Summary

Generera kontrollerade, dynamiska kemiska landskap för att studera mikrobiell beteende

Published: January 31, 2020
doi:

Summary

Ett protokoll för generering av dynamiska kemiska landskap genom fotolys inom mikrofluidiska och millifluidiska uppställningar presenteras. Denna metod är lämplig att studera olika biologiska processer, inklusive motile beteende, näringsupptag, eller anpassning till kemikalier av mikroorganismer, både på encellig och befolkningsnivå.

Abstract

Vi visar en metod för generering av kontrollerade, dynamiska kemiska pulser – där lokaliserade kemoattractant plötsligt blir tillgänglig på mikroskala – för att skapa mikromiljöer för mikrobiella chemotaxisexperiment. För att skapa kemiska pulser utvecklade vi ett system för att införa aminosyrakällor nästan omedelbart genom fotolys av buraminosyror i en polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidisk kammare som innehåller en bakteriell suspension. Vi tillämpade denna metod på chemotactic bakterien, Vibrio ordalii, som aktivt kan klättra dessa dynamiska kemiska gradienter samtidigt spåras av videomikroskopi. Aminosyror, som återges biologiskt inert (“bur”) genom kemisk modifiering med en fotoflyttbar skyddsgrupp, är jämnt närvarande i suspensionen men inte tillgängliga för konsumtion fram till deras plötsliga utsläpp, som sker vid användardefinierade punkter i tid och rum med hjälp av en nästan UV-A fokuserad LED-balk. Antalet molekyler som frigörs i pulsen kan bestämmas av ett kalibreringsförhållande mellan exponeringstid och uncaging fraktion, där absorptionsspektrumet efter fotolys kännetecknas av användning av UV-Vis spektroskopi. Ett nanoporöst polykarbonatmembran (PCTE) kan integreras i den mikrofluidiska enheten för att möjliggöra kontinuerlig borttagning genom flöde av uncaged föreningar och de förbrukade medierna. Ett starkt, irreversibel bindning mellan PCTE-membranet och PDMS mikrofluidisk struktur uppnås genom beläggning av membranet med en lösning på 3-aminopropyltrietoxysilane (APTES) följt av plasmaaktivering av ytorna som ska bindas. Ett datorstyrt system kan generera användardefinierade pulssekvenser på olika platser och med olika intensiteter, för att skapa resurslandskap med föreskrivna rumsliga och tidsmässiga variationer. I varje kemiskt landskap kan dynamiken i bakterierörelsen i individskala och deras ackumulering på populationsnivå erhållas, vilket möjliggör kvantifiering av kemotaktiskprestanda och dess effekter på bakterieaggregeringar i ekologiskt relevanta miljöer.

Introduction

Mikrober förlitar sig på chemotaxis, processen att upptäcka kemiska gradienter och ändra motilitet som svar1,att navigera kemiska landskap, närma sig näringskällor och värdar, och undkomma skadliga ämnen. Dessa mikroskala processer bestämma makroskala kinetik av interaktioner mellan mikrober och deras miljö2,3. De senaste framstegen inom mikrofluidik och mikrotillverkning teknik, inklusive mjuk litografi4,har revolutionerat vår förmåga att skapa kontrollerade mikromiljöer för att studera interaktioner av mikrober. Till exempel har tidigare experiment studerat bakteriell chemotaxis genom att generera mycket kontrollerade, stabila lutningar av mellanliggande till höga näringskoncentrationer5,6. I naturliga miljöer kan dock mikroskalakemiska gradienter vara kortlivade – skingras av molekylär diffusion – och bakgrundsförhållanden är ofta mycket utspädda7. För att direkt mäta chemotactic svar av mikrobiellpopulationer först utsätts för ostadiga kemiska miljöer, vi utarbetat och här beskriva metoder för att kombinera mikrofluidisk teknik med fotolys, vilket härmar gradienter som vilda bakterier möter i naturen.

Uncaging teknik sysselsätter ljuskänsliga sonder som funktionellt kapsla in biomolekyler i en inaktiv form. Bestrålning frigör burmolekylen, vilket möjliggör riktad störning av en biologisk process8. På grund av den snabba och exakta kontrollen av cellulär kemi som uncaging ger9, fotolys av bur föreningar har traditionellt använts av biologer, fysiologer och neuroforskare att studera aktivering av gener10, jon kanaler11, och nervceller12. På senare tid har forskare utnyttjat de betydande fördelarna med fotolys för att studera chemotaxis13, för att bestämma flagella växlingdynamiken hos enskilda bakterieceller utsätts för en stegvis kemoattractant stimulans14,15,och att undersöka motilitet mönster av enstaka spermieceller i tredimensionella (3D) lutningar16.

I vårt tillvägagångssätt genomför vi fotolys av bur aminosyror inom mikrofluidiska enheter för att studera beteendesvaret hos en bakteriepopulation till kontrollerade kemiska pulser, som blir nästan omedelbart tillgängliga genom photorelease. Användningen av ett mål med låg förstoring (4x) (NA = 0,13, fokusdjup som är cirka 40 μm) gör det möjligt att både observationen av befolkningsnivå aggregeringssvaret hos tusentals bakterier över ett stort synfält (3,2 mm x 3,2 mm) och mätning av rörelse på encellnivå. Vi presenterar två tillämpningar av denna metod: 1) frisättningen av en enda kemisk puls för att studera bakteriell ackumulering−avledning dynamik från enhetliga förhållanden, och 2i)frisättning av flera pulser för att karakterisera bakterieackumuleringdynamiken under tidsvarierande, rumsligt heterogena kemoattractant villkor. Denna metod har testats på de marina bakterierna Vibrio ordalii utför chemotaxis mot aminosyran glutamat17,men metoden är i stort sett tillämplig på olika kombinationer av arter och kemoattractants, liksom på biologiska processer bortom chemotaxis (t.ex. näringsupptag, antibiotikaexponering, kvorumavkänning). Detta tillvägagångssätt lovar att hjälpa belysa mikroorganismers ekologi och beteende i realistiska miljöer och att avslöja de dolda kompromisser som enskilda bakterier står inför när de navigerar efemära dynamiska gradienter.

Protocol

1. Tillverkning av mikrofluidisk enhet för Single Chemical-pulse Experiment Designa kanalen med hjälp av datorstödd design (CAD) programvara och skriv ut den på en genomskinlighetfilm för att skapa fotomask(figur 1A). Tillverka befälhavaren genom mjuk litografi (under renrumsförhållanden). Rengör en kisel wafer (4 inches) i snabb följd med aceton, metanol och isopropanol, torka sedan med kväve. Grädda wafer i ugnen vid 130 °C i 5 min….

Representative Results

Vi använde mikrofluidiska och millifluidiska enheter (figur 1) för att studera bakteriella ackumuleringsprofiler under dynamiska näringsförhållanden. Bakteriella banor extraherades från inspelade videor som förvärvats genom faskontrastmikroskopi av ackumuleringsavledningdynamiken hos en bakteriepopulation efter en kemisk puls som släpptes av fotolys (figur 2 och figur 3). Genom att i genomsnitt miljontals banor, spatiotempo…

Discussion

Denna metod gör det möjligt för forskare att studera bakteriell chemotaxis under kontrollerade, dynamiska gradienter i mikro- och millifluidiska enheter, vilket möjliggör reproducerbara datainsamling. Den nästan ögonblickliga skapandet av kemiska pulser på mikroskala genom fotolys syftar till att reproducera de typer av näringspulser som bakterier möter i naturen från en rad källor, till exempel diffusive spridning av plymer bakom sjunkande marina partiklar25,eller näringsämne spride…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna tackar den första mikrotillverkning anläggningen på ETH Zürich. Detta arbete stöddes av en australisk Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (till D.R.B.), en Gordon och Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (till RS), och en Swiss National Science Foundation bidrag 1-002745-000 (till R.S.).

Materials

(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich A3648 >98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube Greiner Bio-One 210261 50 ml
Centrifuge Eppendorf 5424R to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line VWR-CH 390-0384 to bake 3D master
Duster VWR-CH 16650-22 to clean the wafer and microchannels
Hot plate VWR-CH 444-0601 to bond the microchannels
Isopropanol Sigma-Aldrich W292907
LightSafe micro centrifuge tubes Sigma-Aldrich Z688312 1.5 ml
MATLAB Mathworks for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube Eppendorf 30120086 1.5 ml
Microscope glass slide VWR-CH 631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE Nikon Instruments MEA53100 with motorized stage
MNI-Glutamate Tocris Bioscience 1490 >98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment Stratasys Objet30 3D printer
Mold printing service 3D Printing Studios Custom https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W to calibrate the uncaging
NIS Elements Nikon Instruments Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line VWR-CH 466-3516 to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050 MicroChem Corp. SU8-3050
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1 to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane Sterlitech PCT0447100 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing Scientific Commodities BB31695-PE/2 I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish VWR-CH 25373-100 bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale VWR-CH 611-2605 to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla Oxford Instruments for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt Instant Ocean Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015 Dassault Systemes SolidWorks Used to design the mold
Spectra X light engine Lumencolor for LED 395 nm
Sylgard 184 Dow Corning 110-41-155 PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok) B Braun Omnifix 4616308F
Syringe Needle Agani A228 from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite Harvard Apparatus 70-4506 Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey Stratasys Dual Syringe Pump
Vortex-Genie Scientific Industries SI-0236 Mold Material

References

  1. Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
  3. Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
  4. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  5. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  6. Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
  7. Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  8. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
  9. Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
  10. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
  13. Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
  14. Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
  15. Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
  16. Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
  17. Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
  18. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
  19. ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
  20. Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
  21. Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
  22. Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
  23. Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
  24. . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
  25. Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
  26. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  27. Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
  28. Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
  29. Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
  30. Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).

Play Video

Cite This Article
Carrara, F., Brumley, D. R., Hein, A. M., Yawata, Y., Salek, M. M., Lee, K. S., Sliwerska, E., Levin, S. A., Stocker, R. Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior. J. Vis. Exp. (155), e60589, doi:10.3791/60589 (2020).

View Video