Generera kontrollerade, dynamiska kemiska landskap för att studera mikrobiell beteende
Summary
Ett protokoll för generering av dynamiska kemiska landskap genom fotolys inom mikrofluidiska och millifluidiska uppställningar presenteras. Denna metod är lämplig att studera olika biologiska processer, inklusive motile beteende, näringsupptag, eller anpassning till kemikalier av mikroorganismer, både på encellig och befolkningsnivå.
Abstract
Vi visar en metod för generering av kontrollerade, dynamiska kemiska pulser – där lokaliserade kemoattractant plötsligt blir tillgänglig på mikroskala – för att skapa mikromiljöer för mikrobiella chemotaxisexperiment. För att skapa kemiska pulser utvecklade vi ett system för att införa aminosyrakällor nästan omedelbart genom fotolys av buraminosyror i en polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidisk kammare som innehåller en bakteriell suspension. Vi tillämpade denna metod på chemotactic bakterien, Vibrio ordalii, som aktivt kan klättra dessa dynamiska kemiska gradienter samtidigt spåras av videomikroskopi. Aminosyror, som återges biologiskt inert (“bur”) genom kemisk modifiering med en fotoflyttbar skyddsgrupp, är jämnt närvarande i suspensionen men inte tillgängliga för konsumtion fram till deras plötsliga utsläpp, som sker vid användardefinierade punkter i tid och rum med hjälp av en nästan UV-A fokuserad LED-balk. Antalet molekyler som frigörs i pulsen kan bestämmas av ett kalibreringsförhållande mellan exponeringstid och uncaging fraktion, där absorptionsspektrumet efter fotolys kännetecknas av användning av UV-Vis spektroskopi. Ett nanoporöst polykarbonatmembran (PCTE) kan integreras i den mikrofluidiska enheten för att möjliggöra kontinuerlig borttagning genom flöde av uncaged föreningar och de förbrukade medierna. Ett starkt, irreversibel bindning mellan PCTE-membranet och PDMS mikrofluidisk struktur uppnås genom beläggning av membranet med en lösning på 3-aminopropyltrietoxysilane (APTES) följt av plasmaaktivering av ytorna som ska bindas. Ett datorstyrt system kan generera användardefinierade pulssekvenser på olika platser och med olika intensiteter, för att skapa resurslandskap med föreskrivna rumsliga och tidsmässiga variationer. I varje kemiskt landskap kan dynamiken i bakterierörelsen i individskala och deras ackumulering på populationsnivå erhållas, vilket möjliggör kvantifiering av kemotaktiskprestanda och dess effekter på bakterieaggregeringar i ekologiskt relevanta miljöer.
Introduction
Mikrober förlitar sig på chemotaxis, processen att upptäcka kemiska gradienter och ändra motilitet som svar1,att navigera kemiska landskap, närma sig näringskällor och värdar, och undkomma skadliga ämnen. Dessa mikroskala processer bestämma makroskala kinetik av interaktioner mellan mikrober och deras miljö2,3. De senaste framstegen inom mikrofluidik och mikrotillverkning teknik, inklusive mjuk litografi4,har revolutionerat vår förmåga att skapa kontrollerade mikromiljöer för att studera interaktioner av mikrober. Till exempel har tidigare experiment studerat bakteriell chemotaxis genom att generera mycket kontrollerade, stabila lutningar av mellanliggande till höga näringskoncentrationer5,6. I naturliga miljöer kan dock mikroskalakemiska gradienter vara kortlivade – skingras av molekylär diffusion – och bakgrundsförhållanden är ofta mycket utspädda7. För att direkt mäta chemotactic svar av mikrobiellpopulationer först utsätts för ostadiga kemiska miljöer, vi utarbetat och här beskriva metoder för att kombinera mikrofluidisk teknik med fotolys, vilket härmar gradienter som vilda bakterier möter i naturen.
Uncaging teknik sysselsätter ljuskänsliga sonder som funktionellt kapsla in biomolekyler i en inaktiv form. Bestrålning frigör burmolekylen, vilket möjliggör riktad störning av en biologisk process8. På grund av den snabba och exakta kontrollen av cellulär kemi som uncaging ger9, fotolys av bur föreningar har traditionellt använts av biologer, fysiologer och neuroforskare att studera aktivering av gener10, jon kanaler11, och nervceller12. På senare tid har forskare utnyttjat de betydande fördelarna med fotolys för att studera chemotaxis13, för att bestämma flagella växlingdynamiken hos enskilda bakterieceller utsätts för en stegvis kemoattractant stimulans14,15,och att undersöka motilitet mönster av enstaka spermieceller i tredimensionella (3D) lutningar16.
I vårt tillvägagångssätt genomför vi fotolys av bur aminosyror inom mikrofluidiska enheter för att studera beteendesvaret hos en bakteriepopulation till kontrollerade kemiska pulser, som blir nästan omedelbart tillgängliga genom photorelease. Användningen av ett mål med låg förstoring (4x) (NA = 0,13, fokusdjup som är cirka 40 μm) gör det möjligt att både observationen av befolkningsnivå aggregeringssvaret hos tusentals bakterier över ett stort synfält (3,2 mm x 3,2 mm) och mätning av rörelse på encellnivå. Vi presenterar två tillämpningar av denna metod: 1) frisättningen av en enda kemisk puls för att studera bakteriell ackumulering−avledning dynamik från enhetliga förhållanden, och 2i)frisättning av flera pulser för att karakterisera bakterieackumuleringdynamiken under tidsvarierande, rumsligt heterogena kemoattractant villkor. Denna metod har testats på de marina bakterierna Vibrio ordalii utför chemotaxis mot aminosyran glutamat17,men metoden är i stort sett tillämplig på olika kombinationer av arter och kemoattractants, liksom på biologiska processer bortom chemotaxis (t.ex. näringsupptag, antibiotikaexponering, kvorumavkänning). Detta tillvägagångssätt lovar att hjälpa belysa mikroorganismers ekologi och beteende i realistiska miljöer och att avslöja de dolda kompromisser som enskilda bakterier står inför när de navigerar efemära dynamiska gradienter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod gör det möjligt för forskare att studera bakteriell chemotaxis under kontrollerade, dynamiska gradienter i mikro- och millifluidiska enheter, vilket möjliggör reproducerbara datainsamling. Den nästan ögonblickliga skapandet av kemiska pulser på mikroskala genom fotolys syftar till att reproducera de typer av näringspulser som bakterier möter i naturen från en rad källor, till exempel diffusive spridning av plymer bakom sjunkande marina partiklar25,eller näringsämne spride…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar den första mikrotillverkning anläggningen på ETH Zürich. Detta arbete stöddes av en australisk Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (till D.R.B.), en Gordon och Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (till RS), och en Swiss National Science Foundation bidrag 1-002745-000 (till R.S.).
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
