位。所使用的病毒超清量应针对每个细胞系进行优化，如有必要，可以进一步优化步骤 2 以提高病毒定点。
细胞密度和细胞活力也会影响调节转录因子的细胞通路活动，因此，为报告转染播种细胞至关重要，因此在读取双荧光酶测定的当天，细胞均处于相似的密度（步骤6）。确保细胞均匀地粘附在井上，而不是聚集在中心密集的斑块中也很重要。如上所述，Renilla luciferase 信号从井到好的重大变化可能会导致难以解释的数据。与所有其他油井相比，最好排除显示雷尼拉荧光酶信号显著减少的井，因为这表明病毒载体正在降低细胞生存能力，或者该井的转染效率非常低。在这里，我们排除了比平均Renilla luciferase信号大于1个标准差的井，但应进行优化实验，以确定每个细胞线的适当截止值。通过改变被测定的转录因子的活性，降低细胞生存能力的shRNA也可能因此发生。如果这是一个问题，可以减少雷尼拉荧光酶信号的shRNA可以使用可诱导的shRNA或其他测定进行重新测试。限制胰蛋白酶化后粘附细胞处于悬浮状态的时间也至关重要。在细胞试制和播种过程中，对大多数步骤使用多通道移液器，对于较大的屏幕，分批使用板。此外，最好限制细胞感染与记者测定之间的时间。如果被测定的转录因子调节细胞增殖或存活，这一点尤其重要。在这种情况下，具有有效击倒的细胞将被效率较低的细胞竞争。
对所述协议进行若干修改是可行的。如果生成基于荧光酶的分录器，这种方法可以有效地用于识别任何转录因子的调节器，并且对于许多最常见的转录因子，报告器构造已经存在。可以修改该协议，以使用各种市售或手动组装的库，包括 RNAi、CRISPR/CAS9、ORF 或 cDNA。事实上，我们以前使用类似的策略来测试一个小型的cDNA库为YAP/TAZ监管机构14。库可以使用逆转录病毒、扁病毒、腺病毒或瞬态转染进行传递。这里使用的病毒涂层蛋白（VSVG）产生具有人体传染性的扁病毒。如果使用啮齿动物细胞，需要非人类传染性生态热带病毒，可以使用提供Eco涂层蛋白的载体代替VSVG。
其他方法可用于筛选转录因子的调节器的库。访问高通量筛选设施将允许以自动化方式筛选规模大得多的图书馆。同样，全基因组屏幕也可以使用具有深度测序的池库来完成，作为识别"命中"的手段。然而，这两种方法都需要许多研究人员无法使用的设备，高通量筛选或深度测序的费用可能高得令人望而却步。此外，池屏需要使用荧光报告器或其他方式对细胞进行排序，以丰富显示转录活动所需变化的细胞。使用基于双透明酶的转录机检测对大型阵列表达库进行筛选，以前已经使用台式机器人55进行筛选，但并非所有研究人员都可以使用。相比之下，此处描述的方法快速、中等通量、相对便宜，并且使用大多数调查人员可能都能访问的设备和试剂。该方法可以在单个实验中揭示多个稳压器，这是一种经济高效且方便的方式，可以发现转录因子上游的潜在监管途径。
在所述方法中，候选基因被稳稳地击倒，然后经过选择，报告人构造被暂时地转化为细胞。然而，许多细胞系的转染效率较差，可引入变异性，引起细胞毒性。改进的替代方法是，将记者构造整合到感兴趣的细胞系的基因组中，然后用病毒库感染检测细胞进行筛选。这种改进将减少暂时转染带来的变异性，并防止由于感染后培养的延长而转录因子活动的任何潜在变化。如上所述，使用小型台式机器人将大大简化流程，并增加可筛选的库的大小。另一个相当大的变化是使用阵列的可诱导向量库，这将降低选择具有更有效的敲击功能的细胞的可能性，并减少细胞生存能力变化引起的变异性。
阻碍有效治疗许多癌症的重大挑战是肿瘤细胞获得对最有效的靶向疗法的抗药性。识别这种治疗耐药性所需的蛋白质是改善患者结果所必需的。所述方法可以很容易地与靶向治疗相结合，揭示导致对这些化合物的敏感性或抵抗力增加的基因。这种方法今后的另一个潜在应用是使用这种阵列筛选来组合测试候选治疗靶点。为此，细胞将感染两个病毒载体，每个病毒载体的目标是识别对转录因子活性有协同作用的蛋白质。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢艾米莉·诺顿和米凯拉·库恰尔-斯图利格罗斯协助制备shRNA载体。这项工作得到了苏珊·科门职业催化剂赠款的部分支持，该赠款授予了J.M.L.（#CCR17477184）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin - 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin - 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone - powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA - 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol - 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum - 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine - 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water - 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl - powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin - 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract - powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
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