微生物の挙動を研究するための制御された動的化学景観の生成
Summary
マイクロ流体およびミリ流体のセットアップ内の光の解析による動的化学景観の生成のためのプロトコルが提示されます。この方法論は、単一細胞および集団レベルの両方で、運動行動、栄養取り込み、または微生物の化学物質への適応を含む多様な生物学的プロセスを研究するのに適している。
Abstract
マイクロスケールで局所的な化学誘起物質が突然利用可能になる制御された動的化学パルスの生成方法を実証し、微生物走化実験のためのマイクロ環境を作り出す。化学パルスを作製するために、細菌懸濁液を含むポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体室内でカゲアミノ酸を光分解することで、ほぼ瞬時にアミノ酸源を導入するシステムを開発しました。この方法を走化細菌、ビブリオ・オルダリに応用し、ビデオ顕微鏡で追跡しながらこれらの動的化学勾配を積極的に登ることができる。アミノ酸は、フォトリムーバル可能な保護基による化学的修飾によって生物学的に不活性(‘caged’)をレンダリングし、懸濁液中に均一に存在するが、ほぼUV-A焦点を当てたLEDビームによって時間と空間のユーザー定義のポイントで発生する突然の放出まで消費できない。パルスで放出される分子の数は、光分解後の吸収スペクトルがUV-Vis分光法を用いて特徴付けられる露光時間と非定率との間の較正関係によって決定することができる。ナノ多孔性ポリカーボネート(PCTE)膜をマイクロ流体デバイスに組み込み、解毒された化合物および使用済み培地の流れによる連続的な除去を可能にすることができる。PCTE膜とPDMSマイクロ流体構造との間の強く不可逆的な結合は、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)の溶液で膜をコーティングし、続いて結合する表面のプラズマ活性化によって達成される。コンピュータ制御システムは、異なる場所で異なる強度を持つパルスのユーザー定義シーケンスを生成し、所定の空間的および時間的変動性を持つリソース景観を作成することができます。各化学環境において、個々のスケールでの細菌の動きのダイナミクスと集団レベルでの蓄積を得ることができるため、化学戦術性能の定量化と、生態学的に関連する環境における細菌凝集への影響が可能になる。
Introduction
微生物は、化学勾配を検出し、応答1で運動性を改変するプロセスである化学化学軸に依存して、化学景観をナビゲートし、栄養源と宿主にアプローチし、有害物質を脱出します。これらのマイクロスケールプロセスは、微生物とその環境2、3との間の相互作用のマクロスケールの動態を決定する。ソフトリソグラフィ4を含むマイクロ流体技術および微細加工技術の最近の進歩は、微生物の相互作用を研究する制御された微小環境を作り出す能力に革命をもたらしています。例えば、過去の実験では、高い栄養素濃度5、6の中間体から高い栄養濃度の高い制御、安定した勾配を生成することにより、細菌の走化を研究してきた。しかし、自然環境では、マイクロスケールの化学勾配は、分子拡散によって消失する短時間で、背景条件は高度に希釈されることが多い7である。微生物集団の化学化学反応を直接測定するために、微生物が自然界で遭遇する勾配を模倣し、微小流体技術と光流動を組み合わせる方法を考案し、ここで説明しました。
アンセジング技術は、生体分子を非アクティブな形で機能的にカプセル化する光感受性プローブを採用しています。照射は、ケージ分子を放出し、生物学的プロセスの標的摂動を可能にする8。細胞化学の迅速かつ正確な制御のために9,ケージ化合物の光分化は、伝統的に遺伝子 10 の活性化を研究する生物学者、生理学者や神経科学者によって採用されています10,イオンチャネル11,ニューロン12.最近では、科学者たちは、光化の重要な利点を利用して走化性13を研究し、段階的な化学誘引刺激刺激物14、15にさらされた個々の細菌細胞のフラグラスイッチングダイナミクスを決定し、3次元(3D)勾配16における単一精子細胞の運動パターンを調査した。
我々のアプローチでは、マイクロ流体デバイス内でケージアミノ酸の光分化を実施し、光放出を通じてほぼ瞬時に入手可能になる制御された化学パルスに対する細菌集団の行動応答を研究する。低倍率(4倍)目標(NA = 0.13、焦点深度約40μm)を使用することで、大視野(3.2 mm x 3.2 mm)にわたる数千もの細菌の集団レベルの凝集応答を観察し、単一細胞レベルでの運動の測定を可能にします。この方法の2つの用途を提示する:1)均一な条件から始まる細菌の蓄積−放散ダイナミクスを研究するための単一の化学パルスの放出、および2i)時間変動、空間的に不均一な化学誘引条件下での細菌蓄積ダイナミクスを特徴付ける複数のパルスの放出。この方法は、アミノ酸グルタミン酸17に向かって走化を行う海洋細菌ビブリオダリに対して試験されているが、この方法は、種および化学誘引物質の異なる組み合わせ、ならびに化学原性を超える生物学的プロセス(例えば、栄養取り込み、抗生物質暴露、クォーラムセンシング)に広く適用可能である。このアプローチは、現実的な環境における微生物の生態と挙動を解明し、一時的な動的勾配をナビゲートする際に個々の細菌が直面する隠れたトレードオフを明らかにすることを約束します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法により、研究者はマイクロおよびミリ流体デバイスの制御された動的勾配の下で細菌の走化を研究することができ、再現性のあるデータ収集を可能にする。光彩によるマイクロスケールでの化学パルスのほぼ瞬時の生成は、細菌が野生で遭遇する栄養パルスの種類を、例えば、沈没海洋粒子25の背後にあるプルームの拡散拡散、または、毛状細胞細胞26…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ETHチューリッヒのFIRST微細加工施設に感謝している。この研究は、オーストラリア研究評議会創立早期キャリア研究者賞DE180100911(D.R.B.へ)、ゴードンとベティムーア海洋微生物イニシアチブ調査官賞GBMF3783(R.S.へ)、スイス国立科学財団助成金によって支援されました。1-002745-000 (R.S.へ)。
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
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